全 文 :中南药学 2013 年 1 月 第 11 卷 第 1 期 Central South Pharmacy. January 2013, Vol. 11 No. 1
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作者简介: 汪启炉,男,硕士研究生,主要从事临床药学研究工作,Tel:(0791)88848314,E-mail:luckyqilu@163.com *通讯作者:
李刚,男,副主任药师,硕士,主要从事医院药学工作,Tel:(0791)88848181,E-mail:ligang94@21cn.com
抱石莲 [Lepidogrammitis drymoglossoides(Baker)Ching,
Polypodiaceae] 为蕨类水龙骨科骨牌蕨属植物的全草,广泛分
布于我国长江流域以及贵州、广东、广西等省份,内含黄酮、
生物碱、甾醇、氨基酸及糖等活性成分,具有清热解毒的功
效 [1-2]。其作为民族用药较为常用,作为复方成分亦有研究,
如肝康颗粒。然而关于其生物活性成分的研究还很少,并且
还没有关于其建立标准化的方法,制约了它的进一步开发。
绿原酸(chlorogenic acid)是植物在有氧呼吸过程中合
成的一种苯丙素类物质 [3],具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗
癌以及降血压等药理作用 [4-7],被广泛用于食品加工、药品
以及化妆品生产等领域 [8-9]。温家根等 [10]在抱石莲中发现了
绿原酸,并建立了绿原酸的鉴别方法和含量测定方法,然而
有关抱石莲中绿原酸提取方法的研究还未见报道。为了有效
提取绿原酸,本研究采用了超声波提取法,以乙醇浓度、超
声时间、料液比、提取次数、pH等为影响因素,考察抱石
莲中绿原酸的提取工艺。
1 仪器与试药
B2200S 型超声波清洗器(500 W,上海岛通应用
科技有限公司);高效液相色谱仪(日本岛津公司,包
括 N3000色谱工作站,LC-10ATVP柱箱、手动进样器、
SPD-10AVP检测器 );AG285电子天平(瑞士梅特勒公司,
精确到 0.000 1 g);ZK-8213型真空干燥箱(西安禾普生物
科技有限公司);RE52型旋转蒸发仪(西安禾普生物科技
有限公司)。
超声法提取抱石莲中绿原酸
汪启炉 1,温家根 2,陈玉祥 3,李刚 1 *(1.解放军第九四医院药械科,南昌 330002;2.中南大学临床药理研究所,长
沙 410008;3.中南大学卫生部肝胆肠外科中心,长沙 410008)
摘要:目的 探讨抱石莲中绿原酸的最佳提取工艺。方法 建立高效液相法测定绿原酸含量,采用超声波提取的方
法对药材进行提取,以抱石莲中绿原酸得量为参考指标,采用单因素实验、正交实验和方差分析对提取工艺进行考
察。结果 绿原酸含量检测回归方程为 Y= 3.72×106X- 0.72×106 ,r= 0.999 7(7.8~ 390.0 μg • mL- 1)。最
佳提取工艺条件为:pH= 4.0,乙醇浓度 70%,超声时间 30 min,料液比 1 : 12,超声提取 2次,按此条件进行提取,
绿原酸得率为 1.67%(n= 3)。结论 利用单因素考察及正交试验的方法优化绿原酸的提取工艺,为抱石莲中绿
原酸的工业化提取和生产奠定了基础。
关键词:绿原酸;抱石莲;正交试验;提取工艺
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1672-2981(2013)01-0019-05
doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2013.01.006
Extracting chlorogenic acid from Lepidogrammitis drymoglossoides
(Baker) Ching by ultrasound method
WANG Qi-lu1, WEN Jia-gen2, CHEN Yu-xiang3, LI Gang1* (1. Department of Medical Apparatus, No.94 Hospi-
tal of the PLA, Nanchang 330002; 2. Institute of Clinical Pharmacology, Central South University, Changsha
410008; 3. National Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center of The Ministry of Health, Central
South University, Changsha 410008)
Abstract: Objective To investigate the optimal extraction process of chlorogenic acid (CGA) from Lepidogrammitis
drymoglossoides(Baker) Ching. Methods HPLC was used to determine the quantity of CGA. Ultrasound extraction was
used. Single factor experiment, orthogonal experiments and analysis of variance were all taken to optimize the extraction
process, with CGA content as the index. Results The regression curve for CGA analysis was Y= 3.72×106X- 0.72×106 ,
r= 0.999 7 (7.8- 390.0 μg • mL- 1). The optimal conditions for extracting were as follows: pH= 4.0, 70% ethanol con-
centration, 30 min ultrasound extraction, 1 : 12 solid-liquid ratio, twice. The yield of CGA was 1.67% (n= 3). Conclusion
Single factor experiment and orthogonal test can help optimize the extraction process of chlorogenic acid, which lays the
foundation for industrial extraction and production of CGA from Lepidogrammitis drymoglossoides.
