全 文 ：Efectoftotalflavonoidsoflitseacoreanalevelonhepatic
fibrosisandexpresionofTGF-β1 , CTGFmRNAinliver
ZhuPengli, LiJun, ZhangLei, etal
(SchoolofPharmacy, AnhuiMedicalUniversity, Hefei　230032)
Abstract　Objective　Toinvestigatetheanti-hepaticfibrosisefectandpartlymechanismsoftotalflavonoidsoflit-
seacoreanalevel(TFLC)inratswithhepaticfibrosis.Methods　SDratsrandomlydividedintosixgroups[ (the
normal, themodel, theTFLC(100, 200, 400mg/kg)andthecolchicin(0.1 mg/kg)groups] .Themodelofhe-
paticfibrosiswasinducedbyinjecting50%CCl4(1 ml/kg)twiceweeklyfor12weeks.Fromthe7thweek, althe
therapeuticgroupsweretreatedwiththeTFLC(100, 200, 400 mg/kg)andthecolchicin(0.1mg/kg)respectively
for6weeks.Atthe12ndweek, thelevelsofALT, AST, HA, LN, CⅣ andPⅢNPinserumweremeasured.HE
stainingwasusedtoevaluatethedegreeofhepaticfibrosis.ThemRNAexpressionofTGF-β1 andCTGFinlivertis-
sueweredetectedbyRT-PCR.Results　TFLC(200, 400mg/kg)notonlyreducethelevelsofALT, AST, HA, LN,
CⅣ andPⅢNPinserumsignificantly, andthedegreeofhepaticfibrosis, butalsodecreasedthemRNAexpression
ofTGF-β1 andCTGFinlivertissuesobviously.Conclusion　TFLChasanti-hepaticfibrosisefect, whichmightbe
associatedwithinhibitingtheTGF-β1 andCTGFmRNAexpressionoflivertissuesinhepaticfibrosisrats.
MeSH　transforminggrowthfactorbeta
Freewords　hepaticfibrosis;totalflavonoidsoflitseacoreanalevel;connectivetissuegrowthfactor
豹皮樟总黄酮对酒精性脂肪肝
大鼠脂质过氧化及 TNF-α生成的影响
刘洪峰 ,李　俊 ,胡成穆 ,王　焱
摘要　目的　研究豹皮樟总黄酮(TFLC)对酒精性脂肪肝大
鼠的保护作用及其机制。方法　喂食乙醇 、蔗糖混合液体食
料制备大鼠酒精性脂肪肝模型。给药组在第 6周末给予不
同剂量的豹皮樟总黄酮或凯西莱共给药 6周 。于实验第 12
周末处死大鼠 , 测定血清天门冬氨基转移酶(AST)、丙氨酸
氨基转移酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平 , 肝组织
超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物
酶(GSH-PX)含量及肝组织 TNF-αmRNA的表达情况 , 取肝
组织作病理学检查。结果　TFLC能降低模型大鼠 ALT、
AST、MDA、TNF-α含量 , 提高 SOD、GSH-PX含量 , 肝组织
TNF-αmRNA表达下降。同时病理学显示TFLC能明显减轻
肝的病理损伤程度 , 表现为 TFLC干预后大鼠肝细胞脂肪变
及炎症程度减轻。结论　TFLC能可明显减轻酒精性脂肪肝
2009-02-16接收
基金项目:安徽省科技攻关计划(编号:06013134B);安徽省自然科
学研究重点资助项目(编号:2006KL095A)
作者单位:安徽医科大学药学院 ,合肥　230032
作者简介:刘洪峰 ,男 ,硕士研究生;
李　俊 ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,责任作者 , E-mail:li-
jun@ahmu.edu.cn
大鼠肝组织脂肪变和炎症程度 , 减轻脂质过氧化 , 并能显著
