全 文 ：络，治宜益气养阴活血通络，采用中药配方颗粒黄芪、地黄、黄精、
丹参、川芎、地龙、全蝎、水蛭等组方，前期实验［10］表明该方可显
著减轻 DM模型大鼠多饮、多食、多尿、体质量减轻，显著降低血
糖，对实验性 DM 大鼠有积极治疗作用。本实验结果进一步显
示，DM模型大鼠 SD 和 U － nephrin 呈正相关，UAEＲ 显著增加。
益气养阴活血通络方对 DN有积极治疗作用，可显著减少 DN 尿
蛋白，抑制 SD增宽，减少尿 nephrin 排泄，可能是其作用机制之
一。
参考文献:
［1］ 王 梅，林晓明，王海燕，等．早期糖尿病肾病的病理形态学变化探
讨［J］．中国实用内科杂志，2002，22(8):490．
［2］ Ｒuots alainen V，Liungberg P，Wartionvaara J，et al． Nephrin is specif-
ically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes［J］． Paod
Natl Acad Sci USA，1999，96:7962．
［3］ 李黎莉，王凤丽，李林林，等．陈志强治疗糖尿病肾病临床经验［J］．
辽宁中医杂志，2011，38(9):1743．
［4］ Li LL，Chen ZQ，Wang ＲH，et al． Ｒelationship between Urinary
Nephrin and urinary albumin changes in ddiabetic rats and effects of
yiqiyangyinhuayutongluo recipe［J］． J Tradit Chin Med，2012，32(2) :
278．
［5］ 李黎莉，陈志强，王月华，等．益气养阴化瘀通络中药及其拆方对糖
尿病大鼠模型 nephrin 蛋白的影响［J］． 中国中西医结合杂志，
2012，32(7):960．
［6］ 陈 奇．现代中药药理学，第 2 版［M］． 北京:人民卫生出版社，
2006
［7］ Doublier S，Salvidio G，Lupia E，et al． Nephrin Expression is reduced
in human diabetic nephropathy :evidence for a distinct role for glycated
albumin and angiotensin II［J］． Diabetes，2003，52(4):1023．
［8］ Aaltonen P，Luimula P，Astrom E，et al． Changes in the expression of
nephrin gene and protein in experimental diabetic nephropathy［J］． Lab
Invest，2001，81(9) :1185．
［9］ Bjorn SF，Bangstad HJ，Hanssen KF，et al． Glomerular epithelial foot
processes and filtration slits in IDDM patients［J］． Diabetologia，1995，
38(10) :1197．
［10］ 李黎莉，陈志强，王月华，等．益气养阴化瘀通络中药对实验性糖尿
病大鼠模型的影响［J］．时珍国医国药，2012，23(5):1203．
收稿日期:2013-03-15; 修订日期:2013-09-03
基金项目:广东省自然科学基金
( No． 10151009001000011; No． 8151009001000029)
作者简介:余 姣( 1987-) ，女( 汉族) ，湖北麻城人，广东工业大学在读硕
士研究生，主要从事天然产物化学研究工作．
* 通讯作者简介:丁利君( 1965-) ，女( 汉族) ，湖南长沙人，广东工业大学
教授，硕士学位，主要从事农产品加工与天然产物化学研究工作．