Key words: chlorogenic acid; lepidogrammitis drymoglossoides; orthogonal test; extraction craft
Central South Pharmacy. January 2013, Vol. 1 No. 1 中南药学 2013 年 1 月 第 11 卷 第 1 期
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药材抱石莲(湖南邵阳药材公司,广东产,经中南大学
药学院生药教研室李劲平教授鉴定为蕨类水龙骨科骨牌蕨属
植物抱石莲的全草);绿原酸对照品(中国药品生物制品检
定所,批号为 110753-200413,纯度≥ 98%);乙腈(色谱纯,
美国 Tedia公司);无水乙醇等其他试剂均为分析纯(国药
集团化学试剂有限公司)。
2 方法与结果
2.1 绿原酸提取工艺
将抱石莲药材粉碎,过 40目筛,60 ℃下干燥过夜,再
称取 10 g干燥药材粉末,用一定体积乙醇溶液浸泡 24 h后进
行超声提取,合并提取液并定容,旋转蒸发仪 50 ℃下浓缩至
50 mL左右,最后定容至 100 mL,取 5 mL定容液经 0.45 μm
滤膜过滤,滤液进行色谱分析。
2.2 绿原酸含量测定方法
2.2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna C 18 (2)
(250 mm×4.6 mm,5 μm );流动相:为乙腈 -0.5%
磷酸(11 : 89, v/v);流速:1 mL • min- 1;检测波长:
327 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品 7.8 mg,
置于 10 mL量瓶中,加 50%乙醇溶液定容至刻度,摇匀,
得绿原酸浓度为 0.78 mg • mL- 1的对照储备溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 按表 3中试验号为 5的方案进行
提取,制备供试品溶液,并最终稀释至 100 mL,取 10 μL进
样分析。
2.2.4 线性关系 精密量取上述绿原酸对照品溶液适量,分别
稀释成浓度为 7.8、15.6、39.0、78.0、156.0、390.0 μg • mL- 1
的绿原酸溶液,进样体积 10 μL,测定各对照品色谱峰面积。
以对照品溶液的目标峰面积(Y)对浓度(X)进行回归分析,
绿原酸在 7.8~ 390.0 μg • mL- 1与峰面积线性关系良好,
得到的绿原酸回归方程为:Y= 3.72×106X- 0.72×106 ,
r= 0.999 7。抱石莲绿原酸提取液色谱分析见图 1,绿原酸
峰的塔板数> 10 000,分离度为 2.60。
2.2.5 精密度试验 取干燥后抱石莲粉末 1.0 g,按表 3中试
验号为 5的方案进行提取,精密取 10 μL,重复进样分析 6次,
测定绿原酸峰面积,RSD为 1.1%。
2.2.6 重复性试验 取同一批干燥后抱石莲粉末 6份,每份
1.0 g,按表 3中试验号为 5的方案进行提取,其平均绿原酸
含量为 1.4%,RSD为 2.0 %。结果表明本方法重复性较好。
2.2.7 稳定性试验 取“2.2.6”项下所制备的供试品溶液中
的一份,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定,分别于 0、2、
4、8、12、18、24 h注入色谱仪中,测定,记录每次测得的
绿原酸峰面积,峰面积 RSD为 1.6%。结果表明供试品溶液
在 24 h内稳定性良好。
2.2.8 回收率试验 精密称取 105.7 mg绿原酸,置于 100 mL
的容量瓶中,加入 70%乙醇至刻度,摇匀,配制成 1.057 mg •
mL- 1的绿原酸对照品溶液。精密称取 1 g抱石莲粉末(绿
原酸含量14.45 mg) 6份,分别添加14 mL绿原酸对照品溶液,
按表 3中试验号为 5的方案进行提取,0.45 μm滤膜过滤后,
按“2.2.1”项下色谱条件进行测定,结果见表 1。
2.3 抱石莲提取工艺单因素实验
分别以抱石莲提取工艺中乙醇浓度、超声时间、温度、
料液比和 pH值作为考察因素。除了变动的单因素外,均采
用预试验中各因素的合适条件:乙醇浓度 70%、超声时间
40 min、提取次数 2次,料液比 1 : 12、pH= 4。各因素的
考察指标均为所检测药材中绿原酸的含量。
