全 文 ：文章编号:1001-4829(2009)01-0145-05
　　收稿日期:2008-11-04
　　基金项目:广西自然科学基金项目(桂科自 0339023)
作者简介:潘丽梅(1982-),女 ,广西藤县人 , 在读硕士研究生 ,
从事果树种质资源研究 , ＊为通讯作者。
龙荔基因组 DNA的提取及
ISSR-PCR体系的建立与优化
潘丽梅 1 ,朱建华 2＊ ,秦献泉1 ,彭宏祥2 ,卢美英 1
(1.广西大学农学院,广西 南宁　530005;2.广西农业科学院园艺研究所,广西 南宁　530007)
摘　要:应用改良的 CTAB法提取龙荔基因组 DNA, 探讨龙荔 ISSR-PCR扩增反应体系的建立和优化。结果表明 , 经过改良的
CTAB法提取龙荔基因组 DNA效果良好 ,所提取的 DNA纯度较高 ,符合 ISSR-PCR反应的要求;龙荔 ISSR-PCR最佳反应体系(反
应总体积 20μl):1 ×Bufer缓冲液(含适量 Mg2+), 1UTaqDNA聚合酶 , 0.20mmol/LdNTP, 0.25μmol/L引物 , DNA模板 70 ～
80ng/μl,退火温度 53 ～ 54℃。
关键词:龙荔;DNA提取;ISSR-PCR;分子标记
中图分类号:S667.1　　　文献标识码:A
EstablishmentandOptimizationofGenomicDNAExtraction
andISSR-PCRReactionSystemforDimocarpusconfinis
PANLi-mei1 , ZHUJian-hua2＊ , QINXian-quan1 , PENGHong-xiang2 , LUMei-ying1
(1.ColegeofAgriculture, GuangxiUniversity, GuangxiNanning530005, China;2.InstituteofHorticulture, GuangxiAcademyofAgricultural
Sciences, GuangxiNanning530007, China)
Abstract:TheimprovedCTABmethodwasappliedtoextractgenomicDNAofDimorcarpusconfinistodiscusstheestablishmentandoptimi-
zationofISSR-PCRreactionsystem.TheresultsshowedthattheefectsoftheextractiongenomicDNAbytheimprovedCTABmethodwas
well, thepurityofDNAwashigh, whichaccordedtotherequirementISSR-PCRReaction.TheoptimalreactionsystemwasestablishedforIS-
SR-PCRofDimocarpusConfinis, and20μlISSR-PCRsystemcontained1 ×TapBufer, 1UTaqDNApolymerase, 0.2mmol/LdNTP, 0.
25μmol/Lprimerand70-80ng/μltemplateDNA.
Keywords:Dimocarpusconfinis;DNAextraction;ISSR-PCR;Molecularmarker
　　龙荔 [ Dimocarpusconfinis(HowetHo)H.S.
Lo]为无患子科龙眼属野生果树 ,其植物学性状介
于龙眼 、荔枝之间 ,自古以来被认为是一种具有独特
风味的水果 [ 1] 。目前龙荔较多用作龙眼的砧木和
育种利用研究 [ 2 ～ 3 ] ,在分子 DNA水平上对其进行
遗传多样性研究还鲜有报道。
内部简单重复序列多态性 ISSR(InterSimple
SequenceRepeat)是一种基于微卫星序列发展起来
的分子标记技术 ,其原理是在 SSR引物的 3或 5
端加锚定碱基 ,扩增两侧具有反向排列的一段 DNA
序列 ,根据扩增条带的有无及相对位置来分析不同
样品间 ISSR比较标记的多态性 。由于其引物序列
较长 ,退火温度较高 ,具有 RAPD(RandomAmplified
PolymorphismDNA)的操作简单和 SSR(SimpleSe-
quenceRepeat)的多态性好的优点 ,而且该方法的重
