全 文 ：第18卷第19期 中国现代医学杂志 Vol. 18 No.19
2008年10月 China Journal of Modern Medicine Oct. 2008
研究表明，许多肿瘤重要的发病机制之一是细
胞凋亡的减少或受到抑制，肿瘤细胞通过下调凋亡
相关基因，从而赋予肿瘤恶性增殖的特点，通过诱导
分化增加肿瘤细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的生长和
发展，已成为目前研究治疗肿瘤的新策略[1～9]。维甲
酸（retinoic acid，RA）是维生素A的衍生物, 具有
诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用[2，6]。目前RA与抗
肿瘤中草药联合用药诱导肝癌细胞凋亡的报道尚
少。本文利用 RA 与抗肿瘤中草药人参皂甙单体
-Rh2（Ginsenoside-Rh2，GS-Rh2）和半边旗二萜类
化合物5F（pteris semipinnata L.PSL）联合用药，以
增强RA诱导肝癌细胞凋亡活性，提高肝癌细胞凋
文章编号： 1005-8982（2008）19-2788-04
·论著·
维甲酸与人参皂甙-Rh2或半边旗二萜类化合物
5F协同诱导肝癌细胞凋亡的研究
蔡康荣，蔡 春
（广东医学院 分析中心，广东 湛江 524023）
摘要：目的 观察维甲酸与人参皂甙-Rh2或半边旗二萜类化合物5F协同诱导肝癌细胞凋亡及对Fas蛋
白表达的影响。方法 体外培养肝癌细胞，设RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、 A+5F 3个实验组和对照组，分
别收集其药物作用24和48h后的培养细胞，应用流式细胞仪（FCM）检测肝癌细胞的凋亡率及Fas蛋白的表
达。结果 肝癌细胞药物作用48h时，RA+GS-Rh2组、 A+5F组与RA组或GS-Rh2组或5F组比较凋亡细
胞数和Fas蛋白的表达有显著增高(Р<0.05), 但在24h时，RA+ GS-Rh2组、RA+5F组与RA组比较“亚G1
峰”差异无显著性（Р>0.05）。结论 维甲酸与人参皂甙-Rh2或半边旗二萜类化合物5F协同作用可以增强
诱导肝癌细胞凋亡，促进Fas蛋白的表达。
关键词： 肝癌细胞；维甲酸；人参皂甙-Rh2；半边旗；细胞凋亡；Fas蛋白
中图分类号：R735.7 文献标识码：A
Studies on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells
induced by retinoic acid and ginsenoside-Rh2 or 5F from
pteris semipinnata L
CAI Kang-rong, CAI Chun
(Analytic Center of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong 524023, P.R.China)
Abstract:【Objective】To observe the apoptosis of Hepatocellular carcinoma cells induced by Retinoic acid( RA)
and Ginsenoside-Rh2 (GS-Rh2) GS-Rh2、5F、or 5F from Pteris semipinnata L(5F) and to be the influence of the ex－
pression of Fas. 【Methods】To establish RA, RA and GS-Rh2, RA and 5F groups and control groups. Hepatocellu－
lar carcinoma cells were treated with RA, RA and GS-Rh2, RA and 5F for 24 h and 48 h. The apoptosis and the
expression of Fas in Hepatocellular carcinoma cells were detected by Flow cytometry (FCM). 【Results】 Obvious
apoptotic cells and expression of Fas were found when Hepatocellular carcinoma cells were treated with the RA and
GS-Rh2, RA and 5F for 48 h than in the RA(P <0.01). No obvious apoptotic cell of sub-G1 were found in 24 h(P >
0.05). 【Conclusion】These results suggested that RA and GS-Rh2 or RA and 5F could enhance the apoptosis and
expression of fas of Hepatocellular carcinoma cells.
