全 文 ：＊ ［基金项目］济宁医学院２００８年青年科研基金项目
济宁医学院学报２０１１年１２月第３４卷第６期
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９７６０．２０１１．０６．００３
山东肿足蕨高效液相色谱指纹图谱初步研究＊
张华丽　朱　军　高桂花
（济宁医学院药学院，山东 日照２７６８２６）
　　摘　要　目的　建立山东肿足蕨药材的高效液相色谱指纹图谱，为其质量控制提供参考。方法　采用高效
液相色谱（ＨＰＬＣ）法，色谱柱ＶＰ－ＯＤＳ，流速１ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长２１５ｎｍ，柱温２５℃，用乙腈和水作为流动相，梯
度洗脱，测定了１０批山东肿足蕨样品。结果　得到了山东肿足蕨 ＨＰＬＣ指纹图谱。结论　用文中的最佳条件
可较全面地反映山东肿足蕨中的成分，为山东肿足蕨药材的质量控制提供参考。
关键词　山东肿足蕨；高效液相色谱法；指纹图谱
中图分类号：Ｒ９１７　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１０００－９７６０（２０１１）１２－３８９－０３
ＨＰＬＣ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　ｓｉｎｅｎｓｅ　ｌｗａｔｓｕｋｉ
ＺＨＡＮＧ　Ｈｕａ－ｌｉ，ＺＨＵ　Ｊｕｎ，ＧＡＯ　Ｇｕｉ－ｈｕａ
（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｃｏｌｅｇｅ，Ｊｉｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｉｚｈａｏ　２７６８２６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ
ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＲＰ－ＨＰＬＣ（ＤＡＤ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｐｏｄｅ－
ｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ　ｂｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：ｃｏｌｕｍｎ　ｏｆ　ＶＰ－ＯＤＳ，ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　１ｍＬ／
ｍｉｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　２１５ｎｍ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　２５℃ａｎｄ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ａｓ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ．１０ｂａｔｃｈｅｓ　ｏｆ
Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ　ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ａｃｑｕａｉｎｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｐｏｄｅｍａ－
ｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ　ｃａｎ　ｂｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ
ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　Ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ，ＨＰＬＣ，Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ
　　山东肿足蕨（Ｈｙｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔ－
ｓｕｒｉ），为金星蕨科肿足蕨属植物，生长于鲁西南的
山坡石缝中，民间俗称“治晕草”，仅此一味药（全
药）水煎服，能治疗头晕、恶心、呕吐等症，为济宁医