降低血清 TNF-α水平 ,减少肝组织 TNF-αmRNA表达 , 该作
用可能是其有效防治酒精性脂肪肝作用机制之一。
主题词　肿瘤坏死因子-α;脂质过氧化作用;脂肪肝 ,酒精性
自由词　豹皮樟总黄酮
中图分类号　R575.5;R282.71;R34
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2009)02-0236-05
　　酒精性脂肪肝是酒精性肝病的早期阶段 ,其发
展为肝硬化的危险性比单纯脂肪肝高 [ 1] 。其发病
机制未完全阐明 ,尚缺乏有效的治疗药物 ,豹皮樟系
樟科木姜子属 ,又称老鹰茶。经我院天然药物化学
教研室确定其有效部位为总黄酮 。前期研究表明豹
皮獐总黄酮(totalflavonoidsoflitseacoreana, TFLC)
对非酒精性脂肪肝有防治作用[ 2] , 为进一步揭示
TFLC对酒精性脂肪肝大鼠的保护作用机制 ,本研究
通过观察其对酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂质过氧化损
伤和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响 ,探讨
TFLC防治酒精性脂肪肝作用机制 。
·236· 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Apr;44(2)
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　主要药物与试剂　TFLC由安徽医科大学药
学院研制 ,总黄酮含量 >70%;凯西莱购自河南省新
谊药业股份有限公司;无水乙醇为国产分析纯;白砂
糖市售;天门冬氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移
酶(ALT)、超氧化物岐化酶(SOD)、MDA(丙二醛
(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、考马斯亮
蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;
TNF-α测定为晶美公司 ELISA试剂盒;TRIzol购自
Invitrogen公司;逆转录试剂盒购自 Promega公司;
PCR试剂盒购自 Fermentas公司;PCR引物由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成 。
1.1.2　主要仪器　低温高速离心机(Eppendorf公
司 ), PCR扩增仪 (Eppendorf公司), 电子天平
FA2004(上海精天天平厂),酶标仪 MK3(合肥科隆
公司)
1.1.3　实验动物　SD大鼠 70只 , ♂♀兼用 ,体重
200g±20 g,由安徽医科大学动物中心提供 ,普通
级 。
1.2　方法
1.2.1　模型制备与给药方法　随机分为 7组(每组
10只):正常组 、酒精组 、高糖组 、TFLC组(100、200、
400mg/kg)和凯西莱阳性对照组(60 mg/kg)。动
物模型参照文献 [ 3]报道制备 ,酒精组大鼠先随意
饮用 15%的蔗糖溶液 3 d,然后加入 5%的乙醇 ,每
隔 4 d增加 5%,直至 15%,然后再每周增加 5%直
至终浓度为 40%。维持大鼠饮用 40%乙醇直至 12
周 。实验第 6周末 TFLC组和凯西莱阳性对照组大
鼠在继续饮用 40%乙醇溶液的同时 ,每天灌服相应
药物 ,时间为 6周。高糖组自由饮用含 15%糖水 。
正常组大鼠则自由饮水 ,所有大鼠均给予普通饲料 。
时间为 12周 。
1.2.2　标本采取　第 12周末 ,所有大鼠禁食禁水
一晚 ,第 2天上午称量体重 ,麻醉 ,股动脉放血 ,离心
后取血清测生化指标 。取肝脏相同部位 ,常规制备
肝匀浆 ,并行组织病理学检查。
1.2.3　生化指标的测定　血清 ALT、AST,肝匀浆
SOD、MDA、GSH-PX含量的检测按试剂盒说明书操
作 。ELISA法测定血清中 TNF-α含量 ,其方法严格
按照试剂盒说明书操作。
1.2.4　RT-PCR测定 TNF-αmRNA的表达　参照
TRIzol说明书 ,提取肝组织的总 RNA,用分光光度
计测 RNA样本的浓度和纯度 。参照 RT-PCR说明
书逆转录 cDNA20 μl。PCR扩增 25μl体系:cDNA
1 μl, dNTP2.5μl, PCRbufer2.5μl, MgCl2 1.5μl,
TaqE1 μl, TNF-α上下游引物各 0.5 μl, ddH2O
15.5 μl。反应条件:94℃ 5 min, 94℃ 30 s、54℃ 30
s、72℃ 30s30个循环 , 72℃ 10 min。 TNF-α上游引
物为 5′-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′,下游引物为
