全 文 ：作者单位:广东医学院附属医院眼科 , 湛江 524001
收稿日期:2001-12-30
·实验研究·
半边旗二萜类化合物 5F对人翼状胬肉
成纤维细胞增殖的抑制作用
王映芬　陈毓东
　　 [关键词] 翼状胬肉;成纤维细胞;半边旗;增殖;抑制
　　 [摘　要] 目的　观察中药半边旗二萜类化合物 5F 对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞 (
human pterygium fibroblasts , HPF)增殖的影响。方法　用噻唑蓝比色法 (MTT)观察不同浓度梯度
(4 、 8 、 16 、 32 、 64 、 128μg/ml)的 5F在不同作用时间内 (24 、 48 、 72 、 96小时)对HPF 增殖的
抑制作用 。结果　用药 24小时浓度 16μg/ml开始明显抑制 (P <0.05);48小时 8μg/ml抑制作用
更强 (P<0.01);50%抑制率 (IC50)浓度 32μg/ml。同一浓度各时间组抑制率 (IR)与对照组
比较 , 在 4μg/ml作用 24 、 48及 72小时 IR与对照组比较差异均无显著性 (P >0.05), 持续作用
96小时差异有显著性 (P <0.01);16μg/ml以上 24 ～ 96小时各时间组 IR与对照组比较差异均有
显著性 (P<0.01)。结论　体外培养 HPF 具较强增殖能力 , 5F 对 HPE的增殖具明显抑制作用 ,
并与用药剂量和持续时间有相关性 。
　　中图分类号:R285.5;R777.33　文献标识码:A　文章编号:1002-4379(2002)02-0074-05
The inhibitive effect of diterpenoid compound 5F of Pteris semipinnata L on human pterygium fi-
broblasts　WANGYingfen , CHEN Yudong.Department of Ophthalmology , Affiliated Hospitol of Guangdong
Medical College , Zhanjiang 524001 , China
[ Key words] pterygium;fibroblasts;Pteris semipinnata L;proliferation;inhibition
[ Abstract] OBJECTIVE　To observe the effect of diterpenoid compound 5F of Pteris semipinnata L on
the proliferation of cultured human pterygium fibroblasts (HPF ).METHODS　Colorimetry MTT was used
to detect viability of 5F in different concentration(4 , 8 , 16 , 32 , 64 and 128μg/ml)at different time (24 ,
48 , 72 , 96 hours)for inhabitation of proliferation of HPF.RESULTS　There was obvious inhibitory effects
of 5F on HPFs in the concentration of 16μg/ml for 24h (P<0.05), and was more evident in the concentra-
tion of 8μg/ml for 48h(P <0.01)compared with control group.The 50%inhibitory concentration (IC50)of
5Fwas 32μg/ml.There was no significant differences in the inhibiting rates of HPFs between control group and
experimental group at the concentration of 4μg/ml for 24 , 28 and 72 hours(P>0.05).There was significant
difference at 96 hours (P<0.01).There existed significant differences in the concentration of 16μg/ml or
more from 24 hour to 96 hours compared with control groups (P<0.01).CONCLUSION　Cultured HPFs
appeared to be obvious proliferative activity.There was a remarkable inhibitory effect of 5F on HPFs , and this
effect showed a relativity with time-dependent and dose-dependent.
