全 文 ：　[ 收稿日期] 2005-07-08　　　[ 修回日期] 2005-09-19
[ 文章编号] 　1000-4718(2006)05-1024-04
半边旗提取物 5F诱导人翼状胬肉成
纤维细胞凋亡的研究
陈毓东1 , 　王映芬2 , 　陈建苏1 , 　李志杰1 , 　陈小琳3
(暨南大学 1第一临床学院眼科 、医学院眼科实验室 , 3医学院病理生理实验室 、机能实验室 , 广东 广州 510632;
2广东医学院附属医院眼科 , 广东 湛江 524001)
　　[ 摘　要] 　目的:观察中药半边旗二萜类化合提取物 5F 对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPFs)周期的影
响及 5F诱导细胞凋亡过程超微结构的变化 , 初步探讨 5F对 HPFs 作用的机制。方法:应用细胞培养技术 、流式细胞
术(FCM)分析 5F对 HPF作用不同时间其细胞周期及诱导凋亡的特征 ,电镜观测 HPFs超微结构改变。结果:5F浓度
32 mg/ L始诱导 HPFs 凋亡 ,随 5F作用时间延长细胞被抑制并由凋亡发展为坏死的形态结构改变。结论:在一定浓
度下 5F抑制 HPFs 增殖 ,诱导细胞凋亡 、坏死 ,提示 5F具潜在临床应用前景。
[ 关键词] 　翼状胬肉;成纤维细胞;细胞凋亡;中草药
　　[ 中图分类号] 　R363　　　　　[文献标识码] 　A
Effect of diterpenoid compound 5F of Peris semipinnata L on apoptosis of hu-
man pterygium body fibroblasts in vitro
CHEN Yu-dong1 , WANG Ying-fen2 , CHEN Jian-su1 , LI Zhi-jie1 , CHEN Xiao-lin3
(1Department of Ophthalmology , 3Department of Functional Experiments , Medical College of Jinan University , Guangzhou 510632 ,
China;2Departmen of Ophthalmology , Affiliated Hospital of Guangdong Medical College , Zhanjiang 524001 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To observe the effect of diterpenoid compound 5F of Pteris semipinnateL on apoptosis in cultured hu-
man pterygium body fibroblasts(HPFs).METHODS:Fibroblasts collected from human pterygium body were cultured in vitro with
5F at different time point.Transmission electron microscope(TEM)was used to observe the ultrastructure changes of the HPFs.The
changes of the cell cycle and apoptosis of HPFs were evaluated with flow cytometry(FCM).RESULTS:5F at the concentration of
32 mg/ L induced HPF apoptosis at various time points.CONCLUSION:5F induces HPFs apoptosis.Apoptotic cells are evolved
to necrosis with the prolongation of the time.These findings indicate that 5F has a potential clinical value.
　　[ KEY WORDS] 　Pterygium;Fibroblasts;Apoptosis;Drugs , Chinese herbal
　　细胞凋亡(cell apoptosis , CA)为生理性的 、主动
的 、非炎症性的形态学改变 。生化特征为染色质的
有控降解 ,DNA断裂成不连续的片段 ,有新蛋白质合
成。如果诱导凋亡的基因突变或缺失 , CA被抑制 ,
便可能发生肿瘤;相反 ,如果 CA过盛可能导致某些
退行性疾病或衰老[ 1] ,表明CA可为治疗增生性眼病
增添崭新的方法和内容。本实验以透射电子显微技
术和流式细胞术(FCM),检测中药半边旗二萜类化合
提取物 5F(简称 5F)诱导体外培养的人翼状胬肉成
纤维细胞(HPFs)凋亡 ,观察其形态结构 、生长增殖和
细胞周期的变化 ,初步探讨其作用机制及临床应用
前景 。
材　料　和　方　法
1　材料
　　仪器 、试剂:细胞孵育箱 ,荧光/光学显微镜 , J
EM-2000EX透射电子显微镜(日本),流式细胞仪 ,
半边旗二帖类化合提取物 5F。
2　方法
2.1 　人翼状胬肉成纤维细胞原代培养及分组　眼
科翼状胬肉手术切除新鲜标本(近期无局部特殊用
药史)于培养板进行体外孵育 、贴壁 ,传 3-6代。用
波形蛋白鉴定为成纤维细胞 ,用 HPFs 50%抑制率的
5F 浓度 32 mg/L处理HPFs[ 2] ,设阴性对照组(PBS 代
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替5F 作用 HPFs),每组各 3瓶 ,作用不同时间后收集
细胞 。实验重复 3次 。
2.2 　流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡　取生
长良好 HPFs ,调整细胞密度至 2×107cells/L ,接种于
200 mL 培养瓶中 ,收集其作用 12 、24 、36和 48 h后的
HPFs标本 ,分别加入 70%冰乙醇2 mL制备单细胞悬
液 ,与对照组上机检测。
2.3 　5F对 HPFs超微结构的影响　同 2.2处理及分
组 ,4%戊二醛固定 ,常规透射电镜标本制备 ,透射电
镜观察 、摄影。
3　统计学处理
　　所得数据均使用 SPSS 10.0统计软件分析 ,多个
样本均数比较用单因素方差分析 ,实验组与对照组
的两两比较采用 LSD分析 。
结　　果
1　5F作用不同时间对 HPFs凋亡的诱导和周期的
影响
　　FCM示在最初作用12 h出现“亚G1 峰” ,凋亡细
胞比例峰值为(17.20±1.25)%,而在 24 h后凋亡细
胞开始减少为(6.87±1.17)%;36-48 h后细胞碎片
增多 ,凋亡细胞与坏死细胞并存 ,凋亡率为 9.5%左
右(如图 1所示)。
　　加用 5F 早期 , HPFs处于 S 、G2/M 期的细胞增
多 ,随后阻滞于G1期的细胞渐增加 ,相应 S 、G2/M 期
两时相的细胞数量明显减少(表1 、图 2)。
Fig 1　Cell cycle changes in HPFs treated with 5F at a dose of 32 mg/L at various time points(A-E).A:control group;B:HPFs with 5F
for 12 h;C:for 24 h;D:for 36 h;E:for 48 h.