2.3.1 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响 分别用 60%、70%、
表 1 回收率试验结果
Tab 1 Recovery of chlorogenic acid
样品中含
量(sample
content)
/mg
加入量
(added
amount)
/mg
测得量
(measured
content)/mg
回收率
(recovery)
/%
平均回收率
(average
recovery)/%
RSD
/%
14.45 14.80 28.67 98.0
98.8 1.6
14.45 14.80 28.41 97.1
14.45 14.80 28.87 98.7
14.45 14.80 29.11 99.5
14.45 14.80 29.69 101.5
14.45 14.80 28.58 97.7
80%的乙醇进行单因素考察,结果见图 2A。乙醇浓度对绿
原酸提取的影响较大,当乙醇浓度< 60%,所得绿原酸的含
量较低,可能是绿原酸在醇溶液中溶解性较大,且高浓度的
乙醇可以增加植物细胞膜通透性,使其中的次生代谢产物更
易溶解出来。然而当乙醇浓度过高时,一些醇溶性较大的杂
质便会影响绿原酸的溶出度,故用 80%乙醇提取时,绿原
酸含量明显下降。
2.3.2 超声时间对绿原酸提取率的影响 超声时间分别为
15、30 、45、60 min时 , 对绿原酸提取率的影响见图 2B所示,
当超声时间为 15 min时,绿原酸含量最小,可能是超声时间
太短,溶剂未充分浸泡植物细胞体,绿原酸溶出率低。当超
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 t/min
CGAA
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 t/min
CGAB
图 1 绿原酸色谱图
Fig 1 Chromatogram of chlorogenic acid
A. 抱石莲提取物色谱图(chromatogram of lepidogrammitis drymoglossoides extracts);B. 绿原酸对照品色谱图(chromatograms of chlorogenic acid
standard);CGA:绿原酸峰(chlorogenic acid peak)
中南药学 2013 年 1 月 第 11 卷 第 1 期 Central South Pharmacy. January 2013, Vol. 11 No. 1
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声时间在 30~ 45 min时,绿原酸溶出量较大,故所测绿原
酸含量高。绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定,高温加热易氧
化分解,超声时间过长,提取液温度过高,最终导致绿原酸
分解,含量有所降低。
2.3.3 提取次数对绿原酸含量的影响 从图 2C中可以看出,
超声提取 1次所得提取物中绿原酸含量较低。1次提取只能
提取部分绿原酸,而经过 2次提取后,所测得绿原酸的量明
显增高。提取超过 2次后,绿原酸含量已无明显增加,说明
过多的提取次数并不能提高绿原酸的提取效率,反而造成溶
剂的浪费以及仪器的损耗。
2.3.4 料液比对绿原酸含量的影响 料液比分别为 1 : 8、1 :
12、 1 : 16、1 : 20时,绿原酸提取率见图 2D,随着料液比的
增大,绿原酸的提取率也逐渐上升;但料液比> 1 : 16,绿
原酸提取率变化缓慢,料液比过大也会造成溶剂的浪费,导
致成本增加。
2.3.5 pH对绿原酸含量的影响 考察 pH为 2、3、4、5、6
时对绿原酸提取率的影响,结果见图 2E。pH对绿原酸的提
取效率影响较大,pH为 4时,绿原酸提取率最大。绿原酸
为一种多羟基邻酚酸,酸性条件下有利于绿原酸的析出,而
在碱性情况下会氧化成绿色醌类。
2.4 绿原酸提取的正交试验
根据单因素考察的结果,发现超声提取次数超过 2次,
绿原酸提取效率已经没有差别,且超声次数与超声时间有一
定的交互作用,故将超声提取次数固定为 2次,以减少试验
误差。选择乙醇浓度(A)、超声时间(B)、料液比(C)、
pH值(D)4个因素,各取 3个水平,按正交表 L9(34)正
交设计表,具体试验过程及结果见表 2和表 3,对结果进行
方差分析见表 4。
从表 1中各因素的极值结果可知,各因素对绿原酸提取
率大小的影响为:pH>乙醇浓度>超声时间>料液比,选取
