全 文 ：作者简介:白 荣，女，副主任药师，研究方向:医院药学、临床药学、
药物分析及药物制剂，E-mail:bairongsanxia@ 163． com
高效液相色谱法同时测定伤湿丸中的新北美圣草苷、
柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯的含量
白 荣1，谭艳菊1，邱海蕴2
(1．三峡大学仁和医院药剂科;2．三峡食品药品检验检测中心，湖北 宜昌 443000)
摘要:目的 建立同时测定伤湿丸中新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯含量的高效液相色谱法。方法 采用 kro-
masil C18柱色谱柱(250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ，以乙腈(A)—0． 4%冰醋酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱;柱温 25℃;流速为
0． 9 mL·min －1;进样量为 20 μL;新北美圣草苷和柚皮苷检测波长为 λ1 = 283 nm，乌索酸和鸡矢藤苷甲酯检测波长为 λ2 =
345 nm。结果 新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯，在给定浓度范围内线性范围分别为 4． 72 ～ 94． 40 mg·L －1(r
= 0． 999 4)、5． 11 ～ 102． 20 mg·L －1(r = 0． 999 7)、7． 14 ～ 142． 80 mg·L －1(r = 0． 999 8)、5． 15 ～ 103． 00 mg·L －1(r = 0． 999
2) ，线性关系良好;平均加样回收率(n = 6)和 ＲSD值分别为 99． 19%(0． 93%)、97． 90%(1． 02%)、99． 31%(0． 70%)、96． 92%
(1． 45%)。结论 该文建立的 HPLC方法可同时测定伤湿丸中新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯含量。方法简
便、准确、灵敏度高、重现性好，为评价伤湿丸质量控制提供可靠方法。
关键词:高效液相色谱法;伤湿丸;新北美圣草苷;柚皮苷;乌索酸;鸡矢藤苷甲酯
doi:10． 3969 / j． issn． 1009 － 6469． 2016． 02． 015
Simultaneous determination of neoeriocitrin，naringin，ursolic acid and
feretoside in Shangshi Wan by HPLC
BAI Ｒong1，TAN Yan-ju1，QIU Hai-yun2
(1． Department of Pharmacy，Ｒenhe Hospital，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443000，China;
2． Three Gorges Center for Food and Drug Control Yichang，Hubei 443000，China)
Abstract:Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the simultaneous determination of
neoeriocitrin，naringin，ursolic acid and feretoside in Shangshi Wan．Methods A stable HPLC method was established and the chroma-
tography was accomplished on a kromasil C18 column (250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ，with a mobile phase consisted of acetonitrile(A)－
0． 4% glacial acetic acid solution(B)． The column temperature was set at 25℃，and the flow rate was 0． 9 mL·min －1 ． All the injection
volume was 20 μL． Neoeriocitrin and naringin were detected at 283 nm，while ursolic and feretoside at 345 nm． Ｒesults Neoeriocitrin，