学院于２０世纪７０年代发现的新药用植物。经实
验证明，该药具有抑制肠平滑肌收缩，降低血压，抑
制中枢神经和抗乙酰胆碱等作用［１］。进一步研究
发现，山东肿足蕨有明显的抗生育作用，对豚鼠离
体妊娠子宫肌有明显的兴奋作用，对妊娠豚鼠终止
妊娠率为９４％［２］。经初步临床实验，口服该药的
水煎剂，对Ｓ梅尼埃综合征有效率为９５．１１％，对
胃神经官能症也有较高的疗效。经实验验证［３］，山
东肿足蕨含有黄酮甙、三萜成分、酚性成分以及糖
类、鞣质、生物碱等化学成分。由于人们对此药物
药用用途认识的较晚，所以其有效成分的研究，尚
有待进行。
目前国家药典采用定性或定量测定中药材中
活性成分或有效成分来评价其质量，但研究证明，
中药的疗效是来自其多种“活性成分”之间的协同
作用，甚至是“非活性成分”之间的协同作用或“生
克作用”。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因
此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴
别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全
面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与
数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。本实
验拟建立山东肿足蕨的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）指
纹图谱，为山东肿足蕨的质量标准提供参考。为民
医用药，道地药材的开发应用提供科学的依据。
１　材料与仪器
１．１　材料
山东肿足蕨药材样品共１０批（见表１），经济
宁医学院中药学教研室鉴定为山东肿足蕨（Ｈｙ－
ｐｏｄｅｍａｔｉｕｍ　ｓｉｎｅｎｓｅ　Ｉｗａｔｓｕｒｉ），去泥后干燥，将全
９８３
Ｊ　Ｊｉｎｉｎｇ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１１，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６
草、分离的根、茎、叶、分别粉碎，粗粉过筛后备用；
乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；
甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；
乙醇（分析纯，烟台三和化学试剂有限公司）；自制
重蒸水。
表１　山东肿足蕨药材样品来源
样品号 样品来源 样品号 样品来源
１ 山东嘉祥虎头山 ６ 山东曲阜尼山
２ 山东嘉祥鹰山 ７ 山东曲阜尼山书院桥
３ 山东嘉祥磨山 ８ 山东曲阜曼山
４ 山东嘉祥青山 ９ 山东曲阜尼山头
５ 山东嘉祥固山 １０ 山东邹城五里山
１．２　仪器设备
ＢＳ１１０Ｓ电子天平（北京塞多利斯天平有限公
司，Ｍａｘ为１１０ｇ，ｄ＝０．１ｍｇ）；ＦＷ１３５型中药粉碎
机﹙天津市泰斯特仪器有限公司﹚；电动吸引器
（上海医疗器械工业集团公司医用吸引器厂）；ＫＱ－
５００ＤＢ型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公
司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；
ＴＵ－１９０１双光束紫外可见分光光度计（北京普析
通用仪器有限责任公司）；ＬＣ－２０Ａ 高效液相色谱
仪（日本岛津制造所）。
２　实验方法
２．１　色谱条件
色谱柱：ＶＰ－ＯＤＳ，流动相：乙腈（Ｂ），水。梯度
洗脱：０～６０ｍｉｎ　１０％～１５％Ｂ，检测波长：２１５ｎｍ。
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；柱温：２５℃。
２．２　供试品溶液的制备
山东肿足蕨药材均匀粉碎，取药材粉末５ｇ，精
密称定，置圆底烧瓶中，加７０％甲醇６０ｍｌ，８８℃下
回流１．５ｈ，滤过，定容在１００ｍｌ容量瓶中，用微孔
滤膜（０．４５μｍ）滤过，即得。
２．３　重复性实验
取编号为１的样品５份作为供试品溶液，依法
检测，考察共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面
积的一致性。结果见表２，表３，其相对保留时间的
ＲＳＤ小于３％，主要共有峰面积的 ＲＳＤ不超过
５％，表明其重复性良好。
