全 文 ：蛋黄果基因组 DNA提取方法的研究
孙伟生 ,王松标＊　(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江 524091)
摘要　对从我国热区收集到的 34份蛋黄果种质资源进行基因组DNA提取 , 研究表明:CTAB 改良法能够有效除去蛋黄果组织中富含的
多糖 、蛋白质等高分子化合物 ,降低污染 ,获得高质量的基因组DNA。
关键词　蛋黄果;DNA提取;CTBA改良法
中图分类号　Q781　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)01-00157-02
　　蛋黄果(Lucuma nervosa)为山榄科榄属果树[ 1] ,又名蛋
果 、狮头果 、桃榄 ,原产于古巴和南美洲热带地区 ,主要分布
于中南美洲 、印度东北部 、缅甸北部 、越南 、柬埔寨 、泰国 、中
国南部。20世纪 30年代引入我国 ,在广东 、广西 、海南 、福建
和云南的大部分热带地区均有零星种植。
蛋黄果是热带 、亚热带地区稀有水果 ,果形美观 ,营养丰
富 ,富含磷 、铁 、钙 、维生素 C、蛋白质等营养物质及人体必需
的氨基酸。果肉富含淀粉 ,黄色至橙黄色 ,质地似蛋黄 ,有香
气 ,故称蛋黄果 。蛋黄果粗生易长 、耐旱抗病虫 、易早产丰
产。我国热带地区自然资源丰富 ,蛋黄果适栽范围广[ 2] 。
蛋黄果常以种子繁殖 ,个体间差异大[ 3] 。笔者收集国内
蛋黄果种质资源 ,通过分类 、比较 、评价进行栽培和育种。分
子标记技术可以准确快速地对植物种质资源进行分类评价 ,
而该技术的首要任务是提取高质量的植物基因组 DNA 。由
于蛋黄果新稍和幼嫩的组织中富含大量的蛋白质和单宁等
大分子化合物 ,给蛋黄果 DNA的提取带来困难 。该试验旨
在探索出一套高效提取蛋黄果基因组DNA的方法。
1　材料与方法
1.1　材料　供试材料来自于南亚热带作物研究所蛋黄果种
质资源圃 ,其详细品种 、来源地及征集情况见表 1。
1.2　方法　蛋黄果DNA提取方法为 CTAB 改良法。剪取蛋
黄果幼嫩的新稍 ,除去叶柄和茎干 ,称量 0.2 g叶片 ,用液氮
研至粉末 ,转入 2 ml离心管中 ,加入等体积CTAB 提取缓冲
液(2%CTAB , 100 mmol Tris·HCl(pH值 8.0),1.4mol NaCl ,1%
PVP ,20mmol Na2S2O3 ,2%β-巯基乙醇和等体积的氯仿/异戊
醇(24∶1),混匀后 , 65 ℃保温水浴 30 min 后 ,离心(12 000
r/min ,10 min ,4 ℃),取上清。冷至室温后 ,加入 1/3体积的 5
mol/L KAc溶液 ,充分混匀 ,冰上放置 30 min ,以沉淀蛋白和
多糖。12 000 r/min离心 20 min。取上清 ,加入等体积的饱和
酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),充分混匀 30 min后 , 12 000 r/min
离心 15 min ,取上清 ,重复该步骤 ,直至界面清晰。上清液中
加入 2倍体积异丙醇以沉淀 DNA ,挑出絮状DNA ,70%酒精
洗 3次 ,DNA在超净工作台上干燥后溶于 200 μl含 RNase(20
μg/ml)的高盐TE缓冲液(10mmolTris·HCl(pH 值8.0),1mmol
EDTA(pH 值 8.0), 1 mol NaCl)中 , 37 ℃水浴 30 min , 消化
RNA 。用 2倍体积无水乙醇和 1/10体积 3 mol NaAc(pH 值
5.2)沉淀DNA ,干燥后溶于 100 μl TE(pH 值 8.0)中 ,4 ℃保
存 ,备用 。
基金项目　中国热带农业科学院科技基金(Rky06727)。
作者简介　孙伟生(1979-),男 ,陕西泾阳人 ,硕士,助理研究员 ,从事果
树生物技术及热带果树育种科研工作。 ＊通讯作者。
收稿日期　2007-08-10
　　取 10μl DNA溶液 ,加水至 1 ml ,稀释 100倍后用北京 752
型紫外可见分光光度计测定 A260 、A280值 ,用 A260值初步计算
DNA的浓度 ,用 A260/A280计算 DNA 的纯度。取 5 μl 模板
DNA ,用 1%琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml溴化乙锭)在 1×TAE
缓冲液(0.04 mol Tris·HCl , 0.001 mol EDTA)中电泳(3 ～ 4
V/cm)。以已知含量的Marker DL 2 000为对照 ,检测DNA的
分子大小和浓度 ,准确调整到 10 ng/μl ,置于-20 ℃备用。
表 1　试验用蛋黄果种质资源品种及收集情况
Table 1　The germplasm resources and collection of testing Lucuma nervosa
序号
Serial
number
编号
No.