naringin，ursolic acid and feretoside showed linearity in the given concentration range at 4． 72 ～ 94． 40 mg·L －1(r = 0． 9994) ，5． 11 ～
102． 20 mg·L －1(r = 0． 9997) ，7． 14 ～ 142． 80 mg·L －1(r = 0． 999 8) ，and 5． 15 ～ 103． 00 mg·L －1(r = 0． 999 2) ，respectively． The
average recoveries (n = 6)and ＲSD were 99． 19%(0． 93%) ，97． 90%(1． 02%) ，99． 31%(0． 70%) ，96． 92%(1． 45%) ，respec-
tively． Conclusions This HPLC method could simultaneously determine the concentrations of neoeriocitrin，naringin，ursolic acid and
feretoside in Shangshi Wan and can be used to evaluate the quality of Shangshi Wan． The method is simple，accurate，reliable and sensi-
tive． It could be used as an efficient strategy for systematic quality evaluation of Shangshi Wan．
Key words:HPLC method;Shangshi Wan;neoeriocitrin;naringin;ursolic acid;feretoside
伤湿丸为复方制剂，处方由骨碎补、黄毛耳草、
蔓九节三味药材组成，收载于卫生部药品标准中药
成方制剂第九册，该制剂具有舒筋活络，清热除湿，
消肿止痛之功效，对治疗跌打损伤，扭伤，腰肌劳
损，风湿筋骨痛，神经痛等症状的疗效显著。该制
剂现行的质量标准对伤湿丸的性状、检查项做了规
定，鉴别项仅有对本品的显微镜观察［1］，标准相对
简单，不能较全面控制药品质量，本研究采用高效
液相梯度洗脱法［2］，同时对制剂中骨碎补药材所含
新北美圣草苷、柚皮苷和黄毛耳草所含乌索酸、鸡
矢藤苷甲酯进行测定，为评价伤湿丸的质量控制提
供参考依据。
1 仪器与试药
Waters1525 型高效液相色谱仪，Waters2787 可
变波长检测器;KS600D型超声波清洗仪(宁波科生
仪器厂) ，AG285 十万分之一电子天平(梅特勒 －托
利多仪器上海有限公司)。乙腈为色谱纯，水为超
·362·安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Feb;20(2)
纯水，冰醋酸、乙醇为分析纯;新北美圣草苷对照品
(13241 － 32 － 2，纯度以 98． 0%计)购于上海田源生
物技术有限公司，柚皮苷对照品(110722 － 201312，
含量以 94． 7%计)购于中国食品药品检定研究院，
乌索酸对照品(77 － 52 － 1，纯度以 98． 0%计)购于
北京万佳首化生物科技有限公司，鸡矢藤苷甲酯对
照品(27530 － 67 － 2，纯度以 98． 0%计)购于上海源
叶生物科技有限公司;伤湿丸三批样品(规格:每 30
丸重 9 g，批号为 140501、140502、140504)购于福州
屏山制药有限公司。
2 方法与结果
2． 1 系统适用性实验与色谱条件 色谱柱:kroma-
sil C18柱色谱柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ;乙腈为
流动相 A，0． 4% 冰醋酸溶液为流动相 B，梯度洗
脱［3 － 7］;检测波长(0 ～ 37 min，λ1 = 283 nm
［8 － 12］，
38 ～ 55 min，λ2 = 345 nm
［13］) ;流速为 0． 9 mL·
min －1;柱温为 25℃;进样量 20 μL。理论塔板数均
不低于 3 500，此系统条件下各组分分离效果良好，
梯度洗脱程序见表 1。
表 1 流动相梯度洗脱程序
时间 /min A /% B /%
0 ～ 12 15． 0 85． 0
13 ～ 37 15． 0→25． 0 85． 0→75． 0
38 ～ 47 25． 0→42． 0 75． 0→58． 0
48 ～ 55 42． 0→15． 0 58． 0→85． 0