Key words: hepatocellular carcinoma cell; retinoic acid; ginsenoside-Rh2; pteris semipinnata L; apoptosis; fas
protein
收稿日期：2008-03-16
2788· ·
组别 时间
细胞周期(%)
G1 S G2 亚G1
对照
24h 57.2±4 5 26.5±3 7 16.3±2 6 1.7±0.4
48h 58.4±4 8 25.0±3 8 16.6±2 5 2.1±0.5
RA
24h 65.0±4 91） 21.1±3.51） 13.9±2.31） 5.5±1.31）
48h 67.2±5 11） 20.3± .41） 12.5±2.11） 6.4±1.51）
GS-Rh2
24h 63.1±4 2 22.7±3 6 14.2±2 4 3.8±1.11）
48h 65.1±4 71） 21.4±3.51） 13.5±2.21） 4.6±1.21）
5F
24h 64.0± 5 22.4±3 5 13.6±2 5 4.3±1.21）
48h 66.2±4 61） 21.1±3.31） 12.7±2.01） 5.0±1.41）
RA+GS-
Rh2
24h 68.4±5 31） 19.2±3.21） 12.4±1.71） 6.7±2.11）
48h 75.0± 91）2）15.5±2.81）2）9.5±1.31）2）11.5±2.31）2）
RA+5F
24h 69.2±5 71） 19.3±2.71） 11.5±1.51） 7.2± .21）
48h 76.5± 01）2）14.2± .41）2）9.3±1.31）2）12.2± .11）2）
亡，达到抑制肝癌细胞的生长，为肝癌病人提供有效
治疗的新途经。
1 材料与方法
1.1 标本
BEL-7402细胞株由中国科学院上海细胞生物
学研究所提供。
1.2 试剂及仪器
RA购自Sigma公司，GS-Rh2购自中国科学院
生物制品研究所，半边旗二萜类化合物5F为本院
生化研究所惠赠，RPMI－1640 培养基 （Gibco 公
司），碘化丙啶（PI）、RNase A（Sigma 公司），An-
nexin V-FITC （美国 BV 公司），Fas Mcab（IgG1）
（美国EA公司），CO2培养箱（日立公司产品）,流式
细胞仪（FCM）（EPICS XL型，美国Coulter公司）。
1.3 肝癌细胞培养
BEL-7402细胞接种于含10%小牛血清pH 7.4
的RPMI-1640培养基中，置37℃、5%二氧化碳培养
箱中培养，每隔48h换培养液，至指数生长期进行
实验。
1.4 采用噻唑蓝比色分析法（MTT）检测细胞增殖
抑制率
取对数生长期细胞，接种于 96 孔板，每孔
100μL培养液含5000个细胞，培养24ｈ后，实验
组 分 别 加 入 含 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、
RA+5F 不同浓度的培养液 50μL，对照组加入
50μL培养液，每组设４个平行孔。用药后继续培
养 24 和 48 h，每孔加入20μL MTT（5mg/mL），
37℃孵育 ４ ｈ。吸弃培养液，每孔加入 100μL
DMSO，避光振荡混匀，待结晶完全溶解后，用酶标仪
测定Ａ540光吸收值（重复３次）。按下列公式计算
肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（%）＝
（１－实验组Ａ540值／对照组Ａ540值）×100%。
1.5 FCM检测细胞周期和凋亡细胞
采用MTT法观察药物抑制试验，选取对肝癌细
胞具有 50%抑制率的 RA 浓度为 10μmol/L；
GS-Rh2 浓度为 80μg/mL；5F 浓度为 40μg/mL；
RA+GS-Rh2 浓度为 5μmol/L+40μg/mL；RA+5F 浓
度为5μmol/L+20μg/mL作为实验药物浓度。设5
个实验组：RA 组、GS-Rh2 组、5F 组、RA+GS-Rh2
组、RA+5F组。分别收集其作用24h、48h后凋亡细
胞明显的培养细胞，同时，设未用药的肝癌细胞为空
白对照组，离心清洗2次，70%冷乙醇固定，4℃保
存，检测时离心弃乙醇，制成单细胞悬液，用流式细胞
仪测定：①碘化丙啶（PI）染色（含 PI 50μg/mL、
RNase A 1μg/mL），检测“亚G1峰”细胞；细胞周
期分析用MultiCycle软件处理，亚二倍体细胞峰（亚
G1峰）的量代表细胞凋亡数量。②Annexin V-FITC
法检测早期凋亡细胞比例。
1.6 FCM检测Fas蛋白的表达
