全 文 ：【基金项目】　国家自然科学基金(3987099)
【作者单位】　524009　广东湛江 ,解放军 422中心医院普外科(陈建发 、
陈引香 、李　萍 、傅　明);广东医学院广东天然药物研究与开发重点实
验室(吕应年)
【通讯作者】　陈建发 , E-mai l:chenjf623@163.com
半边旗提取物 5F 对人结肠腺癌细胞株 SW620
埃兹蛋白表达及活性影响
陈建发 ,陈引香 ,李　萍 ,傅　明 ,吕应年
　　【摘要】　目的　观察半边旗提取物 5F 对人结肠腺癌细胞株 SW620 的埃兹(Ezrin)蛋白表达及活性影响。 方法
采用四氮甲唑蓝[ 3-(4 , 5-dime thy lthiazol-2-y l)-2 , 5-dipheny ltetr azo lium bromide , MT T] 检测 5F 对 SW620 细胞的增殖抑
制作用 ,采用逆转录-聚合酶链反应(rev erse transcription-polymera se chain reaction , RT-PCR)检测 Ezrin m RNA , 采用
Western blo t法检测 Ezrin 和磷酸化 Ezrin 蛋白的表达。结果　5F 抑制 SW620 细胞增殖作用呈剂量和时间依赖性 , 其
48 h 半数抑制量(50% concentrction o f inhibition , IC50)为 0.968 mg/ ml。随着 5F 干预浓度增加 , Ezr in 的表达被抑制;
2.0 mg/ ml 5F 干预后 , Ezrin和磷酸化 Ezrin 蛋白表达的抑制作用明显增强 , 与对照组比较差异均有统计学意义。结论
半边旗提取物 5F 在体外能抑制 SW620细胞的增殖 , 通过抑制 Ezrin的表达 , 抑制大肠癌侵袭转移。
【关　键　词】　5F;埃兹蛋白;大肠癌;SW620;半边旗
【中图分类号】　R 735.35 　　　　【文献标识码】　A
Ef fect of Pteris Semi pinnata L Extract on Ezrin Expression and Activity in Human Colon Adenocarcinoma SW620 Cells
CHEN J ian-f a , CHEN Yin-x iang , LI Ping , FU Ming , LV Y ing-nian .Department o f General S ur gery , No.422
Hosp ital of the Peoples L iberation Army , Zhanj iang Guang dong 524009 , China
Corresponding author:CHEN J ian- f a , E-mai l:chenj f 623 @163.com
【Abstract】　Objective　To investig ate the effect o f Pteris Semip innata L ext ract(5F)on the expression and activ ity
of Ezrin in the human co lon adenoca rcinoma SW620 cells.Methods 　Effect o f the ex trac t on the pro life ration o f the hu-
man colon adenocarcinoma SW620 cells was asse ssed using 3-(4 , 5-dimethy lthiazo l-2-y l)-2 , 5-dipheny ltet razo lium bromide
(M TT)a ssay s.Ezrin mRNA was de te rmined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and the ex-
pression o f Ezrin was analyzed with Weste rn Blot assay.Results　The inhibito ry effect o f the ex tract on the pr oliferation
of SW620 cells was do se-and time-dependent , and it s IC50 at 48 hours was 0.968mg/ml.With the increa se of the 5F con-
centration , the expre ssion of Ezrin m RNA w as inhibited.When t reated with 2.0mg/ ml 5F , the expression levels of Ezrin
and its phospho ry lation pr oteins we re significantly inhibited compa red w ith the contro l g roup (P <0.05).Conclusion
Pteris Semipinnata L ex tract 5F can inhibit the pro lifer ation of SW620 cells and the nvation and me tabasis o f colon ade-
nocar cinoma by inhibiting Ezrin expression.
