全 文 ：首 都 医 药
CAPITALMEDICINE
2007.9
摘要 目的 利用 RP-HPLC法对山
橿药材进行指纹图谱进行了研究,为科
学评价与有效控制山橿药材质量提供新
方法。方法 采用 AgilentHC-C18色谱柱
(150mm×4.6mm,5μm),以甲醇-水(60%
～100%)线形梯度洗脱,体积流量 1.0mL/
min,柱温 30℃,在 296nm波长下进行检
测,记录 55min的色谱图。测定 10批药
材的色谱图,建立山橿的指纹图谱。结果
山橿药材有 11个共有峰,多数峰可以
达到较好的分离,方法学考察表明该方
法具有较好的精密度、重复性和稳定性,
各色谱图相对保留时间RSD小于0.50%,
相对峰面积符合指纹图谱要求。结论 建
立的共有指纹图谱检测标准可以作为山
橿质量评价的和品种鉴别的重要依据。
关键词 山橿 高效液相色谱法
指纹图谱 梯度洗脱法
山 橿 Lindera.reflexaHemsl系 樟 科
Lauaceae山胡椒属植物山橿的干燥根,
本品收载于 《河南省中药材标准》(1993
年版)[1]。该药在清代《植物名实图考》中
曾有论述,为灌木或小乔木,生于山坡路
边、林缘或灌木丛中,河南信阳地区分布最
广泛,且产量丰富,是山橿的主要产地[2]。
山橿药材性温、味辛,具有行气止痛、健
脾消积、活血消肿等作用。根据近年来的
研究,山橿中主要的化学成分有挥发油、
黄酮类、生物碱、芪类、植物有机酸及植
物甾醇类等,其中含量较高的是二氢黄
酮类化合物球松素(pinostrobin)、生松素
(pinocembrin)及挥发油。大多数天然药物
在生长过程中化学成分容易受环境的影
响,山橿也同样。该实验利用 RP-HPLC
色谱法较系统的研究建立山橿药材的特
征性色谱指纹图谱,以完善其质量控制
标准,保证了药材的质量及疗效。
1.仪器、试剂与药材
1.1仪器
日 本 Shimadzu高 效 液 相 色 谱 仪
(SIL-20A自 动 进 样 器 ,LC-20AT泵
SPD-20A紫外检测器,CTO-10ASVPCE
柱温箱);ShimadzuLCSolution色谱工作
站;KQ-250E型医用超声波清洗仪(昆山
市超声仪器有限公司);MetlerAG135电
子 天 平 (瑞 士 );Dikma微 孔 滤 膜
(0.45μm)。
1.2试剂
甲醇为色谱醇 (江苏国达公司);甲
醇分析醇(开封化学试剂总厂);水为重
蒸去离子水(自制),并经 0.45μm水系滤
膜滤过。
1.3药材
山橿样品来源于河南新县田铺向阳
(背阳)山坡、新县江淮岭生态园向阳(背
阳)山坡、新县金兰山、新县背冲山、新县
香山、商城、信阳浉河港、信阳鸡公山等
地方,经信阳市药检所鉴定。将样品药材
自然干燥后,粉碎成粗粉备用。
2.方法与结果
2.1色谱条件
河南羚锐制药股份有限公司(465550) 熊维政
河南中医学院(450008) 申桂芬
河南羚锐制药股份有限公司(465550) 潘永峰
河南中医学院(450008) 王浴铭
山木 药材HPLC指纹图谱研究
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2.3观察周期
共治疗 4周,两组病人均在治疗前
和第四周末分别进行评价计分。
2.4疗效标准
参照 1993卫生部 “中药新药治疗失
眠的临床研究指导原则”中关于失眠的疗
效判定标准。临床痊愈:睡眠时间恢复正
常或夜间睡眠时间在 6h以上,睡眠深沉,
醒后精神充沛;显效:睡眠明显好转,睡眠
时间增加 3h以上,睡眠深度增加;有效:
症状减轻,睡眠时间较前增加不足 3h;无
效:治疗后失眠无改善或反加重者。
2.5统计方法
计量资料采用 t检验,分类资料采
用 Ridit检验。
3.结果
3.1两组患者治疗前后 PSQI评定结