大孔树脂纯化芒萁总皂苷
及其抗氧化活性的研究
余 姣，丁利君* ，李嘉琪
(广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 优化大孔树脂纯化芒萁总皂苷的工艺参数。方法 分别用 AB － 8、D － 101、Hz － 803、HZ － 816 大孔树脂对芒
萁皂苷进行静态吸附与解吸试验，筛选出分离效果最好的一种树脂，并研究该树脂分离芒萁总皂苷的动力学曲线和动态
吸附性能。以 BHT为对照，考察纯化后的芒萁总皂苷清除 DPPH自由基的效果。结果 优化的 D － 101 大孔树脂对芒萁
皂苷的吸附条件为: 流速 2BV·h －1时，料液的 pH值和浓度分别为 5 和 20． 5 mg·ml －1 ;优化的洗脱条件: 流速为 2BV·
h －1，洗脱溶剂为 3BV 70%的乙醇水溶液。纯化后总皂苷含量为 64． 9%，纯化倍数为 2． 2 倍;纯化后的芒萁总皂苷对 DP-
PH自由基的清除效果比 BHT好，浓度为 1． 0 mg /ml时，芒苷皂苷对 DPPH 自由基的清除率达 95． 6%。结论 D － 101 大
孔树脂对芒其皂苷有很好的纯化效果，芒萁皂苷对 DPPH自由基有很好的清除作用，是一种很好的抗氧化剂。
关键词:芒萁; 总皂苷; 大孔吸附树脂; 纯化; 抗氧化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 01． 017
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 01-0040-04
芒萁 Dicranopteris pedata，水龙骨目里白科芒萁属蕨类植物，
又名铁狼萁［1］，广泛分布于中国长江以南各省区、朝鲜南部及日
本。芒萁属植物生于强酸性的红壤丘陵或马尾松林下，是一种酸
性土壤指示剂［2］。芒萁性凉，味微苦涩，具有化瘀止血，清热解
毒利尿，润肺止咳等功效。近年来关于芒萁的化感作用研究的很
多［3，4］。芒萁提取物的生物活性也不断被人类发现，其活性成分
主要有三萜类皂苷、黄酮类、生物碱类、甾体及酚类等［5］。皂苷
有很强的药理活性，主要表现在抗肿瘤、抗炎、保肝、防治心脑血
管疾病、抗氧化、抗真菌［6 ～ 9］等方面，然而对芒萁皂苷的研究报道
较少。本实验主要对大孔树脂纯化芒萁皂苷的条件进行了优化，
提高了纯化效果，为芒萁皂苷的进一步研究提供参考。
1 材料与仪器
1． 1 药材 芒萁:采自广州大学城 60℃烘干，粉碎，粉末过 40 目
数的筛。称取 10． 0 g芒萁，加 15 倍体积的 50%乙醇在 60 ℃水
浴中提取 3 次，每次 3h，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至一
定浓度，过滤，滤液备用。
1． 2 试剂 人参皂苷 Ｒg1(HPLC≥98%，广州市奇云生物科技有
限公司)。2，6 －二叔丁基对甲酚(BHT)阿拉丁试剂;大孔吸附
树脂 D －101，AB － 8，HZ － 803，HZ － 816，均产自于天津市大茂化
学试剂厂;其它均为分析纯试剂。
1． 3 主要仪器设备 DS － 1 高速组织粉碎机(上海标本模型厂);
722 型可见分光光度计(上海悦丰仪器仪表有限公司);ＲE － 52
型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)等。
2 方法
2． 1 芒萁总皂苷的测定方法
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1
2． 1． 1 标准曲线的制备 香草醛 － 冰醋酸显色法，参照文献
［10］的方法，略作改进:精密称取 10． 700 0 mg 人参皂苷 Ｒg1 对
照品于 50 ml容量瓶中，加入约 40 ml 甲醇，溶解，冷却后加入甲
醇至刻度，摇匀，精密量取 0． 1，0． 2，0． 4，0． 6，0． 8，1． 0，1． 2 ml，分