【Key words】　5F;Ezrin;Co lon adenocarcinoma;SW620;Pteris Semipinnata L
　　大肠癌是全球死亡率较高的消化道恶性肿瘤 ,浸
润和远处转移是导致患者死亡的主要原因。目前的化
疗已达到了一个平台期 ,各种化疗方案无法进一步显
著改善肿瘤患者的预后 ,并且化疗药物有多种副作
用[ 1] 。广泛存在于自然界植物中的萜类化合物具有多
种生物活性和较强抗肿瘤活性[ 2] ,日益成为抗肿瘤药
物研究的热点。埃兹(Ezrin)蛋白是最近发现的和肿
瘤转移有关的基因蛋白 ,在大肠癌组织中存在过表达 ,
且其表达水平与大肠癌侵袭转移和预后密切相关 。本
研究以体外培养的人结肠腺癌细胞株 SW620为研究
对象 ,观察半边旗抗肿瘤活性成分 Ent-11α-hydroxy-
15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)对 Ezrin 的表达或
活性的影响 ,探讨 5F 抗肿瘤侵袭和转移的作用机制 ,
为半边旗提取物 5F 的进一步开发和临床应用提供理
论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞系　人结肠腺癌细胞株SW620为南方医
科大学病理室馈赠。
1.1.2　药物及试剂　半边旗提取物 5F 由广东天然
·298· 华南国防医学杂志 2011年 8月 28日 第 25卷第 4期　Mil Med J S Chin , Vol.25 , No.4 , August 28 , 2011DOI :10.13730/j .1009-2595.2011.04.024
药物研究与开发重点实验室提供 ,纯度≥98%。新生
牛血清购自杭州四季青公司 。0.25% Trypsin 、RPM I
1640 培养基购于吉诺公司 。吖啶橙(acridine orange ,
AO)、溴化乙锭(ethidium bromide , EB)及四氮甲唑
蓝[ 3-(4 , 5-dimethy lthiazol-2-y l)-2 , 5-dipheny lte trazo-
lium bromide , MTT ] 购于 Sigma 公司 。二甲亚枫
(dimethy l sulfo xide , DMSO)购于 Amresco 公司。
Annexin Ⅴ-FITC 凋亡检测试剂盒购于碧云天公司。
鼠抗人 Ezrin 单克隆抗体 3C-12购自 Upstate 公司 ,
100%乙醇购自上海化学试剂厂 ,鼠抗人 β-actin 单克
隆抗体购自 Abeam 公司 , 马抗鼠异硫氰酸荧光素
(f luo re scein iso thiocyanate , FITC)标记的二抗购自
KPL 公司 , 辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠二抗购自
S antC ruz公司 ,聚偏二氟乙烯(po ly vinylidene f luo r-
ide , PVDF)膜产自 PiereeChemieal公司 ,分子量标准
参照品为 Newengland 公司 , EcL 显色试剂盒产自
Amersham 公司 。双蒸水由本实验室制备 。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　人结肠腺癌细胞株 SW620常规培
养于含 10%新生牛血清的 RPMI 1640 培养液中 , 置
于37 ℃ 5%CO 2培养箱内传代培养 , 0.25%胰蛋白酶
消化传代 。
1.2.2　半边旗提取物 5F 对 SW620细胞增殖的影响
采用 MTT 法取对数生长期的细胞 , 消化后重悬 , 以 8
×103/孔接种到 96 孔培养板 ,每孔加 180μl细胞悬液 。
细胞贴壁后加入不同浓度半边旗提取物 5F 20μl ,使其
终浓度分别为0.0625 、0.125 、0.25 、0.50 、1.0 、1.5和2.0
mg/ml ,每个浓度设 6个平行孔 , 同时设置空白对照组 、
溶剂对照组和调零孔。分别在培养 24 、48 、72 h用MTT
法测 570 nm 波长处吸光度(A)值 ,按公式计算细胞增
殖抑制率 , 再按 Bliss法求出半数抑制浓度(半数抑制量
(50% concentrction of inhibition , IC50值)。
1.2.3　半边旗提取物 5F 抑制 SW620细胞后 Ezrin
mRNA的表达　采用 RT-PCR检测 Ezrin mRNA 。将
扩增用试剂取出 ,解冻 ,离心。Taq 酶按说明操作 ,稀释
成 5μg/μl。引物通过计算 ,稀释 ,使引物浓度均为12.5