分 别 收 集 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、
RA+5F作用24和48h后和对照的培养细胞，离心
清洗 2 次，调整其细胞数达 1×106个 /mL，吸取
100μL细胞悬液，加入10μL Fas-FITC的抗体，用
同型IgG1-FTIC抗体作阴性对照，用流式细胞仪测
定F s蛋白表达率。
1.7 统计学处理
所有数据均使用SPSS 8.0统计软件进行分析，
多个样本均数的比较采用单因素方差分析，实验组
与对照组的两两比较采用LSD分析。
2 结果
2.1 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、 A+5F作用
不同时间对肝癌细胞凋亡的影响
FCM检测发现，肝癌细胞药物作用后“亚G1
峰”即凋亡峰，较对照组显著增多。对照组、RA组、
GS-Rh2 组、5F 组、RA+GS-Rh2 组、RA+5F 组“亚
G1峰”，24h分别为（1.7±0.4）%、（3.8±1.1）%、
（4.3±1.2）%、(5.5±1.3)%、（6.7±2.1）%、（7.2%±
第19期 蔡康荣，等：维甲酸与人参皂甙-Rh2或半边旗二萜类化合物5F协同诱导肝癌细胞凋亡的研究
表1 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、 A+5F作用不同时
间对肝癌细胞周期和凋亡的影响 （x±s，n=10）
注：1）与对照组相同时间比较，Р<0.05；
2）与RA或GS-Rh2或5F组48h比较，Р<0.05
2789· ·
表2 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、 A+5F
作用不同时间对肝癌细胞早期凋亡和
Fas蛋白表达的影响（x±s，n=10）
注：1）与对照组比较，Р<0.05；
2）与RA或GS-Rh2或5F组相同时间比较，Р<0.05
2.2）%；48h 分别为 （2.1±0.5）%、（4.6±1.2）%、
（5.0±1.4）%、（6.4±1.5）%、（11.5±2.3）%、（12.2±
2.1）%。48h时RA+ GS-Rh2组、RA+5F组与RA组
或GS-Rh2组或5F组比较“亚G1峰”显著增多（P
<0.05）；24h时RA+ GS-Rh2组、RA+5F组与RA组
比较“亚G1峰”差异无显著性（P>0.05）。而细胞周
期，RA组、RA+GS-Rh2组、RA+5F组G1期细胞数逐
渐增多，S期、 G2期细胞数则减少，在 48h 时，
RA+GS-Rh2组、RA+5F组与RA组比较G1期细胞
显著增多，S期、G2期细胞明显减少（P<0.05）。但
联合用药组之间相同时间比较则差异无显著性（P
>0.05）。见表1。
2.2 RA、GS-Rh2、5F、RA+GS-Rh2、 A+5F 作
用不同时间对肝癌细胞早期凋亡和Fas蛋白表达
的影响
从表2可见，早期凋亡细胞比例24h出现最
高，随着时间增加48h凋亡细胞比例有所降低。Fas
蛋白表达率则相反，随着时间增加表达率逐渐增加。
实验组与对照组比较或联合用药RA+GS-Rh2组、
RA+5F组与RA组或GS-Rh2组或5F组比较肝癌
细胞早期凋亡和Fas蛋白表达差异均有显著性（P
<0.05）。
3 讨论
肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有极密切的
关系，许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋
亡而发挥治疗作用。凋亡与肿瘤防治的关系是近年
来的研究热点之一[3]。有研究表明，若细胞受刺激后
DNA损伤，用单细胞作琼脂糖凝胶电泳呈现典型的
彗星带（梯状条带），和FCM检测（亚G1峰）结果
相一致[6]，从而说明应用FCM检测（亚G1峰）面积
代表细胞凋亡率是准确的。国内外近年对单纯RA、
GS-Rh2、5F的抗肿瘤作用的报道很多，但诱导细胞
凋亡的百分率仍低 [1～10]。本实验结果可见，RA组、
GS-Rh2 组、5F 组、RA+GS-Rh2 组、RA+5F 组药物
作用对肝癌细胞周期改变和诱导细胞凋亡均有一定
的影响。通过FCM检测DNA含量分析，实验组药物
作用24和48h有明显“亚G1峰”面积的出现，而
联合用药组48h的“亚G1峰”面积比例更高，这是
细胞凋亡的特征性表现。同时，发现联合用药组细
胞，随药物作用时间延长，G1 期细胞逐渐增多，S
期、G2期细胞减少，由此可见在联合用药作用下诱
导阻滞于G1期时相的细胞比例增多，这可能肝癌
细胞凋亡与细胞周期阻滞有关，细胞阻滞于哪一期，