　　近年对成纤维细胞 (FB)的基础研究推
动临床各学科对增生异常相关疾病的认识 , 如
眼科 Graves 病 、 PVR 、 PDR等 , FB 是发病主
要因素之一 。有报道半边旗中提取的化合物如
5F 、 6F 、 A 、 PSE等在体外可抑制多种人癌细
胞的生长 , 如肺癌 、鼻咽癌及人早幼粒白血病
HL-60 等均具细胞毒性〔1〕 , 提示其对增殖活
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DOI :10.13444/j.cnki.zgzyykzz.001056
跃的细胞有抑制作用 。我们从 2000年 2月 ～ 9
月观测了半边旗乙醇抽提二萜类化合物 5F 对
体外培养翼状胬肉FB (HPF)增殖的影响 , 以
评价 5F在异常增殖性眼病的防治价值 。
1　材料和方法
仪器:CO2 培养箱 , 倒置相差显微镜 , 自
动酶标测定仪。
药物和试剂:半边旗二萜类化合物 5F
(广东医学院生化研究所惠赠), DMEM 培养
液 , 新生小牛血清 (FBS , 杭州四季青生物工
程公司), 四甲基偶氮唑 (MTT)。5F结晶溶于
二甲基亚砜 (DMSO), 终浓度为 4 、 8 、 16 、
32 、 64 、 128μg/ml , DMSO终浓度小于1%。
组织:我科 2001 年 3 月手术切除翼状胬
肉标本 11例 , 均无局部特殊用药史 。患者为
32 岁 ～ 50 岁 , 男 2 例 , 女 9 例 , 病史 1 ～ 5
年。
药物对 HPF 抑制:HPF 于培养板孵育 、
贴壁 , 换上含 5F 各浓度梯度 15%FBS DMEM ,
设药液终浓度每 ml分别含 4 、 8 、 16 、 32 、 64 、
128μg 的 B 、 C 、 D 、 E 、 F 、 G用药组 , 不加药
物培养液为空白对照 A 组 。24 、 48 、 72 、 96
小时后按 MTT 比色法于酶标仪测吸光值 A 。
按下式计算抑制率 (IR)。
净抑制率 IR=
(1-细胞用药组 A值-空白药物组 A值细胞对照组 A值-空白对照组 A值)×100%
统计学处理:医学统计软件 SPSS8.0。多
个样本均数与对照组比较用单因素方差分析 ,
多个实验组两两比较用最小显著差法。
2　结果
2.1　HPF 细胞形态变化
对照组:镜下正常存活 HPF 生长增殖旺
盛 、密集 , 束状排列 , 连接成片 , 胞晕清 , 形
态规则 , 梭形为主 , 胞体饱满 , 扁平而长突
起 。HE染色胞质色淡 , 核大 , 卵圆形 (图 1
～图 3)。用药组:5F 低浓度 B 、 C 组细胞形
态无改变;用药浓度渐高的 D 、 E 、 F 、 G 组活
细胞数量渐减少 , 胞体缩小 , 形态不规则 , 胞
间隔宽 , 失去贴壁生长特征 , 甚至收缩 、 悬浮
成团块状 。HE染色:细胞碎片状坏死 , 胞膜
不完整 、核破碎 (图 4 ～图 14)。
2.2　MTT法检测结果
加入不同浓度梯度的药物 5F 作用 HPF
后 , 于 96孔板中见颜色呈梯度改变 , 检测仪
测定吸光值 A 及由此计算其对 HPF 增殖抑制
率 IP (表1)。
经统计学处理 , 同一时间组内不同浓度
5F对 HPF 增殖抑制作用各异 。用药 24小时内
D组开始抑制 (P <0.05);48 小时低浓度 B
组对细胞增殖几乎无影响 (P>0.05);C 组抑
制作用弱 , IR 仅 10.4%, 但有统计学意义
(P<0.01);用药浓度增加的 D 、 E 、 F 、G组 ,
对HPF 增殖抑制率明显增加 , 细胞生长受影
响 , 50%抑制率浓度为 32μg/ml;5F 浓度在
128μg/ml时 , 抑制率达 93.7%左右。同一作
用时间内用药各组两两比较差异有显著性 (P
<0.05)。72 和 96小时时间段中 , 5F 对 HPF
的抑制作用呈剂量依从性。
表 1　MTT 法检测不同浓度 5F作用不同时间对 HPF 增殖的影响 (x—±s , n=6)
分　组 24h
A (IR)
48h
A (IR)
72h
A (IR)
96h
A (IR)
A 533.8±25.7　　(-) 57.8±20.5b　　(-) 745.2±26.5c　(-) 834.5±18.9c　(-)
B 525.8±22.8ad (1.5±0.7) 552.2±19.6ad (2.8±0.1) 722.5±25.8cd (3.0±0.1) 806.5±20.0cf (3.4±0.5)
C 502.7±25.4ae (5.9±0.6) 508.8±17.6af (0.4±0.8) 642.8±26.7cf (13.7±0.9) 648.0±17.2cf (22.4±0.9)
D 475.8±25.4bf (10.9±1.0) 403.0±17.7cf (29.0±0.9) 505.5±21.5bf (32.2±1.5) 476.3±10.0af (42.9±1.1)
E 431.7±20.0cf (19.1±1.4) 297.3±12.6cf (47.6±1.3) 360.8±31.9cf (51.6±4.1) 271.5±21.4cf (67.5±2.5)
F 339.0±19.6cf (36.5±3.1) 110.5±6.7cf (80.5±1.1) 116.5±15.5cf (84.4±2.1) 93.2±18.4cf (88.8±2.3)
G 221.5±23.3cf (58.5±3.6) 36.2±12.0cf (93.7±2.0) 37.5±10.9cf (95.0±1.4) 15.3±7.6cf (98.2±0.9)
注:①A:空白对照组;B 、 C 、 D、 E 、 F、 G:用药组 5F 浓度分别为 4 、 8、 16 、 32 、 64 、 128μg/ml;②同一浓度组 , 不同时间与
空白对照组比较aP>0.05 , bP<0.05 , cP<0.01;③同一时间内 , 不同浓度组与空白对照组比较dP>0.05 , eP<0.05 , fP<0.01
·75·中国中医眼科杂志 2002年 5月第 12卷第 2期
对照组FB:图 1　原代 FB从组织块游出×40　图 2　传代 FB生长增殖旺盛×20　图 3　HE染色×400　图 4～ 图 7　用药C
组 , 8μg/ml 作用 48小时 , 倒置显微镜见细胞间隙增宽×20 (图 4), ×40(图 5), HE染色×200 (图 6), ×400(图 7).　