名称Name
(暂命名)
来源地
Source
征集地点
Collection location
征集
方式
Collection
method
　1 402 潮州种　　　　广东潮州果树所　　 广州热林所　　　　 接穗　
2 403 遂溪黄略种　　广东遂溪黄略镇　　 广东遂溪黄略镇　　 接穗　
3 404 遂溪黄略种　　广东遂溪黄略镇　　 广东遂溪黄略镇　　 接穗　
4 405 遂溪黄略种　　广东遂溪黄略镇　　 广东遂溪黄略镇　　 接穗　
5 406 保亭种　　　　海南保亭热作所　　 海南保亭热作所　　 嫁接苗
6 407 越南实生种　　越南实生种子　　　 广州热林所　　　　 砧木苗
7 408 保亭实生种　　海南保亭热作所　　 海南保亭热作所　　 砧木苗
8 409 云南元谋种　　云南元谋热作所　　 广州热林所　　　　 嫁接苗
9 301 保山圆果种　　云南保山经作所　　 云南保山经作所　　 接穗　
10 302 保山肾形种　　云南保山经作所　　 云南保山经作所　　 接穗　
11 303 保山椭圆形种　云南保山经作所　　 云南保山经作所　　 接穗　
12 304 广州桃形种　　广州花都花鸟市场　 广州花都花鸟市场　 圈枝苗
13 305 马来西亚桃形种 马来西亚　　　　　 马来西亚　　　　　 圈枝苗
14 410 广西 1号　　　广西热作所　　　　 广西热作所　　　　 接穗　
15 411 广西 2号　　　广西热作所　　　　 广西热作所　　　　 接穗　
16 412 广西 3号　　　广西热作所　　　　 广西热作所　　　　 接穗　
17 413 广西 4号　　　广西农科院百果园　 广西农科院百果园　 接穗　
18 414 广西 5号　　　广西农科院百果园　 广西农科院百果园　 接穗　
19 415 白沙 1号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
20 416 白沙 2号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
21 417 白沙 3号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
22 418 白沙 4号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
23 419 白沙 5号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
24 420 白沙 6号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
25 421 白沙 7号　　　海南白沙木棉基地　 海南白沙木棉基地　 接穗　
26 423 热农 2号　　　海南热作两院植物园 海南热作两院植物园 接穗　
27 425 热农 4号　　　海南热作两院植物园 海南热作两院植物园 接穗　
28 501 景洪 1号　　　云南西双版纳　　　 云南西双版纳　　　 接穗　
29 503 厦引 1号　　　福建厦门华侨引种园 福建厦门华侨引种园 接穗　
30 504 厦引 2号　　　福建厦门华侨引种园 福建厦门华侨引种园 接穗　
31 505 厦引 3号　　　福建厦门华侨引种园 福建厦门华侨引种园 接穗　
32 506 厦引 4号　　　福建厦门华侨引种园 福建厦门华侨引种园 接穗　
33 507 厦引 5号　　　福建厦门华侨引种园 福建厦门华侨引种园 接穗　
34 601 广果 1号　　　广东农科院果树所　 广东农科院果树所　 接穗　
2　结果与分析
2.1　紫外可见分光光度计检测结果　在CTAB 提取法[ 4-5]
的基础上 ,经过改进对收集到的 34份蛋黄果基因组DNA进
安徽农业科学 ,Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(1):157-158　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　马君叶
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.01.084
行提取纯化 。由表 2可知 ,高纯度的DNA A260/A280值为 1.8。
若 A260/A280值低于 1.8 ,则可能有蛋白质或脂类等污染;若
A260/A280值高于 1.8 ,则可能有 RNA 污染;若 A260/A280值在
1.6～ 1.8之间 ,则可以满足一般的PCR扩增要求。从表 2还
可以看出 ,A260/A280值为 1.54～ 1.89 ,而比值在 1.6～ 1.8范围
内的占 74%,即个别样品的纯度不满足 1.6～ 1.8的范围 ,但
偏差不大 ,需进一步纯化。DNA产率平均为 444 μg/g ,且各
样品偏差较小。DNA纯度和产率分析结果表明 ,该 DNA的
表2　蛋黄果基因组 DNA提取结果
Table 2　The extraction result of genomic DNA from Lucuma nervosa
编号
No. A260 A280 A260/A280
浓度
Concentration
μg/ml
DNA产率
DNA yield
μg/ g
402 0.227 0.132 1.72 911.9 456.0
403 0.157 0.093 1.68 872.6 436.3
404 0.188 0.113 1.66 893.6 446.8
405 0.281 0.158 1.78 928.8 464.4
406 0.161 0.096 1.67 875.8 437.9