图 1　5F浓度为 32 mg/ L作用 HPFs不同时间的流式细胞术检测结果
表 1　5F作用不同时间对 HPFs周期的影响
Tab 1　The cell cycle changes of HPFs treated with 5F at various time points(%. x±s.n=9)
Group
Cell cycle
G1 S G2/M 亚G1
Control 70.78±1.44 9.62±1.08 19.60±1.77 —
HPFs with 5F for 12 h 54.30±3.37＊＊ 12.90±1.34＊ 34.13±3.48＊＊ 17.20±1.25＊＊
HPFs with 5F for 24 h 61.17±1.64＊＊ 15.60±3.26＊＊ 23.23±1.72＊ 6.87±1.17＊＊
HPFs with 5F for 36 h 66.90±3.10＊ 12.53±0.91＊ 20.60±2.25＊ 9.86±0.35＊＊
HPFs with 5F for 48 h 84.07±2.94＊＊ 1.70±2.07＊＊ 17.23±1.29＊ 9.37±0.55＊＊
　＊P>0.05 , ＊＊P<0.01 vs control group.
Fig 2 　The cell cycle changes of HPFs treated with 5F at various
time points.A:control group;B:HPFs with 5F for 12 h;
C:for 24 h;D:for 36 h;E:for 48 h.
图 2　5F作用不同时间对 HPFs周期的影响
2　5F作用不同时间后 HPFs的形态改变
　　倒置显微镜下观察 ,对照组 HPFs 多为长梭形 ,
胞体丰满 ,胞浆均匀 ,细胞核呈圆形 ,核仁清 ,可见核
分裂相 。透射电镜下见对照组 HPFs细胞为长梭形 ,
细胞膜表面结构完整 、微绒毛较多 ,细胞核形态多为
圆形或椭圆形 ,边界清 、核仁显著 ,常染色体为主 ,异
染色体位于细胞边缘部。胞质丰富 ,胞浆可见脂肪
内含物 、粗面内质网 、线粒体和少量溶酶体(图 3A)。
　　调节5F 浓度 32mg/L 作用于HPFs 12 h后 ,活跃
的HPFs几乎变为静止状态 ,异染色质明显多于常染
色质(图 3B);5F作用 12-24 h后 ,HPFs可见有凋亡
细胞 ,与坏死细胞同时或稍提前出现 ,提示 HPFs逐
·1025·
渐趋向衰竭:部分细胞开始出现胞膜不完整 ,或仅剩
少量胞质 ,胞核浓缩 ,染色质分布不均 、凝集成块状 ,
趋向边缘附着于核膜附近 ,随后胞质及其中的细胞
器空泡化 、萎缩 、减少(图 3C);继之 ,凋亡细胞散在出
现 ,部分HPFs核与胞质之间出现间隙 , 胞浆中细胞
器尚可见轮廓 ,其电子密度也逐渐增大(图3D);随着
5F 作用时间的延长 ,原有的细胞外形逐渐消失 , 细
胞崩解 , 出现大量细胞碎片。坏死的 HPFs形态各
异 ,主要是胞膜破碎 、表面结构破坏 ,胞核肿胀 ,染色
质丢失 ,线粒体 、内质网等均变性 、形成空泡 ,最后消
亡(图 3E)。
Fig 3　Ultrastructural changes of HPFs treated with 5F at various time points.A:control group(normal , ×5 000);B:HPFs with 5F for 12
h(quiescence , ×4 000);C:HPFs with 5F for 24 h(apoptosis , ×5 000);D:HPFs with 5F for 36 h(apoptosis , ×5 000);E:
HPFs with 5F for 48 h(necrosis , ×5 000).