μmol/L。PCR 反应条件:95 ℃, 2 min , 94 ℃, 30 s※
55 ℃,30 s※72 ℃,2min 30 s;40个循环72 ℃,10min。
1.2.4　半边旗提取物 5F 对 Ezrin和磷酸化 Ezrin蛋
白表达的影响　采用 Western blo t法检测 Ezrin和磷
酸化 Ezrin蛋白的表达 。细胞裂解后提取总蛋白 ,经
丙烯酰胺凝胶电泳后转移至膜上;封闭液(含 5%的脱
脂奶粉 、3%牛血清白蛋白的 PBS)室温封闭 1 h ,转入
4 ℃封闭过夜 。一抗分别为鼠抗人单克隆抗体 、鼠抗
人磷酸化 Ezrin单克隆抗体及鼠抗人 β-actin单克隆抗
体 ,稀释度均为 1∶1000 ,二抗为辣根过氧化物酶标记
的兔抗小鼠 IgG;PVDF 膜依次与抗体作用后 ,进行
免疫印迹 , X光片曝光 ,显影 ,定影后进行分析 。实验
重复 3次 。
1.3　统计学处理
应用 SPSS 13.0统计软件进行数据分析 , 实验数据
采用均数±标准差( x±s)表示。多组比较采用方差分析 ,
两组间比较采用 t检验 ,以P<0.05为有统计学意义。
2　结果
2.1　半边旗提取物 5F 对 SW620细胞增殖的影响
半边旗提取物 5F 能显著抑制 SW620 细胞的增
殖 ,显示明显的剂量效应及时间效应关系(图 1)。
图 1　SW620细胞在半边旗 5F作用下的量效曲线
Figur e 1　Dose-effect curves of SW620 cells af te r 5F trea tment
2.2 　半边旗提取物 5F 抑制 SW620 细胞后 Ezrin
mRNA 的表达
在提取的细胞标本中均可检测到 Ezrin mRNA
的表达(图 2)。随着干预浓度增加 , Ezrin表达水平低
于对照组 ,有统计学意义(P<0.05 ,表 1)。
图 2　RT-PCR检测 Ezrin mRNA在 SW620细胞中的表达
contro l为对照组;B1 、B2为 5F 干预组;
Ezrin 450bp , β-actin 550bp
F igure 2　Expresion of Ezrin m RNA in SW620
cells determined by RT-PCR
2.3　半边旗提取物 5F 对 SW620 细胞后 Ezrin和磷
酸化 Ezrin蛋白表达的影响
根据 MT T 比色法检测结果而求出的 48 h 半边
旗提取物 5F 对 SW620 细胞增殖的半数抑制浓度
(IC50),作者用 5F(1.0 、2.0 mg/ml)处理 48 h后 ,分别
提取细胞总蛋白用于 Weste rn blo t检测 。结果显示:
·299·华南国防医学杂志 2011年 8月 28日 第 25卷第 4期　Mil Med J S Chin , Vol.25 , No.4 , August 28 , 2011
表 1　5F干预组与对照组 Ezrin mRNA的
相对含量比较( x±s)
Table 1　Comparison o f Ezrin m RNA concentrations in
5F treated gr oup and control g roup( x±s)
对照组 5F 含量(mg/ml)
1.0 2.0
Ezrin mRNA 0.72±0.12 0.48±0.08＊ 0.22±0.08＊
t值 - 5.235 5.412
P值 - <0.05 <0.05
注:与对照组比较 , ＊P<0.05
1.0 mg/ml 5F 培养 48 h 后 , Ezrin 蛋白表达降低 ,但
与对照组比较 ,差异无统计学意义(P >0.05),而磷酸
化 Ezrin蛋白表达明显降低 ,与对照组比较 ,差异有统
计学意义(P <0.05)。 2.0 mg/ml 5F 干预后 , Ezrin
和磷酸化 Ezrin蛋白表达的抑制作用明显增强 ,与对
照组比较差异均有统计学意义(图 3)。
图 3　Ezrin和磷酸化 Ezrin蛋白在 SW620细胞中的表达
F igure 3　Expression of Ezrin and its phospho ry la tion
pr oteins in SW620 cells
3　讨论
半边旗为岭南特色植物凤尾蕨属半边旗(Pteris
semipinnata L)的干燥全草 ,收载于《中药大辞典》 ,民
间认为有生肌 、解毒 、消肿及治疗蛇伤的功效 。现代药
理学研究发现 ,该草药乙醇提取物具有抗肿瘤作用。
深入研究发现 , 半边旗抗肿瘤活性成分 Ent-11α-hy-
droxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)是一种二萜