别置于 10 ml磨口具塞试管中，热水浴挥干溶剂，加入 0． 2 ml 5%
(M/V)香草醛 －冰醋酸溶液(现配现用)，0． 8 ml 高氯酸，然后放
置 60 ℃恒温水浴中 15 min，取出置于冰水浴内冷却 5 min，加入 5
ml冰醋酸，摇匀，以相应试剂为空白对照，在 545 nm波长处测定
吸光度，平行测定 3 组。以皂苷量(μg)为横坐标，3 次测定的吸
光度平均值 A 为纵坐标作图，得回归方程 Y = 0． 023 2X －
0． 018 2，Ｒ2 = 0． 998 2。
2． 1． 2 芒萁皂苷含量的测定 精密吸取样品液至磨口具塞试管
中，热水浴挥干溶剂，加入新配制的 5%(M/V)香草醛 －冰醋酸
溶液 0． 2 ml，高氯酸 0． 8 ml，摇匀，接着放置在恒温 60 ℃水浴中
15 min，取出置于冰水浴内冷却 5 min，加入 5 ml冰醋酸，摇匀，以
相应试剂为空白，在 545 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程计
算出总皂苷含量。
2． 2 树脂对皂苷的静态吸附量与解吸率试验
2． 2． 1 树脂预处理 用 95%乙醇浸泡 24 h后用 95%乙醇洗至流
出液加适量蒸馏水无白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。接着用
2BV的 5%HCl溶液以 4 ～ 6BV /h 流速通过树脂层，并浸泡 2 ～ 4
h，而后用蒸馏水洗至 pH中性。再用 2%NaOH溶液替代 5% HCl
溶液按同样的操作进行，备用。
2． 2． 2 树脂对皂苷的静态吸附量与解吸率试验 精密量取经过
预处理的 D －101、AB － 8、HZ － 803、HZ － 816 大孔树脂各 5ml 置
于锥形瓶中，分别加入经 4 000 r /min 离心 5 min 的浓度为7． 5
mg /ml 的芒萁皂苷提取物水溶液 95 ml，封口，置于摇床中，在室
温下以 60 r /min振摇 24 h 后检测上清液中皂苷的浓度，然后按
式(1)计算树脂的静态吸附量。采用过滤法分离开树脂和吸附
后的溶液，再用滤纸充分吸干树脂表面残留的水，接着将树脂分
别放回锥形瓶中，各加入 95 ml 60%乙醇水溶液，然后以 60 r /min
振摇解吸 24 h，从上清液取样测定解吸液中皂苷的浓度，按式
(2)计算解吸率。
2． 2． 3 大孔树脂静态吸附动力学特征的研究 吸附曲线特征反
映的是随时间的延长，树脂对样品吸附量的变化趋势。根据吸附
率和解吸率的测定比较，选择一种理想的树脂测定吸附速率，取
已经预处理过的大孔吸附树脂 2． 0 g(用滤纸吸干)装入三角瓶
中，精密加入浓度为 7． 5 mg /ml 皂苷水溶液 50ml，置于恒温气浴
(室温)振荡器上，在 8h内，每小时各取 0． 1 ml，测定总皂苷的含
量。以时间为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲
线。
2． 2． 4 大孔树脂的最大吸附量的测定 大孔树脂对皂苷的吸附
量是有限的，配制 8(0，2，4，6，8，10，12，14 mg /ml)个浓度梯度的
样品液，当树脂完全达到吸附平衡时，计算总皂苷的吸附量，绘制
树脂静态吸附等温线，找出树脂的最大吸附量。
Ｒ1 =(C0 － C1)× V1 /V2 (1)
Ｒ2 = V × C2 /W × 100% (2)
Ｒ1 静态吸附量，mg /ml;C0 吸附前溶液中皂苷的浓度，mg /
ml;C1 吸附后溶液中皂苷的浓度，mg /ml;V1 料液体积，ml;V2 树
脂体积，ml;Ｒ2 静态解吸率，%;V 解吸液总体积，ml;W 静态吸附
的总量，mg;C2 解吸液中皂苷的浓度，mg /ml。
2． 3 动态吸附试验
2． 3． 1 绘制动态吸附曲线 通过静态吸附试验后确定 D －101 树