5′-GGCAGCCTTGTCCCTTGA-3′,扩增产物 312 bp。
β-actin:反应条件:94℃ 5 min, 94℃ 40 s、51℃ 40
s, 72℃ 1min35个循环 , 72℃ 10 min。 β-actin上游
引物为 5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′,
下游引物为 5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3′,扩
增产物 350 bp。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离
并染色后 ,用 QuantityOne软件分析结果 ,测定 TNF-
α与 β -actin扩增条带灰度的比值。
1.2.5　肝组织病理形态学检查　取肝组织块 , 10%
福尔马林固定 ,石蜡包埋切片 , HE染色 ,在光镜下
观察肝脂肪变性和炎症活动情况 。标准参考中华医
学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组所制定
的酒精性肝病标准 [ 4] 。
1.3　统计学处理　检测结果以 x±s表示 ,用 SPSS
13.0软件进行数据分析 ,各组间比较用 t检验 ,多组
间比较用方差分析 。
2　结果
2.1　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠血清 AST、ALT
水平的影响　见表 1。酒精组血清 AST、ALT活性
高于高糖组和正常组 ,差异有显著性 ,而正常组与高
糖组之间无明显差异 。凯西莱组 、TFLC(200、400
mg/kg)能明显降低大鼠血清 AST;凯西莱组 、TFLC
(200 mg/kg)还能明显降低大鼠血清 ALT含量 ,差
异具有显著性 。
表 1　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠血清
AST、ALT水平的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) AST(U/L) ALT(U/L)
正常 - 96.51±10.28 32.38±3.95
高糖 - 104.86±17.85 39.38±8.29
酒精 - 147.91±14.89＊＊ 62.85±7.85＊＊
TFLC 100 139.05±10.67 56.18±9.56
200 120.52±14.02## 44.86±8.00#
400 127.92±21.05# 53.79±8.22
凯西莱 60 112.13±10.08## 40.17±9.21##
与正常组比较:＊＊P<0.01;与酒精组比较:#P<0.05, ##P<0.01
2.2　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠肝匀浆 MDA、
·237·安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Apr;44(2)
SOD、GSH-PX水平的影响　见表 2。酒精组肝匀
浆 SOD、GSH-PX活性低于高糖组和正常组 ,差异有
显著性 ,而正常组与高糖组之间无明显差异 。而酒
精组肝匀浆 MDA活性高于高糖组和正常组 ,差异
有显著性 ,而正常组与高糖组之间无明显差异 。凯
西莱组 、TFLC组(200、400mg/kg)能明显降低 MDA
水平 ,并且还可以显著提高 SOD、GSH-PX的活性 。
表 2　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠肝匀浆 MDA、
SOD、GSH-PX水平的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg)
SOD
(U/mgprot)
MDA
(U/gprot)
GSH-PX
(g/gprot)
正常 - 41.79±7.10 4.73±0.74 9.32±2.10
高糖 - 38.47±5.18 5.21±0.71 8.49±1.96
酒精 - 31.03±6.77＊＊ 6.33±1.37＊＊ 5.37±1.70＊＊
TFLC 100 34.97±3.25 6.07±0.60 6.01±1.40
200 38.18±3.80## 5.54±0.71# 7.02±1.31##
400 40.41±8.18## 5.15±0.47## 7.25±1.05##
凯西莱 60 40.74±9.17## 5.12±0.61## 7.49±0.75##
与正常组比较:＊＊P<0.01;与酒精组比较:#P<0.05, ##P<0.01
2.3　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠血清 TNF-α的影