类化合物 ,分子中的αβ-不饱和环戊酮结构是发挥抗肿
瘤作用的重要基团[ 3-5] 。其作用机制主要是抑制细胞
增殖 ,使细胞周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡等[ 6-9] 。
Ezrin蛋白是最近发现的和肿瘤转移有关的基因
蛋白[ 10] 。Ezrin在大肠癌组织中存在过表达 ,且其表
达水平与大肠癌侵袭转移和预后密切相关 ,提示该分
子在大肠癌侵袭转移过程中具有重要作用 ,可能成为
抑制大肠癌侵袭转移的靶点[ 11-13] 。Ezrin 蛋白通过调
节黏附分子和信号转导等途径 ,参与细胞与细胞 、细胞
与基质之间的相互作用 ,从而在肿瘤发展 、浸润和转移
过程中起着重要作用 。相对于其他一些与肿瘤转移相
关的分子 ,Ezrin蛋白表达异常可能参与了更多肿瘤早
期转移机制 ,提示 Ezrin蛋白可能是早期肿瘤转移的
重要标志 。Ezrin的过表达有可能通过对于信号转导
的负性调控因子的限制作用 ,如 RhoGDI ,导致正常细
胞信号转导网络的失衡 ,从而使像 CD-44或 Met这样
的可以产生肿瘤转移效应的细胞表面分子所传递的信
息被放大 ,最终导致肿瘤的转移[ 14-16] 。由于大肠癌的
侵袭及转移是影响大肠癌患者预后的主要因素 ,筛选
有效的抗肿瘤侵袭转移药物 ,对提高大肠癌治疗效果 ,
改善其预后 ,具有重要的理论意义和临床应用价值。
本研究 MTT 法检测显示 ,半边旗提取物 5F 能抑制细
胞增殖作用 ,呈时间剂量依赖性 。采用 Western blot
和 RT-PCR法观察了半边旗提取物 5F 在不同浓度梯
度下对SW620细胞 Ezrin蛋白和磷酸化 Ezrin蛋白的
抑制作用 ,结果表明 ,半边旗提取物 5F 具有较强的抑
制大肠癌细胞细胞膜-细胞骨架连接蛋白 Ezrin 的表
达及其活化作用 , 可能具有抗大肠癌侵袭转移的潜在
应用价值 。
参 考 文 献
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·300· 华南国防医学杂志 2011年 8月 28日 第 25卷第 4期　Mil Med J S Chin , Vol.25 , No.4 , August 28 , 2011
在临床应用时是完全可以达到的。与以往报道的复
制子系统相比 ,全基因组 HCV 系统较复制子系统对
C sA处理显得更为敏感 ,这为临床治疗提供了重要
参考 ,也提示全基因组 HCV 与复制子之间结构和功
能的差异可能是导致其对 CsA敏感性差异的原因。
给药时机和给药方法是影响临床药物疗效的一
个重要因素。从图 3 可以看出 , C sA 预处理组较感
染同时给药及感染后给药组取得了更好的抗 HCV
效果 ,提示临床对于可能感染 HCV 的高危患者预先
给予 CsA可以取得更好的抗 HCV 效果 。而给药 48
h后撤除C sA导致 HCV JFH-1在 Huh7中复制的反
弹则提示 ,CsA 的药物作用不能维持 ,因此需持续临
床治疗 。CsA通过与细胞内 Cyclophillin高亲和力结
合 ,发挥药理作用 ,结合形成的复合物抑制钙调神经
磷酸酶活性 ,阻止了活化 T 细胞核因子(nuclear fac-
tor of activated T cells ,NFAT)的去磷酸化及其向核
内转移 ,从而抑制了白介素 2 等的产生 ,抑制 T 细胞
活化 。但研究表明 ,CsA 抗 HCV 的作用与抑制钙调
神经磷酸酶活性无关[ 7] ,与同 Cyclophilins的结合相
关[ 8-9] 。Cyclophilins具有肽基脯氨酰顺反异构酶活
性 ,催化蛋白折叠反应 , CsA 与 Cyclophilins结合使
其活性受到抑制 ,可能影响到病毒蛋白的合成和组
装。有报道 CsA 还可影响 HIV 、HSV 的复制及合
成 ,可能也与这种作用机制有关[ 10] 。CsA 预处理可
能使 Cyclophilins酶活性提前降低 ,所以更有效地抑
制了病毒的合成 。提示早期给药可能起到预防作
用 ,而药物浓度下降后 ,可能因 Cyclophilins酶活性的
恢复而使病毒复制反弹 。CsA 虽然表现出强有力的
抗 HCV病毒作用 ,但长时间处理能否使病毒消除尚
有待进一步研究 。
参 考 文 献
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·304· 华南国防医学杂志 2011年 8月 28日 第 25卷第 4期　Mil Med J S Chin , Vol.25 , No.4 , August 28 , 2011