脂进行动态吸附研究。准确量取 15 ml D － 101 大孔树脂装柱，
用 7． 5 mg /ml芒萁皂苷提取液按照 2BV /h的流速上柱，并对流出
液进行收集，共收集 20 份，每份体积为 1BV。以流出液体积(横
坐标)和皂苷浓度(纵坐标)作 D －101 树脂动态吸附皂苷的曲线
图。按式(3)计算树脂的动态吸附量，按式(4)计算树脂的动态
解吸率。
Ｒ3 =(C0 － C1)× V1 /V2 (3)
Ｒ4 = V × C2 /W × 100% (4)
Ｒ3 动态吸附量，mg /ml;C0 吸附前溶液中皂苷的浓度，mg /
ml;C1 吸附后流出液中皂苷的浓度，mg /ml;V1 料液体积，ml;V2
树脂体积，ml;Ｒ4 动态解吸率，%;V 解吸液总体积，ml;W 动态吸
附的总量，mg;C2 解吸液中皂苷的浓度，mg /ml。
2． 3． 2 动态吸附条件的优化 考察料液 pH:取经过处理好的湿
D －101 树脂 15 ml装柱(15 cm × 1． 3 cm)，以不同 pH值、浓度为
7． 5 mg /ml的芒萁皂苷水溶液 18BV，按照 2BV /h的流速上柱，根
据料液和流出液二者的浓度计算大孔树脂的吸附量，确定 D －
101 树脂吸附芒萁皂苷的合适 pH值。
考察料液浓度的影响:取处理好的湿 D － 101 树脂 15 ml 装
柱，分别以 7． 5，9． 5，11． 5，13． 5，15． 5，20． 5，25． 5，30． 5 mg /ml 且
pH均为 5 的皂苷水溶液 18BV，按照 2BV /h 的流速上柱，根据料
液和流出液二者的浓度计算大孔树脂的吸附量，确定芒萁皂苷的
合适浓度。
2． 3． 3 动态洗脱条件的优化 确定最佳的洗脱溶剂:按照优化的
动态吸附条件对芒萁皂苷溶液进行上柱完毕后，关闭层析柱下端
的活塞 1 h以利于树脂充分吸附皂苷。待树脂充分吸附芒萁皂
苷后，分别以浓度为 40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇水
溶液各 3BV以 2． 5BV /h冲洗树脂单独进行洗脱来确定最佳的洗
脱溶剂。
确定洗脱流速:待树脂充分吸附芒萁皂苷后，用 3BV 70%乙
醇水溶液进行洗脱，流速设定分别为 1，2，3，4BV /h，以皂苷的洗
脱率来确定洗脱流速。
2． 4 验证实验 用 D － 101 大孔树脂柱对芒萁提取物中的皂苷
按照上述最优条件进行纯化，测定树脂纯化前、后的皂苷的含量。
2． 5 芒萁皂苷对 DPPH 的清除实验 在试管中依次加入 2． 5 ml
0． 5 mmol /ml的 DPPH溶液和 1． 5 ml 分析纯的甲醇，总体积 4． 0
ml，混匀避光 30 min，在 517 nm处测吸光度，记为 Ao;加入 2． 5 ml
0． 5 mmol /ml的 DPPH溶液和 1． 5 ml待测试样溶液，测定值记为
As;加入 2． 5 ml甲醇和待测试样溶液，测定值记为 Ar。以 BHT作
为阳性对照。按照下式计算 DPPH自由基的清除率。
DPPH清除率(%)= 1 －
As － Ar
Ao
× 100%
3 结果
3． 1 大孔吸附树脂的筛选 4 种树脂对芒萁皂苷的静态吸附与
解吸效果的比较结果见表 1 及图 1 ～ 2。由表 1 可知，不同的大孔
树脂对芒萁皂苷的吸附量从大到小依次为 D － 101、AB － 8、HZ －
803、HZ － 816。这是因为大孔树脂吸附的原理主要为物理吸附，
而吸附量存在很大差别的原因与各种大孔树脂的极性、树脂结
构、比表面积及孔径的差异密切相关。不同树脂所吸附皂苷的解
吸能力也不同，其中解吸能力最强的是 D － 101 树脂，解吸率达
到 97%;AB － 8 次之，解析率为 94%。综合吸附量与解析率两因
素，本实验选取 D －101 大孔树脂作为芒萁总皂苷纯化的载体。
3． 2 D － 101 大孔树脂的静态吸附动力学特征 在有充分时间吸
附的情况下，树脂可达到饱和吸附量。从图 3 可以看出，D － 101