表２　重复性试验结果（保留时间）
峰号 第１ 次 第２ 次 第３ 次 第４ 次 第５ 次 平均值 ＲＳＤ／％
１　 １３．２５９　１３．１６８　１３．６４９　１３．１４４　１３．０４８　１３．２５４　 １．８
２　 ２７．４３９　２５．７４３　２６．３１５　２７．１１５　２７．６９７　２６．８６２　 ３．０
３　 ３８．１３８　３８．８９６　３８．６６１　３８．８５８　３９．４３９　３８．７９８　 １．２
４　 ５７．５７６　５８．５１４　５７．７３９　５６．３８２　５７．０４６　５７．４５１　 １．４
表３　重复性试验结果（峰面积）
峰号 第１ 次 第２ 次 第３ 次 第４ 次 第５ 次 平均值 ＲＳＤ／％
１　１１７９７９４　１１２７１９７　１１０６９５２　１１６９０７４　１１９７１１７　１１５６０２７　 ３．３
２　１３２１５７４　１３３１６４７　１３５４６７９　１３６４８９１　１３８９４７８　１３５２４５４　 ２．０
３　 ７６９５６０　７４７３０７　７５５０４９　７６７９５１　７５９６０１　７５９８９３．６　 １．２
４　１２４６３６８　１１９２７２３　１２６２４５１　１２３１５７４　１２７７６８８　１２４２１６１　 ２．６
２．４　稳定性实验
取编号为１的样品作为供试品溶液，每间隔２
ｈ检测１次，考察共有色谱峰的相对保留时间及相
对峰面积的一致性。结果见表４，表５，其共有色谱
峰的相对保留时间的ＲＳＤ均小于５％，相对峰面
积的ＲＳＤ均小于５％，初步判断供试品溶液在１０
ｈ内基本稳定。
表４　稳定性试验结果（保留时间）
峰号 第１ 次 第２ 次 第３ 次 第４ 次 第５ 次 平均值 ＲＳＤ／％
１　 １３．２６９　１３．１５４　１３．６２８　１３．１２１　１３．４４８　１３．３２４　 １．６
２　 ２７．２３７　２５．５２３　２５．４５３　２７．２１５　２７．６８９　２６．６２３４　 ３．９
３　 ３８．２３８　３８．７６４　３８．６１２　３８．８６４　３９．９５４　３８．８８６４　 １．７
４　 ５７．４４８　５８．５２５　５７．２３８　５６．３９４　５７．１２５　５７．３４６　 １．３
表５　稳定性试验结果（峰面积）
峰号 第１ 次 第２ 次 第３ 次 第４ 次 第５ 次 平均值 ＲＳＤ／％
１　１１６９５６９　１１３７６８４　１１０７５６２　１２３４１５５　１２０５６９４　１１７０９３３　 ４．３
２　１３２２３６１　１２９６５１５　１２５８９１０　１３２６９８４　１３８９４７８　１３１８８５０　 ３．２
３　 ７６２５９８　７５７３０７　７６５８９２　７６７９５１　７２６８９１　７５６１２８　 ２．２
４　１２０５８８９　１１０３２６９　１２２６８９４　１１２３６５９　１２０７６０３　１１７３４６３　 ４．８
２．５　山东肿足蕨药材样品的测定及指纹图谱的确
立
按２．１所示液相色谱条件测定１０批山东肿足
蕨药材，根据各样品图谱中色谱峰相对保留时间、
相对峰面积标定共有峰，建立山东肿足蕨药材的标
准指纹图谱，如图１所示。
图１　山东肿足蕨的ＨＰ　ＬＣ图谱
０９３
济宁医学院学报２０１１年１２月第３４卷第６期
３　结果与讨论
３．１　山东肿足蕨药材指纹图谱分析
参照峰的选择［４］：根据１０批供试品 ＨＰＬＣ图
谱所给出的相关参数，山东肿足蕨药材各类成分的
色谱峰在６０ｍｉｎ之内基本全部出现。共标出４个
共有峰，从指纹图谱中可以得出１号峰（保留时间）
≈１３ｍｉｎ，相对峰面积比较大，比较稳定，故选择１
号峰为参照峰。
共有峰的分析：不同产地肿足蕨药材指纹图谱
较为相似，但其中个别峰为某产地品种特有峰，对
于其特有峰无法进行较为准确的考察。对１０批肿
足蕨药材进行分析，结果如表６，表７所示，以１号
峰作为参照峰，各指纹峰的峰面积及相对峰面积、
保留时间及相对保留时间均具有较好的重现性。
但指纹峰的峰面积相差较大，可能是不同产地的药
材成分含量不同所致。
表６　１０批山东肿足蕨药材主要特征峰相对保留时间
峰
号
样品
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　１０
平均值 ＲＳＤ／％
１　 １．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　 ０．０
２　 ２．０６３　２．０４８　２．０６６　２．０３９　２．０３８　２．０５１　２．０５４　２．０５９　２．０５３　２．０３１　２．０５０　 ０．５５
３　 ２．５５１　２．５６９　２．４７８　２．２３４　２．２３６　２．４８４　２．４８５　２．４８３　２．４５２　２．４４４　２．４４２　 ４．７