凋亡就发生在哪一期[4]，提示抗肿瘤中草药联合用药
具有明显的协同作用，可以增强抑制肝癌细胞的增
殖和促进诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡的早期改变之
一是质膜上磷脂分布的不对称性被破坏，使正常位
于细胞膜内层表面的磷脂酰丝氨酸（phos-
phatidylserine，PS）暴露在细胞膜外层表面，PS一旦
出现于细胞膜外层表面就很容易与Annexin V结合
而被标记[4]。本实验用Annexin V-FITC检测暴露在
凋亡细胞表面的PS，发现实验组比对照组Annexin
V-FITC的表达均增高，这说明早期凋亡细胞增多，
实验组24h细胞凋亡率最高，48h就有明显降低，
而联合用药比单纯RA作用，出现细胞凋亡更显著。
由此可见抗肿瘤中草药联合用药具有促进诱导癌细
胞凋亡的作用。
促进凋亡的基因Fas抗原，又称为CD95，是细胞
凋亡过程中重要的死亡信号传递分子，Fas主要以
膜受体形式存在。它的天然配体FasL属于杀伤性T
细胞效应分子，两者结合是体内Fas发挥作用的唯
一途径[5]。一般情况下，Fas/FasL系统在维持组织器
官、细胞内稳定上有重要地位，Fas功能过强或缺陷
均可导致病变发展[6]。淋巴细胞通过Fas、FasL介导
的癌细胞凋亡是机体的免疫监视作用的重要组成部
分，它们的表达异常可出现细胞凋亡障碍，使体内癌
细胞因逃避细胞毒性T细胞CTL的杀伤作用而大
量增殖，而细胞大量增殖正是肿瘤的发生机制，因此
中国现代医学杂志 第18卷
对照
24h 1.66±0.82 15.10±0 82
48h 2.10±2.41 15.50±2 41
RA
24h 10.10±2.121） 20.20± .121）
48h 6.40±1.711） 25.40±3.711）
GS-Rh2
24h 9.20±1.521） 18.60±2.501）
48h 4.30±1.411） 22.40±3.341）
5F
24h 9.70±1.651） 19.00±2.221）
48h 5.20±1.411） 23.50±3.611）
RA+GS-
Rh2
24h 16.70±1.361）2） 26.29± .361）2）
48h 11.10±2.121）2） 35.14±3.121）2）
RA+5F
24h 17.40±1.711）2） 27.30±2.711）2）
48h 10.10±2.121）2） 36.49±3.361）2）
Annexin V-FITC(%) Fas蛋白(%)组别 时间
2790· ·
（上接第2787页）
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肿瘤细胞获得逃避表达Fas的细胞凋亡成为肿瘤形
成的重要前提之一[7]。本实验结果显示，实验组随着
时间增加 Fas 蛋白表达率逐渐增加，联合用药
RA+GS-Rh2组、RA+5F组的Fas蛋白表达明显高于
RA组。这就说明联合用药可促使肝癌细胞中Fas蛋
白表达上升，可能为肝癌细胞自身的Fas和FasL交
联，通过顺式触发（cis-trigger）机制自杀，或直接激
活凋亡基因产物、诱导Fas分子所在的细胞凋亡。但
凋亡的调节机制非常复杂，Fas并非唯一的调控基
因，其表达强度并不一定会呈现出与细胞凋亡率平
行的正相关，Fas与肝癌的恶性程度有关，特别是分
化差的肝癌细胞，Fas的表达产物显著减少[8]。这一
变化表明 Fas的表达丧失是逃避细胞毒性（CTL）
和促进细胞存活的一个重要途径。综上所述，联合
用药对肝癌细胞的抑制作用和促进肝癌细胞凋亡，
可能与Fas蛋白表达上调有密切的关系，促进凋亡
基因Fas蛋白的表达可作为体外培养的肝癌细胞增
殖或抑制状态的一项检测指标。
参 考 文 献：
[1] 戴 滨,崔 燎,吴 铁,等.半边旗提取物5F抗肿瘤作用的实验
研究[J].四川中医,2006,24(2):10.
[1] DAI B, CUI L, WU T, et al. Experimental Research on the
function of anti - Cancer in the abstracts of pteris Semipinnata
L[J]. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine, 2006,
24(2): 10. Chinese
[2] 黄 炜,黄济群,张东方,等.全反式维甲酸18β-甘草次酸和甘草
酸诱导人肝癌细胞分化和凋亡的研究 [J]. 中西医结合肝病杂志,
2003,13(3):148-150.