图 3　5F作用于 HPFs不同时间的超微结构改变
讨　　论
　　凋亡和坏死是细胞生命过程的两种死亡机制。
研究表明 ,若细胞受刺激后DNA的损伤 ,以单细胞凝
胶电泳的慧星带(梯状电泳带)表现和流式细胞术
(FCM)检测结果一致[ 3] ,可见应用 FCM 是检查凋亡
细胞并与坏死细胞相区别的一简易方法 。Hu等[ 4]
发现人鼻粘膜成纤维细胞经丝裂霉素 C 作用 5min
即受抑制 ,在低浓度短时间作用产生低抑制率 ,用
FCM检测凋亡细胞的百分比在用药组明显高于对照
组 ,在 DNA荧光直方图上表现为 G1 峰前的低宽的
“亚二倍体峰”即凋亡峰 ,并得到凋亡细胞百分比。
同法检测 NIH3T3 成纤维细胞凋亡 ,认为其结果与
G1 、G2/M期密码改变从而抑制其有丝分裂有关[ 5] 。
　　我们以往实验已知 5F 抑制 HPFs增殖 ,且在一
定范围内呈线性回归关系[ 2] ,现通过FCM观察 ,调节
5F 浓度 32 mg/L作用于 HPFs 12 h 时凋亡细胞数达
17.2%,并出现“凋亡峰”的特征性表现 ,同时发现G1
期细胞百分数低于对照组 ,分析可能因 DNA分子凋
亡的细胞较G1 期细胞小 ,用 5F 早期诱导细胞 G1 期
凋亡 ,以致处于 G1期的细胞减少。随着用药时间的
延长 ,凋亡峰随 G1 期时相的停滞细胞的增加而降
低 ,继续作用 24-48 h ,HPFs凋亡明显减少 ,坏死细
胞增多 。阻滞于 G1期的细胞比例增多 ,抑制细胞从
G1期向S 期发展。本组 FCM检测结果表明 ,适当浓
度5F 作用于 HPFs对其增殖周期有影响 ,导致细胞
难以顺利进入下个细胞周期而无法完成有丝分裂的
过程 ,与Shyong 检测到前列腺癌 PC3细胞在用嗜铬
粒蛋白 A抗体后出现凋亡 ,S期 、G0/G1和G2/M期细
胞数改变相似[ 6] 。提示 5F 可抑制 HPFs增殖 ,诱导
其凋亡 。
　　最早对凋亡细胞形态学的特性描述是 Kerr ,包
括染色质浓缩 、膜皱缩 、空泡形成 、裂解成碎片并被
吞噬细胞清除的过程[ 7] 。最典型形态学改变是核内
DNA的裂解[ 5] ,一些濒临死亡的细胞内成分如线粒
体 、溶酶体 、蛋白酶体和自噬空泡等 ,表现出凋亡和
坏死并存的形态学特征性改变[ 8] 。本实验通过透射
电镜观察到 5F 作用 HPFs在 12-24 h后 ,部分细胞
开始出现胞膜不完整 、核浓缩 、染色体分布不均 ,随
后胞质及其细胞器空泡化 、萎缩 、减少 ,HPFs核与胞
质之间出现间隙 ,这与 Tomomi等[ 9] 用白三烯受体拮
抗剂 LTR-A作用于子宫内膜异位症的患者后 ,电镜
下见创面增殖的成纤维细胞大量出现凋亡的改变相
同 ,提示 5F 诱导的凋亡在胞核 、胞浆和胞膜等不同
区域均发生 。
　　晚近有研究表明 ,过度的外来刺激或自身的基
因突变高于一定的阈值时便诱导细胞凋亡 ,适当的
浓度时 ,不但凋亡的转导机制发生改变 ,而且坏死信
号也同时被激活启动[ 10] 。故 Wyllie 等[ 11]认为同样
的刺激可诱导凋亡和坏死。本组的超微结构结果显
示 ,5F对 HPFs的作用不但诱导细胞凋亡的一系列形
态学改变 ,而且与坏死并存;长时间的刺激 ,不但诱
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导HPFs凋亡 ,甚至促使其膜通透性增加 ,溶酶体膜
破裂 ,最终细胞走向坏死 。这可能因改变 HPFs凋亡
转导机制 ,启动细胞坏死信号 ,导致 HPFs 原有形态
结构破坏而使细胞崩解 、出现碎片等表现 ,从而抑制
其增殖。
　　本实验初步显示:5F能抑制体外培养的HPFs的
有丝分裂和 DNA复制 ,诱导其凋亡并促使其逐渐趋
向坏死 ,提示 5F 抑制成纤维细胞生长增殖的作用 ,
具有潜在的临床应用前景 。然而 ,5F 诱导的细胞凋
亡是抑制了生存基因还是激活了死亡基因 ?其在人
体上是否与体外培养的细胞同样具有明显抑制细胞
增殖的作用?仍需进一步研究 。
[ 参　考　文　献]
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