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期
树脂为快速平衡型，即在起始阶段吸附量比较大，达到饱和只需
要 2． 5 h。由图 4 可知，D －101 树脂对芒萁皂苷的最大吸附量可
达到 43． 56 mg /ml。故 D －101 树脂比较适合纯化芒萁皂苷。
表 1 四种大孔吸附树脂对芒萁皂苷静态吸附和解吸性能的比较分析
树脂 极性
平均孔径 /
nm
比表面积 /
m2·g － 1
吸附量 /
mg·ml － 1
解析率
(%)
D －101 非极性 90 ～ 100 500 ～ 550 28． 18 97
AB －8 弱极性 130 ～ 140 480 ～ 520 26． 7 94
HZ －803 非极性 ～100 450 ～ 550 24． 7 88
HZ －816 非极性 70 ≥850 21． 67 71
图 1 四种树脂对芒萁皂苷的静态吸附量的比较
图 2 四种树脂对芒萁皂苷解吸率的比较
图 3 D － 101 大孔树脂的静态吸附动力学曲线
图 4 D － 101 大孔树脂最大吸附量
3． 3 D － 101 树脂动态吸附曲线 见图 5 ～ 6。
由图 5 可知，D － 101 树脂吸附皂苷在 1BV 至 15BV 以低浓
度泄露，从第 17BV开始，皂苷的泄露量明显增加，第 18BV时，泄
露液中的皂苷浓度已超过料液的 50%，因此，上柱料液体积以 18
～ 20BV为宜。
图 5 D － 101 树脂的动态吸附皂苷的曲线
图 6 pH值对皂苷吸附量的影响
3． 4 pH值对皂苷吸附量的影响 由图 6 可知，树脂的吸附量随
着料液 pH值从 3． 0 到 5． 0 呈增加趋势，但随着料液 pH值从 5． 0
到 7． 0 而呈下降趋势。由此可知，料液的酸碱度对吸附量有较大
的影响，且料液 pH值在 5． 0 左右有利于树脂对皂苷的吸附。引
起这一现象的原因可能与皂苷本身的酸碱性有关，当 pH 值 ＜ 5
时，皂苷的溶解度随着 pH 值增大而增大，分子形式的皂苷与树
脂的相互作用力变大，树脂对皂苷的吸附力也随之增大;当 pH
值为 5 时，树脂对皂苷的吸附量最大，原因可能是皂苷溶液呈弱
酸性，吸附方式是氢键吸附;当 pH 值 ＞ 5 时，浸提液中皂苷随着
pH值增大而以离子形式存在的逐渐增多，从而使皂苷的溶解度
明显增加，不易被树脂吸附。因此，以 pH 值为 5 的料液上柱较
适宜树脂对皂苷的吸附。
3． 5 料液浓度对皂苷吸附量的影响 由图 7 可知，料液浓度在
7． 5 ～20． 5 mg /ml时，树脂的吸附量随料液浓度的增加而增加;当
料液浓度超过 20． 5 mg /ml时，树脂的吸附量随着料液浓度的增加
而下降。原因可能是随着料液浓度的增加，芒萁皂苷在树脂中的
扩散能力降低。因此，本实验适宜的料液浓度为 20． 5 mg /ml。
图 7 料液浓度对皂苷吸附量的影响
3． 6 乙醇浓度的影响 由图 8 可知，乙醇浓度对芒萁皂苷的解吸
率影响不大，在 40% ～ 70%，解吸率随浓度增大而增大;70% ～
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90%，随着浓度增大而降低。因此，宜选用 70%左右的乙醇进行
洗脱。
图 8 乙醇浓度对解吸率的影响
3． 7 洗脱流速的影响 不同洗脱速度对皂苷解吸性能的影响如
图 9 所示。当流速从 1BV /h增加至 2BV /h时，解吸率有所提高，
但流速从 2BV /h增加，解吸率又降低。综合考虑解吸效果和洗
脱溶剂的用量以及时间等因素，宜选用 2BV /h进行洗脱。
验证实验结果表明，用 D －101 大孔树脂柱对芒萁提取物中
的皂苷按照上述最优条件进行纯化。结果表明，树脂纯化前、后
的干燥品中皂苷平均质量分数分别为 29． 3%和 64． 9%，纯化倍
数为 2． 2 倍。所选工艺操作简便、重现性好。
图 9 洗脱流速对解吸率的影响