各因素对应的最佳 K值水平,得抱石莲中绿原酸最佳提取
工艺为 D2A2B1C3,即 pH为 4,乙醇浓度 70%,超声时间 30
min,料液比 1 :16。由表 4方差分析结果可知,A和 D因
素对绿原酸提取效率的影响具有显著性,而 B因素和 C因素
对绿原酸提取效率的影响不显著,故 A、D因素应取正交试
验中最大的 K值水平,而综合单因素考察结果以及减少成本
简化生产工艺,绿原酸提取的最佳工艺应为:pH为 4,乙醇
浓度 70%,超声时间 30 min,料液比 1 : 12,超声提取 2次。
1 2 3 4 5 6
pH
0 1 2 3 4 5
次数
1 : 8 1 : 12 1 : 16 1 : 20
料液比
10 20 30 40 50 60 70
提取时间 /min
40% 50% 60% 70% 80% 90%
乙醇浓度
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1
绿
原
酸
含
量
/%
绿
原
酸
含
量
/%
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
绿
原
酸
含
量
/%
1.9
1.7
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
1.9
1.7
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
绿
原
酸
含
量
/%
绿
原
酸
含
量
/%
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
图 2 单因素试验
Fig 2 Single factor experiment
A. 乙醇浓度对所得绿原酸含量的影响(impact of ethanol concerntration on CGA content);B. 超声时间对所得绿原酸含量的影响(impact of
ultrasound time on CGA content); C. 提取次数对所得绿原酸含量的影响(impact of extraction time on CGA content);D. 料液比对所得绿原酸含
量的影响(impact of solid-liquid ratio on CGA content); E. pH对所得绿原酸含量的影响(impact of pH on CGA content )
A B
C D
E
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2.5 工艺验证
按“2.4”项下正交试验的最优方案,称取 10 g干燥药
材进行 3次平行试验,得到绿原酸的平均提取含量为 1.67%,
RSD为 1.24%。结果表明正交试验筛选的结果稳定,可靠。
3 讨论
抱石莲为蕨类水龙骨科植物,温家根等 [10]鉴定出抱石
莲中的活性成分绿原酸,同时本研究也进一步证实了该鉴定
结果。绿原酸既是抱石莲中的活性成分,也是抱石莲同科植
物石韦 [11]、瓦韦 [12]的有效成分,故推测绿原酸可能为水龙
骨科植物的重要次生代谢产物。本研究建立了抱石莲中绿原
酸的高效液相色谱分析法,该方法准确、稳定、有效,其精
密度RSD为1.1%,平均回收率为98.8%,稳定性RSD为1.6%。
由于抱石莲中物质含量较为复杂,紫外检测法难以准确分析
出绿原酸的含量,相比之下,高效液相检测法更为精确,故
本研究以高效液相法测得抱石莲提取液中绿原酸的含量为指
标进行单因素和正交试验。
目前,关于中药材的提取方法研究十分广泛,其中传
统的提取方法包括水提法、乙醇回流法、水提醇沉法、酶
解法等,然而传统方法提取绿原酸,须耗费大量时间和溶
剂。超临界 CO2流体萃取法是当今中药提取的重要技术,
使用该方法提取天然化合物优点众多,但由于绿原酸分子
极性较大,难溶于 CO2流体,很难用超临界 CO2流体对绿
原酸进行提取。超声波提取法利用超声波特殊的机械效应、
空化效应和热效应,通过增大介质分子的运动速度、增大
介质的穿透力以提取生物有效成分。该方法提取条件温和,
并可节约提取时间,减少溶剂损耗,适合对抱石莲中绿原
酸进行提取。绿原酸为苯丙素类化合物,在极性溶剂中溶
解度较大,所用提取媒介一般为水、乙醇和甲醇。考虑到
甲醇毒性较大,本实验采用了水和乙醇的混合溶剂做为提
取媒介,最终总提取时间为 1 h,所用总溶剂为原料的 24倍,
绿原酸得率> 1.60%。虽然,抱石莲中绿原酸含量不及金银
花和杜仲,但抱石莲药材生长环境广阔,民间产量高,价格