2． 2 对照品溶液的制备 分别精密称取新北美圣
草苷对照品 9． 44 mg、柚皮苷对照品 10． 22 mg、乌索
酸对照品 14． 28 mg 和鸡矢藤苷甲酯对照品 10． 30
mg，分别置 20 mL量瓶中，用 75%乙醇溶解并稀释
至刻度，制成新北美圣草苷 0． 472 g·L －1、柚皮苷
0． 511 g·L －1、乌索酸 0． 714 g·L －1和鸡矢藤苷甲
酯 0． 515 g·L －1的各组分对照品储备液。分别精
密量取刚配制的各对照品储备液 2． 5、5． 0、2． 5、2． 0
mL，置 50 mL 量瓶中，用 75%乙醇稀释至刻度，制
成新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯
分别为 0． 023 6、0． 051 1、0． 035 7、0． 020 6 g·L －1的
混合对照品溶液。
2． 3 供试品溶液的制备 取伤湿丸适量，剪碎，混
合均匀，取约 0． 3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，
再精密加入 75%乙醇溶液 50 mL，密塞，称定锥形瓶
和样品的总重量，超声处理 30 min，取出后放冷，采
用 75%乙醇溶液补足减失的重量，振摇均匀后，用
0． 45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品
溶液。
2． 4 阴性对照溶液的制备 按照伤湿丸质量标准
中规定的药味比例，以相同工艺分别制备骨碎补空
白样品和黄毛耳草空白样品。按照“2． 3”项下供试
品溶液的制备方法，制备成不含骨碎补的阴性对照
溶液和不含黄毛耳草的阴性对照溶液。
2． 5 阴性对照试验 分别精密吸取供试品溶液、
混合对照品溶液、骨碎补阴性对照溶液和黄毛耳草
阴性对照溶液各 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱
图，结果显示，对照品色谱峰保留时间相对应位置，
供试品溶液有相同保留时间色谱峰，阴性对照溶液
在此时间则无，结果表明阴性对照无干扰，结果见
图 1。
A．对照品
B．样品
C．骨碎补空白样品
D．黄毛耳草空白样品
图 1 新北美圣草苷、柚皮苷、
乌索酸、鸡矢藤苷甲酯的 HPLC色谱图
注:1．新北美圣草苷;2．柚皮苷;3．乌索酸;4．鸡矢藤苷甲酯。
·462· 安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Feb;20(2)
2． 6 线性关系考察 精密吸取对照品储备液 0． 1、
0． 2、0． 5、1． 0、2． 0 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，各
用 75%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得一系列不
同浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件进行进
样测定，以各对照品浓度 X 为横坐标，峰面积 Y 为
纵坐标，建立线性方程，新北美圣草苷、柚皮苷、乌
索酸和鸡矢藤苷甲酯线性关系实验结果见表 2。
2． 7 精密度试验 精密吸取“2． 2”项下混合对照
品溶液(新北美圣草苷 0． 023 6 g·L －1、柚皮苷
0． 051 1 g·L －1、乌索酸 0． 035 7 g·L －1、鸡矢藤苷
甲酯 0． 020 6 g·L －1)20 μL，连续进样 6 次，按上述
色谱条件测定，记录新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸
和鸡矢藤苷甲酯峰面积，计算峰面积的 ＲSD值分别
为新北美圣草苷为 0． 96%、柚皮苷为 1． 05%、乌索
酸为 0． 95%、鸡矢藤苷甲酯为 1． 07%。结果表明，
精密度良好。
表 2 线性关系实验结果
所测组分 回归方程 线性范围 /mg·L －1 r
新北美圣草苷 Y = 6． 195 9 × 105X － 432． 8 4． 72 ～ 94． 40 0． 999 4
柚皮苷 Y = 1． 591 7 × 106X + 315． 2 5． 11 ～ 102． 20 0． 999 7
乌索酸 Y = 9． 514 3 × 105X + 258． 9 7． 14 ～ 142． 80 0． 999 8
鸡矢藤苷甲酯 Y = 2． 983 6 × 105X － 127． 6 5． 15 ～ 103． 00 0． 999 2
表 3 加样回收率实验结果