响　见表 3。酒精组血清 TNF-α活性高于高糖组和
正常组 ,差异有显著性 ,而正常组与高糖组之间无明
显差异 。凯西莱组 、TFLC组能明显降低升高的
TNF-α水平。
表 3　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) TNF-α(ng/L)
正常 — 40.98±7.77
高糖 — 42.99±10.0
酒精 — 81.89±8.24＊＊
TFLC 100 74.02±8.56#
200 65.87±7.55##
400 59.75±11.57##
凯西莱 60 63.52±8.99##
与正常组比较:＊＊P<0.01;与酒精组比较:#P<0.05, ##P<0.01
2.4　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠肝组织 TNF-α
mRNA表达的影响　肝组织 TNF-αmRNART-PCR
琼脂糖凝胶电泳图见图 1。图 2示:酒精组肝组织
TNF-αmRNA表达显著升高 ,经 TFLC(400 mg/kg)
及凯西莱干预治疗后 , TNF-αmRNA表达明显降低。
2.5　肝脏病理学观察　见图 3。酒精组:肝小叶内
出现大量脂肪变性 ,汇管区伴有炎细胞浸润以及部
分点状肝细胞坏死 。高糖组:肝小叶内出现少量脂
肪变性 ,汇管区伴有很少量炎细胞浸润。正常组:肝
小叶内无脂肪变性 、炎症和坏死。各用药组能够明
显减轻肝脏脂肪变性和炎症 。
图 1　RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图
　　1:正常组;2:酒精组;3:高糖组;4:400 mg/kgTFLC组;5:凯西莱
组;M:DNAMarker;TNF-α:312bp;β-actin:350bp
图 2　TFLC对酒精性脂肪肝大鼠 TNF-αmRNA表达的影响
　　1:正常组;2:酒精组;3:高糖组;4:400mg/kgTFLC组 ;5:凯西莱
组。与正常组比较:＊＊P<0.01;与模型组比较:##P<0.01
3　讨论
　　本实验采用乙醇糖水混合饮料喂养的方法复制
大鼠酒精性脂肪肝模型 。病理组织学提示有大量的
肝组织脂肪变性 ,伴有局部的炎症与坏死。并且血
清 AST、ALT、MDA含量升高 ,肝组织 SOD、GSH-PX
含量降低 。实验结果与临床酒精性脂肪肝的病理及
生化改变接近 ,表明酒精性脂肪肝模型成立 。
　　ALT和 AST是反映肝细胞损害的常用的酶学
检查指标 。ALT主要分布于细胞质 ,而 AST主要分
布于细胞质和线粒体 ,是一种线粒体酶 ,极易受到酒
精的影响 [ 5] ,这可能与乙醇易造成线粒体肿胀 、损
伤 ,使大量存在于线粒体中的AST进入周围循环系
·238· 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Apr;44(2)
图 3　TFLC对大鼠肝脏组织病理学的影
响　HE×200
　　A:正常组;B:高糖组;C:酒精组;D:
高剂量组;E:凯西莱组
统有关 ,因此酒精性脂肪肝引起 AST升高往往比较
明显。因此转氨酶是肝细胞损害的敏感标志 , 也是
乙醇所致肝损害最敏感的指标 。反映肝细胞坏死的
程度 ,其严重程度直接关系到酒精性肝病的发展与
转归 [ 6] 。本实验结果 TFLC能明显降低血中 ALT、
AST活性 ,表明 TFLC对酒精性脂肪肝大鼠肝细胞
有明显的保护作用。
目前普遍认为乙醇及其代谢产物对肝脏的损伤
以及通过影响免疫因素 、氧化应激等在发病过程中
发挥着重要作用 。正常状态下 ,机体主要依靠 SOD
和 GSH-PX清除机体正常代谢产生的自由基 ,使机
体免受伤害 ,此时毒性氧的产生和自由基解毒系统
的作用保持平衡 。长期大量饮酒使肝脏中 SOD及
GSH-PX的活性明显降低 ,结果造成肝内促氧化物
增多和抗氧化物减少 ,产生氧化应激和膜磷脂的过
氧化 ,引起肝内 ATP耗竭和谷胱甘肽水平下降 ,肝
细胞功能障碍 ,脂质储积 ,且对炎性因子如 TNF-α
的敏感性大大增加 [ 7] 。本研究发现:酒精性脂肪肝
模型组大鼠肝组织中 MDA含量较正常组大鼠显著
升高 , SOD、GSH-PX含量较正常组显著降低 ,表明
大量乙醇的摄入 ,使机体 MDA增加 , SOD、GSH-PX
活性降低 ,直接导致自由基在体内蓄积 ,过量自由基
可与生物膜中多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反
应 ,产生大量脂质过氧化物 MDA,破坏生物膜的正
常结构和功能 ,造成肝细胞损伤 。而 TFLC能显著
降低大鼠肝组织 MDA含量 ,增强 SOD活性 ,增加肝
脏 GSH-PX含量 。提示 TFLC防治大鼠酒精性脂肪
肝形成的机制可能与其减轻脂质过氧化损伤有关。
　　本实验发现 TFLC能够影响酒精性脂肪肝发病
中的 TNF-α等炎症介质。 TNF-α是酒精性脂肪肝
发病过程中的一种重要的炎症介质 ,主要由肝实质