低廉,可作为绿原酸生产的重要原料。本研究对抱石莲中绿
原酸的含量进行分析,对抱石莲提取工艺进行了初步的探索
性实验,为绿原酸的工业化扩大生产(以抱石莲为原料)奠
定基础。
参考文献
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表 4 方差分析
Tab 4 Variance analysis
因素
(factor)
偏差平方
和(sum of
variance)
自由度
(degree of
freedom)
F比
(F
ratio)
F0.05
(2,2)
显著性
(signifi cance)
A 0.344 2 19.111 19.000 *
B 0.121 2 6.722 19.000
C 0.018 2 1.000 19.000
D 0.422 2 23.444 19.000 *
误差 0.02 2
注:*表明 P> 0.05。
Note:*indicating P> 0.05.
表 3 正交试验
Tab 3 Orthogonal experiment
试验号
(trial
number)
乙醇浓度
(ethanol
concentration)
/%
提取时间
(extraction
time)/min
料液比
(solid-liquid
ratio)
pH
绿原酸得
率(yield
of CGA)
/%
1 1(60) 1(30) 1(1 : 8) 1 (3) 1.12
2 1 2(45) 2(1 : 12) 2 (4) 1.37
3 1 3(60) 3(1 : 16) 3 (5) 0.77
4 2(70) 1 2 3 1.46
5 2 2 3 1 1.44
6 2 3 1 2 1.61
7 3(80) 1 3 2 1.57
8 3 2 1 3 0.76
9 3 3 2 1 0.94
k1 1.087 1.383 1.163 1.167
k2 1.503 1.190 1.257 1.517
k3 1.090 1.107 1.260 0.997
R 0.416 0.276 0.097 0.520
表 2 因素水平表
Tab 2 Level and factor
水平
(level)
乙醇浓度
(ethanol
concentration)/%
提取时间
(extraction
time)/min
料液比
(solid-liquid
ratio)
pH
1 60 30 1 : 8 3
2 70 45 1 : 12 4
3 80 60 1 : 16 5
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(收稿日期: 2012-07-08; 修回日期: 2012-08-22)
CYP2D6*10等位基因多态性对文拉法辛血药浓度的影响
杨丽蓉 1,刘天龙 2, 刘小雷 3* (1.内蒙古精神卫生中心,呼和浩特 010010;2.内蒙古医科大学附属医院,呼和浩特
010000;3.内蒙古医科大学药学院,呼和浩特 010110)
摘要:目的 旨在研究细胞色素 P450酶 2D6*10 (CYP2D6*10)基因多态性对文拉法辛血药浓度的影响。方法
随机选择 65例抑郁症患者为研究对象,提取其外周血中的 DNA并利用特异性的引物对其进行扩增,对得到的扩
增产物进行酶切,通过电泳表征酶切结果并分析 65例抑郁患者 CYP2D6*10基因的基因类型。根据所选择患者基因
类型的不同,将其分为 3组,即 A组:纯合突变(CYP2D6*10 /*14),B组:杂合体 [ CYP2D6*1(*2)/*14 ]及 C
组:野生型纯合体 [ CYP2D6*1(*2)/*5 ];各组患者口服文拉法辛 225 mg后,使用高效液相色谱仪测定患者文拉
法辛(VL)和 O-去甲文拉法辛(ODVL)的血药浓度以研究文拉法辛在不同基因携带者体内的代谢情况。通过汉
密尔顿抑郁量表(HAMD)和药物不良反应量表(TESS)来明确文拉法辛对不同 CYP2D6*10基因携带者的治疗效
果和产生不良反应情况。结果 电泳结果显示,在 65名患者中,纯合突变(CYP2D6*10 /*14)为 29例(44.6%),
杂合体([ CYP2D6*1(*2)/*14 ]为 17例(26.1%),野生型纯合体 [ CYP2D6*1(*2)/*5 ]为 19例(29.3%);3组间
CVL、CODVL及 CODVL/CVL比较均具有显著地差异(P< 0.05);根据 CODVL/CVL值可知,A组、B组及 C组对文拉法辛
的代谢类型分别为快型(EM)、中型(IM)及慢型(PM)。各组间 TESS评分和 HAMD评分差异具有统计学意义