称取量 /mg 样品中含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% ＲSD /%
新北美圣草苷 0． 149 2
0． 150 6
0． 151 1
0． 149 8
0． 148 1
0． 150 7
0． 574 4
0． 579 8
0． 581 7
0． 576 7
0． 570 2
0． 580 2
0． 590 0
0． 590 0
0． 590 0
0． 590 0
0． 590 0
0． 590 0
1． 161 9
1． 169 9
1． 168 5
1． 154 7
1． 160 4
1． 159 1
99． 58
100． 02
99． 46
97． 97
100． 03
98． 12
99． 19 0． 93
柚皮苷 0． 149 2
0． 150 6
0． 151 1
0． 149 8
0． 148 1
0． 150 7
1． 219 0
1． 230 4
1． 234 5
1． 223 9
1． 210 0
1． 231 2
1． 277 5
1． 277 5
1． 277 5
1． 277 5
1． 277 5
1． 277 5
2． 483 1
2． 461 9
2． 474 3
2． 482 4
2． 459 7
2． 491 3
98． 95
96． 40
97． 05
98． 51
97． 82
98． 64
97． 90 1． 02
乌索酸 0． 149 2
0． 150 6
0． 151 1
0． 149 8
0． 148 1
0． 150 7
0． 941 5
0． 950 3
0． 953 4
0． 945 2
0． 934 5
0． 950 9
0． 892 5
0． 892 5
0． 892 5
0． 892 5
0． 892 5
0． 892 5
1． 834 9
1． 831 1
1． 837 4
1． 839 7
1． 820 1
1． 830 8
100． 10
98． 69
99． 05
100． 22
99． 23
98． 59
99． 31 0． 70
鸡矢藤苷甲酯 0． 149 2
0． 150 6
0． 151 1
0． 149 8
0． 148 1
0． 150 7
0． 481 9
0． 486 4
0． 488 1
0． 483 9
0． 478 4
0． 486 8
0． 515 0
0． 515 0
0． 515 0
0． 515 0
0． 515 0
0． 515 0
0． 980 7
0． 981 3
0． 983 6
0． 997 5
0． 973 8
0． 983 4
96． 85
96． 10
96． 21
99． 73
96． 19
96． 43
96． 92 1． 45
·562·安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Feb;20(2)
2． 8 重复性试验 精密称取同一批供试品伤湿丸
样品，按“2． 3”项下方法制备供试品溶液 6 份，依法
测定，记录新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤
苷甲酯峰面积，计算各组分含量，各组分含量的
ＲSD 值分别为新北美圣草苷 1． 12%、柚皮苷
1． 02%、乌索酸 0． 98%、鸡矢藤苷甲酯 1． 15%。
2． 9 稳定性试验 取同一批号的伤湿丸供试品溶
液各 20 μL，分别于 0、4、8、12、24 h 进样依法测定，
新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯的
ＲSD值，分别为 1． 05%、0． 96%、1． 13%、0． 97%，结
果显示供试品溶液 24 h内是很稳定的。
2． 10 加样回收率试验 取已知含量的伤湿丸(新
北美圣草苷为 3． 85 mg·g －1、柚皮苷为 8． 17 mg·
g －1、乌索酸为 6． 31 mg·g －1、鸡矢藤苷甲酯为 3． 23
mg·g －1)6 份，剪碎，混匀，取约 0． 15 g，精密称定，
置于 50 mL具塞锥形瓶中，精密加入 25 mL 混合对
照品溶液、75%乙醇溶液 25 mL，按“2． 3”项下操作，
制得加样供试品溶液。记录色谱图，计算各组分计
算各组分平均回收率和 ＲSD值，结果见表 3。
2． 11 样品测定 取不同批号伤湿丸样品 3 批，照
“2． 3”项下方法制备供试品溶液，依法进样测定计
算样品中新北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤
苷甲酯含量。结果见表 4。
表 4 样品含量测定结果 /mg·g － 1