细胞和肝内 Kupfer细胞分泌 ,可以诱导肝细胞凋
亡 ,也可以导致肝细胞坏死 ,是造成肝细胞损伤的主
要因子[ 8] 。 TNF-α可直接引起肝细胞脂肪变性 、炎
症及肝细胞坏死 ,还可通过增强自由基的产生和脂
质过氧化等方面促进脂肪性肝炎的发生 [ 9] (如 MDA
可作用于核因子 NF-κB,结果使 TNF-α基因表达 、
释放增加)。研究发现[ 10-11]乙醇可以促使早期生
长反应蛋白-1与 TNF-α结合 ,也会引起 TNF-α水平
升高 。因此 , TNF-α在 ALD的发生发展过程中起着
重要作用。应用 TNF-α抑制剂降低 TNF-α水平可
减轻酒精性肝损伤 [ 12-13] 。
　　TFLC是一种具有多种生物活性的黄酮类化合
物 ,近年来发现它有多种新用途和多种生物效应如
抗氧化 、调节脂质代谢 、抗炎免疫等 [ 14] 。本研究发
现大鼠在大量持续性的酒精作用下发生肝脂肪变
时 ,肝组织 TNF-αmRNA表达及血清 TNF-α的水平
已有显著增高 ,提示 TNF-α等细胞因子的协同作用
并经氧化应激 /脂质过氧化的参与放大其效应 ,共同
导致了酒精性肝损害的发生 。在 TFLC干预后 ,应
用 ELISA及 RT-PCR检测大鼠血清及肝组织内
TNF-α含量 ,表明 TFLC可以减少酒精性脂肪肝病
程中 TNF-α的合成与释放。
　　综上所述:TFLC对酒精性脂肪肝有一定的保护
作用 ,其机制可能与 TFLC减轻脂质过氧化损伤和
降低血清 TNF-α水平及减少肝组织 TNF-αmRNA
表达有关 。
·239·安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Apr;44(2)
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LiuHongfeng, LiJun, HuChengmu, etal
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Abstract　Objective　Toinvestigatetheprotectionefectanditsmechanismsoftotalflavonoidsoflitseacoreana
(TFLC)inratswithalcoholicfatyliver.Methods　Theratsofthemodelgroupwerefedwiththemixtureofetha-
nolandsugar.TheratsofTFLCgroupandtioproningroupwereadministratedwithrelateddoseofmedicinebythe
endofthe6thweek.Alratsweresacrificedbytheendofthe12thweek.TheserumAST, ALT, TNF-αandhepat-
icSOD, MDA, GSH-PXandTNF-αexpressioninlivertissueweremeasuredrespectively.Hepatichistopathology
wasobservedbymicroscope.Results　LevelsofALT, AST, MDA, TNF-αdecreasedsignificantlyinadministration
ofTFLC, meanwhliletheactivityofSOD, GSH-PXwereenhanced, TNF-αexpressionwerelower.TFLCcansignif-
icantlyaleviatethesymptomsinthealcoholichepatopathyratsincludingsteatosis, immunecelinfiltration.Conclu-
sion　TFLCcansignificantlyamelioratefatydegenerationandinflammationofhepatocytesdecreaselipidperoxida-
tionandcanmarkedlyreducethelevelsofTNF-αinserum, livertissueTNF-αmRNAexpressionwerelower.This
mayserveasoneoftheefectivemechanismsthroughwhichTFLCeficientlypreventsalcoholicfatyliver.
MeSH　tumornercrisisfactor-alpha;lipidperoxidationuse;fatyliver, alcoholic
Freeword　totalflavonoidsoflitseacoreana
·240· 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Apr;44(2)