图 8～图 9　用药 E组 , 32μg/ml作用 48小时 , 倒置显微镜×20 (图 8), ×40 (图 9)　图 10～ 图 11　用药E组 , 32μg/ml作
用 48小时 , HE染色×200 (图 10), ×400 (图 11)　图 12～ 图 13　用药F 组 , 64μg/ml作用 48小时 , 倒置显微镜×20 (图
12), ×40 (图 13)　图 14　用药G 组 , 128μg/ml作用 48小时 , 倒置显微镜下 , 见细胞坏死 、 悬浮 、 聚集成团 , ×20
·76· 中国中医眼科杂志 2002年 5月第 12卷第 2期
　　同一用药浓度条件下 , 随用药时间延长 ,
HPF 抑制作用改变。5F 浓度 4μg/ml 的 B组 ,
作用 72 小时内与对照组比较差异无显著性
(P>0.05), 持续作用至 96小时显示差异有显
著性 (P<0.05);在 16μg/ml的 C组开始 , 作
用24小时起各时间组与对照组比较差异有极
显著性 (P <0.01);尤其 128μg/ml 的 G 组 ,
IR在 24 、 48 、 72 和 96 小时分别为 28.5%、
93.7%、 95.0%和 98.2%, 抑制作用存在明显
时间依从性 。同一用药浓度梯度各时间组 IR
从 48 小时起与 24 小时比较差异有极显著性
(P<0.01);但 48小时后两两比较差异无显著
性(P >0.05)。根据上述数据作图如下 (图 1 、
图2), 其中A为对照组 , B-G表示不同浓度
的5F。
图 1　MTT 法检测各浓度 5F不同时间对HPF的影响
图 2　不同浓度 5F作用 HPF不同时间的抑制率
3　讨论
有研究表明 , 眼部 FB 异常增殖在各种增
生性眼病中担任重要角色 , 如球后结缔组织中
FB增殖的 Graves眼病 、 各种原因致眼内纤维
组织过度增殖引起 PVR 、 PDR 、 抗青光眼术后
滤过口瘢痕增生致滤道阻塞 、 翼状胬肉的发展
及术后复发 、 角膜创伤后瘢痕形成等〔2～ 6〕 。
FB参与增殖膜的形成 、 发展 、 牵拉 , 是病变
主要细胞成分之一。翼状胬肉主要成分是异常
增生和变性的 FB , 与增生性疾病具共同细胞
成分。在实验性 PVR的第14天眼内增殖以 FB
为主 , 伴有不同程度增殖的纤维蛋白 、纤维团
块或膜状纤维组织 , 直接或间接作用加速 FB
增殖和迁徙〔7〕 。
随着研究不断深入 , 各种抑制 FB 增殖的
药物应运而生 , 如抗肿瘤 、 抗代谢药物 5-氟
尿嘧啶 (5-Fu)、 丝裂霉素C或皮质类固醇激
素 、细胞因子等 。但这类药物在临床眼部使用
未能广泛应用 。近年来有关抗免疫 、 坑增生 、
降酶的中草药 , 成为西药之外第二大类常用药
物 , 如丹参 、 莪术 、 血栓通等抑制眼部 FB增
殖的治疗已日渐备受重视〔8〕 。
本研究采用的半边旗中乙醇抽提物二萜类
化合物 5F , 即 C20H28O4 , 化学名为:11α-羟
基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸
(ent-11alpha-hydroxy -15-oxo-kaur-16-
en-19-oic acid), 简称 5F , 为白色针状结晶 ,
在多项实验中发现具广泛抗肿瘤生物学功能 ,
对正常淋巴细胞无毒作用〔9 ,10〕 。本实验结果发