[2] HUANG W, HUANG JQ, ZHANG DF, et al. Studies on differ-
entiation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells induced
by all-trans retinoic acid, 18β-glycyrrhetinic acid and gly-
cyrrhizin[J]. China Journal of Integrated Traditional and Western
Medicine on Liver Diseases, 2003, 13(3): 148-150. Chinese
[3] 姜 浩,樊光华.人参皂甙一Rh2对人肝癌Bel-7404细胞增殖和
凋亡的影响[J].中国肿瘤临床与康复,2004,11(4):289-292.
[3] JIANG H, FAN JH. Efficacy of ginsenoside-Rh2 on proliferation
and apoptosis for Bel-7404 cell line[J]. China Journal of Clinic
Oncology Rehabilitation, 2004, 11(4): 289-292. Chinese
[4] 罗 庆,宋关斌,秦 建,等.中药诱导肝癌细胞凋亡的研究进展[J].
重庆大学学报(自然科学版),2005,28(7):115-117.
[4] LUO Q, SONG GB,QIN J, et al. Progress of research on hepato-
cellular carcinoma cells apoptosis induced by Chinese traditional
medicine [J]. Journal of Chongqing Univcrsity (Natuml Scicncc
Edition), 2005, 28(7): 115-117. Chinese
[5] JIN Y, LI YC, SU ZL, et al. Expression of fas and fasl protein
in non-itodgkonis B cell lyuplurnas[J]. China Journal of Modern
Medicine, 2005, 15(11): 1632-1636. Chinese
[6] 王晨龙,杨 洁.三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡的作用研究[J].山
西医药杂志,2004,33(12):1046-1048.
[6] WANG CL, YANG J. Research on hepatocellular carcinoma cells
apoptosis induced by arsenic trioxide[J]. Shanxi Medical Journal,
2004, 33(12): 1046-1048. Chinese
[7] SHAO RX, OT SUKA M, KATO N, et al. Acyclic retinoid in-
hibit s hu2man hepatoma cell growt h by suppressing fibroblast
growt h factor2mediated signaling pat hway[J]. Gast roenterology,
2005, 128(1): 86295.
[8] 袁 彪,张金山,张远强,等.阿拉瑞林对GnRH受体阳性肝癌细胞
Fas／FasL基因表达的影响 [J]. 第三军医大学学报,2003,25(12):
1065-1068.
[8] YUAN B, ZHANG JS, ZHANG YQ, et al. Effect of alarelin on
fas／fasL gene expression in gonadotropin-releasing hormone re-
ceptor positive hepatocarcinoma cells[J]. Acta Academiae Medici-
nae Militaris Tertiae, 2003, 25(12): 1065-1068. Chinese
[9] 张 晖,孔 棣,吴咸中,等.人参皂甙Rh2致MCF-7/ADM凋亡的
实验研究[J].中国中西医结合外科杂,2007,13(3):261.
[9] ZHANG H, KONG D, WU XZ, et al. Apoptotic effects of gin-
senoside Rh2 on drug resistance human mammary adenocarcino-
ma MCF27/ ADM Cells[J]. CJITWM, February, 2007, 13(3) :261.
Chinese
[10] 张培华,罗少军,汤少明,等.半边旗5F 对瘢痕成纤维细胞增殖和
凋亡的影响[J].广东医学,2005,26(6):773.
[10] ZHANG PH, LUO SJ,TANG SM, et al. Effect of 5F from Pteris
semipinnata L on proliferation and apoptosis of scar fibroblasts
[J]. Guangdong Medical Journal, 2005, 26(6): 773. Chinese
（曾文军 编辑）
第19期 蔡康荣，等：维甲酸与人参皂甙-Rh2或半边旗二萜类化合物5F协同诱导肝癌细胞凋亡的研究
From the lab to the clinic [J]. Mol.Cancer Ther, 2004, 3:
373-381.
[9] BLUTT SE, MCDONNELL TJ, POLEK TC, et al. Calctriol in-
duced apoptosis in LNCaP cells is blocked by overexpression of
bcl-2[J]. Endocrinol, 2000, 141: 10-17.
[10] PARK WH, SEOL JG, KIM ES, et al. Induction of apoptosis
by vitamin D3 analogue EB1089 in NCI-H929 myeloma cells
via activation of caspase and MAP kinase[J]. Br J Haematology,
2000, 109: 576-583.
[11] SHIMIZU A, MASUDA Y. Apoptosis in progressive crecentic
glomerulonephritis[J]. Lab Investigation, 1996, 74(5): 941.
（曾文军 编辑）
2791· ·