果见附表 1,两组 PSQI各成分得分及总
分治疗后比治疗前显著下降 (P<0.01),
治疗组低于对照组(P<0.05)。
3.2两组患者治疗前后 SDS,SERS
评定结果见附表 2,两组 SDS,SERS评
分治疗后均比治疗前显著下降 (P<
0.01),治疗后 SDS,SERS评分治疗组明
显低于对照组(P<0.05)。
3.3两组患者临床疗效比较见附表
3。两组患者临床总有效率无显著差异,
显愈率治疗组明显高于对照组(P<0.05)。
4.讨论
该研究显示针刺百会、四神聪对伴
有抑郁障碍的失眠具有治疗作用,治疗
组总体临床疗效与佐匹克隆组无明显差
异,但显愈率高于佐匹克隆组;两组临床
睡眠质量总体评定各项指标针刺组均优
于佐匹克隆组。针刺法组副作用小于西
药佐匹克隆组。可见针刺百会、四神聪具
有很好的镇静催眠和抗抑郁作用,适用
于伴有抑郁障碍的失眠症,值得在临床
上推广应用。
(20070716收稿)
药品检验
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首 都 医 药
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2007.9
AgilentHC-C18色 谱 柱 (150mm×
4.6mm,5μm),甲醇-水(60%～100%)线
形梯度洗脱,柱温 30℃,体积流量 1.0mL
/min, 检 测 波 长 296nm, 洗 脱 时 间
70min,进样量 10μL。
2.2供试品溶液的制备
取本品粉末(过 20目筛),精密称取
1.0g,置于 100ml具塞三角瓶中,精密加
入甲醇 50ml称重,超声提取 1h,用溶剂
补足失重,滤过,取续滤液 25ml置 50ml
量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,微
孔滤膜滤过(0.45μm),即得供试液。
2.3HPLC分析
取样品溶液 10μL,注入高效液相色
谱仪,记录 55min内色谱峰及其保留时
间和峰面积。
2.4方法学考察
为了考察分析方法的可靠性,以新
县江淮岭向阳山坡(2006年 3月采集)药
材为例,对仪器精密度、稳定性、重复性
作相应考察。
2.4.1精密度试验:取同一份供试品
溶液,连续进样 6次,结果表明各色谱峰
的相对保留时间 RSD为 0.03%～0.38%之
间,相对峰面积比值的 RSD为 0.24%～
2.54%,表明仪器精密度良好。
2.4.2重复性试验:取同一产地供试
品 6份,按照供试品的制备和检测方法
制备供试品并分别进行检测,各色谱峰
的相对保留时间 RSD为 0.05%～0.32%,
相 对 峰 面 积 比 值 的 RSD为 0.40%～
2.85%,结果表明重复性良好。
2.4.3稳定性试验:取同一份供试品
溶液,分别在 0h、3h、6h、12h、24h、48h不
同时间点进行检测,各色谱峰的相对保
留时间 RSD为 0.02%～0.43%,相对峰面
积比值的 RSD为 0.32%～2.73%,表明至
少在 48h内供试品溶液成分的稳定。
2.5药材色谱指纹图谱的建立
2.5.1指纹图谱的采集:按照供试品
制备方法制备各山橿药材的样品溶液,
以《中药注射剂图谱研究的技术要求(暂
行)》建立山橿药材的 HPLC/DAD指纹
图谱。通过记录 100min图谱,可以看到
55min后再无色谱峰出现,从而确定指纹
图谱的采集时间为 55min。取样品溶液依
次进样,记录各批次的 HPLC色谱图。
2.5.2参照峰的选择:通过比较色谱
图,可知各样品色谱图中 2、5、7、8号峰
为强信号峰,选取色谱图中峰面积相对
较大、较稳定的 5号峰为参照峰(S峰),
将其作为内参比峰。以参照峰的保留时
间和峰面积作为 1,分别计算各共有峰的