(P< 0.05)。结论 不同 CYP2D6*10基因是通过决定抑郁症患者对文拉法辛的代谢类型而影响其血药浓度。
关键词:文拉法辛;CYP2D6*10;基因多态性;血药浓度
中图分类号:R968 文献标识码:A 文章编号:1672-2981(2013)01-0023-05
doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2013.01.007
Effect of CYP2D6*10 gene polymorphism on blood
concentration of venlafaxine
YANG Li-rong 1, LIU Tian-long 2, LIU Xiao-lei 3* (1. Inner Mongolia Mental Health Center, Hohhot 010010; 2. The
First Affi liated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010000; 3. Inner Mongolia Medical College,
Huhhot 010110)
Abstract: Objective To determine the effect of CYP2D6*10 gene polymorphism on blood concentration of venlafaxine.
Methods A total of 65 patients with dysthymia disorders were selected as the case group and DNA extracted from their
peripheral blood was amplified by PCR. The PCR products were digested by restriction endonuclease (HphI) and their
CYP2D6*10 genotypes were determined by electrophoresis. According to different genotypes, 65 patients were divided
into 3 groups: group A: CYP2D6*10 /*14, group B: [ CYP2D6*1(*2)/*14 ], and group C: [ CYP2D6*1(*2)/*5 ]. Af-
ter oral administration of 225 mg venlafaxine, blood concentration of venlafaxine and O-desvenlafaxine was detected by
HLPC to study the effect of different genotypes on blood concentration of venlafaxine. The therapeutic and adverse effects
of venlafaxine on the 65 patients were evaluated by HAMD and TESS. Results The 65 patients included 29 (44.6%) with
CYP2D6*10 /*14, and the percentage of patients with [ CYP2D6*1(*2)/*14 ] and [ CYP2D6*1(*2)/*5 ] were 26.1% and
29.3% respectively. The concentration of venlafaxine (CVL) , O-desvenlafaxine (CODVL) and CODVL/CVL among the 3 groups
had signifi cant difference (P < 0.05). According to CODVL/CVL, metabolism types of group A, group B and group C were
作者简介:杨丽蓉,女,副主任医师,主要从事心血管与免疫药理学研究,Tel:13015005800,E-mail:yanglirong0723@163.com * 通
讯作者:刘小雷,男,教授,硕士研究生导师,主要从事心血管与免疫药理学研究,Tel:13848717802,E-mail:lxlei56@126.com