４　 ４．６３９　４．００４　４．４５３　４．２０９　４．０２７　４．４９１　４．２３３　４．３２５　４．１８８　４．１７６　４．２７５　 ４．５
表７　１０批山东肿足蕨药材主要特征峰相对保留面积
峰
号
样品
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　 １０
平均值
１　 １．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　１．０００　 １．０００
２　 ０．３９１　０．３０６　０．１４４　０．５１７　０．５２０　０．４２３　０．１６０　０．２７２　０．４１９　０．７７８　 ０．３９３
３　 ０．３０９　０．５５５　０．３０５　０．６０７　０．６１４　０．３４６　０．１５６　０．２２２　０．３３７　０．２３１　 ０．３６８
４　 ０．２２７　０．５０１　０．０３７　０．６９９　０．７０３　０．５６７　０．３０９　０．３５６　０．５６２　１．７９３　 ０．５７５
３．２　讨论
３．２．１　提取方法的比较　对于山东肿足蕨的提取
方法，试验比较了水浴回流、超声和冷浸３种提取
方法对山东肿足蕨的提取效果［５］，根据高效液相色
谱图最终确定水浴回流的效果最佳。提取溶剂对
甲醇和乙醇的提取效果进行了考察，得到的色谱峰
并无较大差异，鉴于甲醇的毒性较大，最终选用乙
醇作为提取溶剂。
３．２．２　检测波长的选择　本实验采用２１５ｎｍ 作
为检测波长，是为了兼顾各个峰的吸收及峰形及分
离效果。文献报道［６］采用 ２３０ｎｍ、３００ｎｍ 或
３３０ｎｍ等进行测定。为了反应药材化学成分的全
貌，可使用不同的检测波长，突出各个特征峰，相互
参照辨认，并可避免图谱中仅有一种成分偏高的现
象。且在２１５ｎｍ波长下各峰的分离效果较好，因
此实验选用２１５ｎｍ作为检测波长。
３．２．３　流动相的选择　依据文献［７］，实验中考察
了甲醇—水、乙腈—水、乙腈—磷酸水、甲醇—磷
酸—水等多种流动相系统，实验结果表明，流动相
中加入磷酸分离效果无明显差异，在乙腈－水条件
下各色谱峰的分离度较好，且加入磷酸时基线漂移
程度较大，故选用乙腈—水作为流动相。曾尝试过
等度洗脱的可行性，对３０％、５０％、７０％的甲醇，
５０％、７０％的乙腈进行过考察，结果分离度、峰形等
均不如梯度洗脱理想，因此选用梯度洗脱。本文的
流动相先后考察了多个不同梯度洗脱，如０～
６０ｍｉｎ　１０％～９０％乙醇、０～６０ｍｉｎ　１０％～２０％乙
腈、０～６０ｍｉｎ　１０％～１５％乙腈，结果本文所用的梯
度最佳。
３．２．４　进样量的选择　分别进样５μｌ，１０μｌ，２０μｌ，
结果表明进样量１０μｌ，即可满足要求。柱流速选
择：结合文献考察了流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ和１ｍｌ／ｍｉｎ
发现流速１ｍｌ／ｍｉｎ为佳。
４　结论
本课题初步研究了山东肿足蕨的指纹图谱，要
满足对山东肿足蕨的全面质量管理，需要建立能够
反映山东肿足蕨内在质量的、全面的色谱指纹谱，
仍需进行进一步的实验探索和研究。
参考文献：
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［Ｊ］．济宁医专学报，１９７８，１（１）：３１．
［２］　王家英，张其桢 ．山东肿足蕨对梅尼埃综合征与胃神经官能
症的治疗研究［Ｊ］．济宁医专学报．１９７８．１（１）：２４．
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用实验研究［Ｊ］．济宁医专学报，１９８１，４（１）：１．
［４］　王少军，段启，曹君，等 ．茯苓皮中三萜酸类成分 ＨＰＬＣ指纹
图谱的方法学研究［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００５，１６（１）：
５３－５５．
［５］　粟晓黎，林瑞超，王兆基，等 ．中药鬼臼毒性成分 ＨＰＬＣ／ＵＶ
指纹图谱分析方法研究及与威灵仙、龙胆 ＨＰＬＣ图谱比较
［Ｊ］．中成药，２０００，１２（２２）：８１９－８２４．
［６］　王爱民，王永林，兰燕宇，等 ．荭草药材指纹图谱的研究［Ｊ］．
中成药，２００６，２８（１）：５－７．
［７］　田兰，程海燕，陈晓辉 ．黄芪药材的 ＨＰＬＣ指纹图谱［Ｊ］．沈
阳药科大学学报，２００８，２５（１２）：９７９－９８２．
（收稿日期　２０１１－１１－１５）
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