3． 8 对 DPPH自由基的清除效果 用 D －101 大孔树脂纯化后的
芒萁皂苷对 DPPH 自由基的清除效果如图 10 所示。其效果比
BHT的要好。在浓度为 0． 1 mg /ml时，清除率即达到 93． 8%。
图 10 不同质量浓度的样品对清除 DPPH自由基的影响
4 结论
综上所述，D －101 型大孔树脂是一种比较理想的纯化芒萁
皂苷的树脂，最佳洗脱条件:流速为 2BV /h 时，料液浓度 20． 50
mg /ml，料液 pH值 5，最佳乙醇浓度为 70%。纯化后总皂苷含量
为 64． 9%。芒萁皂苷对 DPPH自由基有很好的清除效果，有良好
的抗氧化性。本研究对今后芒萁皂苷的进一步纯化分离奠定了
基础，也为今后的研究和生产应用提供科学依据。
参考文献:
［1］ 张明如，何 明，温国胜，等．芒萁种群特征及其对森林更新影响评
述［J］．内蒙古农业大学学报，2010，31(4):303．
［2］ 黄聪华，丁利君，马源源，等．芒萁总皂苷提取的响应面优化［J］．时
珍国医国药，2013，24(1):54．
［3］ 袁宜如，李晓云，邹峥嵘，等．芒萁水提取物对玉米种子萌发和幼苗
生长的影响［J］．安徽农业科学，2009，37(35):17434．
［4］ Liu ZF，Wu JP，Zhou LX，et al． Effect of understory fern (Dicranop-
teris dichotoma)removal on substrate utilization patterns of culturable
soil bacterial community in subtropical Eucalyptus plantations［J］． Pe-
dobiologia，2012，55(1) :7．
［5］ 郑宏钧，詹亚华．现代中药材鉴别手册［M］．北京:中国医药科技出
版社，2001:33．
［6］ Lee IK，Choi SU，Lee KＲ． Triterpene Saponins from Pleurospermum
kamtschaticum and their biological activity［J］． Chem Pharm Bull (To-
kyo)，2012，60(8) :1011．
［7］ Saha S，Walia S，Kumar J，et al． Structure － biological activity rela-
tionships in triterpenic saponins:the relative activity of protobassic acid
and its derivatives against plant pathogenic fungi［J］． Pest Manag Sci，
2010，29(3) :825．
［8］ Osbourn A，Gross ＲJ，Fiedl ＲA． The saponins － polar isoprenoids
with important and diverse biological activities［J］． Nat Prod Ｒep，
2011，28:1261．
［9］ Chen YF，Huang YQ． Ｒelationship between antioxidant and antiglyca-
tion ability of saponins，polyphenols，and polysaccharides in Chinese
herbal medicines used to treat diabetes［J］． Med Plants Ｒese，2011，5
(11) :2322．
［10］ 杨新河，刘仲华，黄建安，等．大孔吸附树脂纯化苦丁茶总皂苷的研
究［J］．食品与机械，2012，28(3):127．
·34·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期