批号 新北美圣草苷 柚皮苷 乌索酸 鸡矢藤苷甲酯
140501 3． 85 8． 17 6． 31 3． 23
140502 3． 71 8． 10 6． 18 3． 14
140504 3． 96 8． 28 6． 39 3． 34
3 讨论
3． 1 流动相的选择 流动相的种类及配比直接影
响到组分的分离，正确的选择流动相，确定最佳的
色谱分离条件，可以实现更理想的分离。本试验考
察了乙腈—水、甲醇—0． 1% 冰醋酸溶液、乙腈—
0． 4%冰醋酸溶液、乙腈—0． 1%冰醋酸溶液 4 种流
动相系统进行比对，结果显示，乙腈—0． 4%冰醋酸
溶液为流动相时各组分分离度及峰形能够达到良
好的分离效果，峰形好，因此采用乙腈—0． 4%冰醋
酸溶液为流动相进行梯度洗脱测定伤湿丸中的新
北美圣草苷、柚皮苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯。
3． 2 流动相梯度洗脱程序和检测波长的选择 笔
者通过初步探索试验得知:在此梯度洗脱条件下，
新北美圣草苷和柚皮苷在 13 ～ 37 min 范围内出峰，
黄毛耳草所含乌索酸和鸡矢藤苷甲酯在 38 ～ 47
min范围内出峰。同时所测 4 个组分的紫外吸收峰
不一样，笔者分别采用各组分对照品用 75%乙醇稀
释成一定浓度后，经紫外光谱扫描得知，新北美圣
草苷和柚皮苷在 283 nm处有最大吸收，黄毛耳草所
含乌索酸和鸡矢藤苷甲酯在 345 nm处有最大吸收。
综合权衡后设定:按照文中的各时间区间采用不同
的检测波长，以使获得较好的信噪比和灵敏度。
3． 3 提取溶剂及时间的考察 试验分别对提取溶
剂(100% 乙醇、75% 乙醇、50% 乙醇) ，提取时间
(15、30、60 min) ，进行考察比较，结果显示 75%乙
醇超声处理 30 min效果最佳。
本文建立的高效液相色谱梯度洗脱法能有效
地测定伤湿丸中四种主要成分新北美圣草苷、柚皮
苷、乌索酸和鸡矢藤苷甲酯的含量，样品中各组分
能较好分离，方法简便、专属性强、重现性好，可用
于伤湿丸相应指标的质量控制。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 卫生部药品标准中药成方制剂(第九册)
［S］，WS3 － B － 1738 － 94，1994:75．
［2］ 国家药典委员会．中国药典(一部) ［S］．北京:中国医药科技
出版社，2010:239，附录 30，附录 36．
［3］ 李遇伯，孟繁浩，潘晓峰，等． HPLC 同时测定骨碎补药材中新
北美圣草苷和柚皮苷的含量［J］．药物分析杂志，2006，26(6) :
808 － 810．
［4］ 陈 武，罗志刚，邹盛勤，等．黄毛耳草中乌索酸的分离提纯及
ＲP － HPLC分析［J］．江西师范大学学报(自然科学版) ，2005，
29(4) :348 － 350，362．
［5］ 李 晶，周国平，李才堂，等．黄毛耳草药材质量标准研究［J］．
中国中药杂志，2009，34(20) :2619 － 2621．
［6］ 范 兴，杨成梓，曾伟生，等． HPLC 法测定烫骨碎补中柚皮苷
的含量［J］．海峡药学，2013，25(11) :74 － 76．
［7］ 孙秀川． HPLC测定壮骨关节丸中柚皮苷的含量［J］．内蒙古医
学杂志，2014，46(4) :463 － 464．
［8］ 白俊鹏，尚振苹，蒋晓文，等．骨碎补高效液相指纹图谱研究及主要
成分含量测定［J］．国际药学研究杂志，2015，42(3):398 －403．
［9］ 周 滢，曾志华．烫骨碎补配方颗粒的提取工艺优选及其含量
测定［J］．中国实验方剂学杂志，2015，21(5) :54 － 56．
［10］ 岳春华，李顺祥．从骨碎补中制备新北美圣草苷和柚皮苷对照
品的研究［J］．中草药，2008，39(4) :529 － 531．
［11］ 张咏梅，陈晓峰，姚莉萍． HPLC法测定无糖型胃炎灵颗粒中柚
皮苷的含量［J］．安徽医药，2014，18(6) :1045 － 1047．
［12］ 张丽君，田 军，刘 永． HPLC 法同时测定痛经贴剂中柚皮
苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J］． 安徽医药，2015，19(10) :
1877 － 1880．
［13］ 邢占芬，成洪达，张平平．黄毛耳草 HPLC 指纹图谱研究［J］．
中药材，2014，37(5) :789 － 791．
(收稿日期:2015 － 09 － 30，修回日期:2015 － 11 － 15)
·662· 安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Feb;20(2)