相对保留时间和相对峰面积比值。结果
表明,不同批次的药材共有峰相对保留
时间 RSD均小于 0.50%,而相对峰面积
比值的RSD较大。由此可知,本实验建立
的色谱方法可以使不同批次的山橿药材
具有基本一致的色谱行为,但药材之间
各种化学成分的含量受多种因素的影响
具有较大差异。
2.5.3共有指纹峰的标定:采用国家
药典委员会推荐的 《中药色谱指纹图谱
相似度评价系统 A版》软件对指纹图谱
的相关参数进行自动匹配,标定其中匹
配数目为 10的 11个色谱峰为共有指纹
峰,10批次山橿药材的共有峰面积和占
总峰面积均大于 93%,选择新县江淮岭
生态园向阳山坡的山橿药材 HPLC/
DAD图谱为参照图谱,以中位数法作为
对照指纹图谱的生成方法,设定时间宽
度为 0.20min,提取山橿药材的共有模式
建立的对照指纹图谱。
2.5.4非共有峰面积:通过对 10批山
橿药材供试品的测定,统计各批非共峰
面积比,其结果为非共有峰面积百分比
在 2%～7%之间,符合指纹图谱研究规定
小于 10%的检测要求。
2.5.5相似度评价:依据共有指纹峰
的标定结果,进行相似度计算。10批次山
橿药材与对照指纹图谱的相似度结果均
大于 0.97,表明个批次药材之间具有良
好的一致性,本方法可用于综合评价药
材的整体质量。
3.讨论
3.1该实验比较了不同提取溶剂如
95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、
75%甲醇、50%甲醇、水的水浴回流提取、
超声提取等提取方法的提取效果,以甲
醇提取的总体效果为佳;同时还考察了
以甲醇为溶剂,不同时间(30、60、90min)
的提取效果。结果表明,以甲醇超声提取
60min提取较完全,且方法稳定、重现性
好。50%乙醇和 50%甲醇提取出来溶液
的各峰面积均较小,水提取出的成分太
少且含量很低不能表达山橿药材中的不
同成分。
3.2采用二极管阵列检测器对指纹
图谱的检测波长进行了选择,从 190～
400nm内选择出 290、294、296nm,在这三
个检测波长下 HPLC色谱峰的分离度较
好、总峰面积较大,进一步比较各波长下
的图谱,发现检测波长为 296nm时色谱
图所包含的信息量最大,且色谱峰的总
峰面积最高。
3.3在流动相系统的选择中,分别以
乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水-
0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-
水、乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸等不同体积
分数、不同比例的流动相系统进行等度
和梯度洗脱试验。结果表明,用甲醇-水
进行梯度洗脱为佳,在调整好流动相的
不同时间洗脱比例之后,各峰的保留时
间适中,且基线较平稳,不易漂移,有利
于指纹图谱的分析。
3.4该研究方法建立的指纹图谱可
快速鉴别区分不同来源的山橿药材,通
过指纹图谱对山橿药材进行综合宏观分
析,有利于促进山橿药材及其制剂研制
水平和质量控制的全面提高。只有保证
山橿药材的质量才能确保制备出疗效较
好稳定的药品。该研究仅收集了部分产
地的山橿药材,如能收集更多,采用不同
的分析方法获取更多的化学信息,并以
代表临床药效的药理实验研究进行验
证,则对山橿的质量评价会更加完善和
科学。
参考文献
1河南省卫生厅编.河南省中药材标准.
一九九三年版(二).河南:中原农民出版
社,1994,10
2丁宝章,王遂义,高增义主编.河南植物
志.河南:河南人民出版社,1981,544
(20070723收稿)
药品检验
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