407 0.323 0.189 1.71 938.1 469.1
408 0.131 0.083 1.59 847.3 423.7
409 0.261 0.148 1.77 923.4 461.7
301 0.318 0.168 1.89 937.1 468.6
302 0.108 0.069 1.57 814.8 407.4
303 0.408 0.250 1.63 951.0 475.5
304 0.096 0.052 1.85 791.7 395.9
305 0.167 0.101 1.65 880.2 440.1
410 0.255 0.147 1.73 921.6 460.8
411 0.171 0.096 1.79 856.7 428.4
412 0.104 0.060 1.73 807.7 403.9
413 0.089 0.057 1.56 775.3 387.7
414 0.173 0.103 1.67 866.5 433.3
415 0.235 0.137 1.71 914.9 457.5
416 0.137 0.085 1.60 854.0 427.0
417 0.448 0.271 1.66 955.4 477.7
418 0.142 0.093 1.54 859.2 429.6
419 0.116 0.068 1.71 827.6 413.8
420 0.307 0.170 1.80 934.8 467.4
421 0.417 0.225 1.86 952.0 476.0
423 0.157 0.089 1.76 866.5 433.3
425 0.212 0.125 1.70 905.7 452.9
501 0.180 0.105 1.71 888.9 445.0
503 0.166 0.100 1.65 879.5 439.8
504 0.402 0.222 1.81 950.2 475.1
505 0.253 0.143 1.77 920.9 460.5
506 0.159 0.094 1.70 874.2 437.1
507 0.148 0.080 1.85 864.9 432.5
601 0.427 0.263 1.62 953.2 476.6
提取方法较稳定 ,适合蛋黄果基因组DNA的提取。
2.2　DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果　采用改良 CTAB提取
法提取蛋黄果基因组DNA ,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测其质
量。从图 1可以看出 ,蛋黄果 DNA条带明亮清楚 ,条带整齐
单一 ,无 RNA和蛋白质污染 ,DNA没有降解。这说明该方法
提取的DNA质量高 ,可用于PCR扩增。
注:1为Marker DL 2000;2～ 14为蛋黄果 DNA。
Note:M indicates Marker DL 2000;2 ～ 14 indicate DNA from Lucuma
nervosa.
图 1　DNA电泳检测图谱
Fig.1　The map of DNA gel electrophoresis.
3　讨论
该研究提取蛋黄果基因组DNA的方法是在 CTAB 提取
法的基础上加以改进的。改进之处为 DNA粗提物水浴后 ,
加入高盐溶液 ,冰上沉淀蛋白质和多糖。主要原因是蛋黄果
为山榄科植物 ,其组织细胞中含有大量的蛋白质 、多糖和单
宁类大分子化合物 ,而按照常规的 CTAB提取法提取其基因
组 DNA时 ,除去多糖和蛋白质是在乙醇沉淀DNA后 ,再用高
盐溶液进行沉淀 ,会造成乙醇在沉淀 DNA 时也将多糖和蛋
白质沉淀 ,从而给后面 DNA的纯化带来困难 。采用改进后
的 DNA提取方法所提取的 DNA为乳白色 ,紫外分光光度计
检测结果在 1.6 ～ 1.8 。琼脂糖凝胶电泳后条带单一 、清楚 ,
能够满足PCR扩增和进一步的试验要求。所以 ,该方法可以
用于对山榄科植物等蛋白质 、多糖含量高的植物组织材料进
行基因组DNA提取。
参考文献
[ 1] 梁元冈,陈振光,刘荣光,等.中国热带南亚热带果树[M] .北京:中国
农业出版社, 2001.
[ 2] 马蔚红.火龙果、西番莲、蛋黄果优质高效栽培技术[M] .北京:中国农
业出版社 ,2002.
[ 3] 胡子有.蛋黄果引种栽培初报[ J] .云南热作科技 ,1992, 15(1):21-23.[ 4] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔.分子克隆指南[M] .3版.北京:科学出版
社 , 2002.
[ 5] 顾鸿雅 ,瞿礼嘉,明小天,等.植物基因与分子操作[M] .北京:科学出版
社 , 1995.
(上接第 156页)
穴/hm2 ,基本苗 67.5 万 ～ 90.5 万苗/hm2 。连作晚稻 ,秧龄
不超过 35 d ,密度为 45 万 ～ 52.5 万穴/hm2 , 150 ～ 180
万苗/hm2 。
4.3　合理施肥　施足底肥 ,占水稻总施肥量的 70%,以有
机肥为主;全生育期总肥量折尿素 450～ 525 kg/hm2 ,并配施
磷钾肥 ,施肥方法做到重前控后 ,减少后期氮肥用量。
4.4　科学水浆管理 ,防治病虫害　中后期干湿交替 ,后期
切忌断水过早 ,浸种消毒 ,加强秧田期稻飞虱防治 ,适时防
治稻瘟病。
参考文献
[ 1] 刘明放 ,钱国壬,黄伟忠,等.中熟晚粳稻新品种嘉绍 2号[ J] .中国种
业 ,2005(10):70.
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