现 , 5F 对体外培养 HPF 增殖具抑制作用。在
同一时间内 , 用药浓度低在 4 ～ 8μg/ml对 HPF
影响不大 (P >0.05), 只有作用较长时间才
显效 , 提示低浓度 5F 需持续用药;当药物浓
度增至 16 ～ 32μg/ml , 在较短时间便出现抗
HPF增殖效应 , 且随时间延长作用效果愈明
显;5F 浓度 64μg/ml 以上使细胞增殖能力 48
小时内明显下降 , 抑制率达 93.7%。其抑制
作用呈剂量和时间依赖型 , 换句话说 , 5F 能
有效地在 “时间” 和 “空间” 上抑制 HPF 增
殖 , 提高药物浓度 、延长药物作用时间可达到
防止增殖膜形成 、 抑制 FB 增生的目的 。结果
提示 5F 有可能成为一种防治眼部成纤维细胞
增生性疾病的有效药物 。
本实验直接用患者切除的翼状胬肉标本进
行体外研究 , 不易受其他细胞污染 , 适于研究
·77·中国中医眼科杂志 2002年 5月第 12卷第 2期
其细胞生长 、 分化及蛋白合成等形态和功能 ,
探讨其在增生性眼病中的作用 , 为筛选防治
FB增殖性眼病的有效药物的体外实验性治疗
提供新的研究手段。
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作者单位:1　灵石县人民医院眼科 , 山西 031300
2　灵石县中医院
收稿日期:2001-12-11
化坚二陈汤加减治疗小儿睑板腺囊肿
孙瑞琴1　孙树林2
　　 [关键词] 化坚二陈汤;睑板腺囊肿
　　中图分类号:R777.13　文献标识码:B　文章编号:1002-4379(2002)02-0078-01
　　中医称睑板腺囊肿为胞生痰核。本病多因脾失健
运 , 痰湿内生所致〔1〕。热敷方法对患儿较难配合 , 手
术治疗全麻家长又不愿接受。笔者从 1996 年至 2001
年用化坚二陈汤加减治疗的 68例患儿总结如下。
1　资料和方法
所有患儿均系家长发现眼皮内有小肿块 , 伴有食
欲差 , 便秘 , 脾气暴躁。 年龄最小 3 岁 , 最大 9 岁。
其中男 43例 , 女 25 例。单眼上睑患病者 52 例 , 双眼
上睑患病者 16 例。病程 15 ～ 30 天。处方:化坚二陈
汤加减。制半夏6g　陈皮6g　茯苓6g　白僵蚕6g　生
大黄3g　焦白术 10g　炙甘草 3g。用法:汤剂或研末
装胶囊服用。用量根据患儿年龄酌情。 汤剂为每日 1
剂 , 胶囊 2g/粒 , 每日 12g , 分 3 次服 。最少服 15 天 ,
最多 120天 , 平均 43 天。
2　结果
68例患儿经中药治疗全部精神好转 , 食欲增加 ,
大便正常 , 眼睑硬结消失。治愈天数最短 15 天 , 最长
120天 , 平均 43 天。
3　体会
中医认为眼胞属肉轮 , 在脏属脾。 按五行生克
论 , 治法须明生克之理 , 自然药到成功 , 治病先详根
源 , 然后对症加减。小儿脏器稚嫩 , 脾胃虚弱。脾失
健运者 , 可痰湿内生 , 阻止脉络 , 胞睑即生痰核 。二
陈汤为燥湿化痰之代表方剂。白僵蚕健脾化痰 、 软坚
散结。生大黄清泄阳明之火〔3〕。本方可用于不同年龄
的患儿 , 若服药配合不好 , 可延长服药时间。最终治
疗效果满意 , 家长也愿接受。
参考文献
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·78· 中国中医眼科杂志 2002年 5月第 12卷第 2期