复性比 RAPD高 ,在引物设计上比 SSR技术简单 ,
不需预先获知序列信息 ,而是用半随机引物进行扩
增 ,可获得丰富的多态性 ,比 RFLP(RestrictionFrag-
mentLengthPolymorphism)、RAPD提供更多的遗传
信息 ,已在植物种质鉴别 、遗传多样性评价 、亲缘关
系和遗传演化分析上广泛应用[ 4 ～ 6] 。
ISSR-PCR体系的关键技术是模板 DNA的提
取 ,只有高质量的 DNA才能扩增出理想的条带。龙
荔组织内富含多酚 、蛋白质 、多糖 、单宁 、色素等干扰
物质 ,这些物质不仅降低 DNA的提取效率 ,而且还
会影响后续的 PCR扩增 ,因此 ,去除干扰物质是 IS-
SR分子标记技术的基础。此外 ,由于 ISSR是基于
145
2009年 22卷 1期
Vol.22　　No.1　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2009.01.050
PCR扩增的 DNA分子标记技术 ,其反应结果受诸多
因素的影响 。在实际应用中 ,需针对研究的物种优
化扩增体系 ,以期获得多态性高 、稳定性好 、重复性
强的扩增结果。本研究是在传统 CTAB法[ 7]的基础
上改进了 DNA提取方法 ,探讨了 SSR-PCR体系中 5
种因素对扩增结果的影响 ,为龙荔分子标记和遗传
多样性研究提供科学依据与技术基础 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
DNA提取材料采自广西宁明 、隆安 、灵山 、防
城 、桂林 、灵川 、荔浦 ,取叶片置于干净封口袋放入冰
盒中 ,带回实验室置于 -30℃低温冰箱保存。
1.2　主要仪器和试剂
主要仪器:高速离心机(HeraeusBiofugstros),紫
外分光光度计 (EppendorfBiophotometer), Thermo
PCR仪 (GebeAmpTMPCRStystm9700),紫外凝胶
成像系统(GelDoc2000TM)。主要试剂:CTAB提
取液 , 1×TBE缓冲液 , TE缓冲液 , rTap酶 , dNTP(杭
州捷瑞),琼脂糖 (西班牙进口分装), 10 ×Bufer,
RNase酶 , GeneRulerTM 100 bpDNAladder等。 ISSR
引物由上海生工合成 。
1.3　试验方法
1.3.1　龙荔基因组 DNA的提取和检测 　①取 1 g
干净 、幼嫩的龙荔叶片于研钵中 , 加入少许 PVP
(Polyvinylpyrolidone,聚乙烯吡咯烷酮)后在液氮冷
冻下研磨成粉末 ,将粉末倒入 65℃预热的装有 800
μlCTAB提取缓冲液的 2 mL离心管中 ,加入适量
β -巯基乙醇 ,混匀后 65 ℃水浴 1 h,每隔 10 min摇
离心管 1次 。②取出离心管 ,加入 1/10体积的 KAc
冰浴 30 min, 12 000r/min离心 15 min。 ③取上清 ,
加入等体积氯仿 -异戊醇(24∶1),振荡混匀静置 10
min, 12 000 r/min离心 15 min。④吸取上清液 ,加
入等体积氯仿 -异戊醇(24∶1),振荡混匀静置 10
min, 12 000 r/min离心 15 min。重复上一步直到白
色界面消失 。⑤吸取上清液 ,加入 2倍体积预冷的
无水乙醇 ,轻轻混匀 , -20 ℃下静置 60 min。 ⑥12
000r/min离心 10 min,弃上清液 ,加入 400 μl加有
适量核糖核酸酶(RNase)的 TE缓冲液溶解 ,于 37
℃恒温水浴 30 min。 ⑦加入 1/10体积的 3 mol/L
NaAc,再加入 2倍体积预冷的无水乙醇 ,小心混匀
后 , -20 ℃下静置 30min。 ⑧12 000r/min离心 10
min,弃上清液 。 ⑨加入适量 75 %乙醇洗涤 2 ～ 3
次 ,倒去乙醇 ,室温下倒置 5 min,再正放 10 min,让
DNA自然晾干 。⑩加入 200 ～ 300 μlTE缓冲液 , -
20 ℃保存备用 。用紫外分光光度计检测法及琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA的浓度和纯度 。
1.3.2　ISSR-PCR反应体系的优化　从 100条引物
中筛选出 2条重复性较好的引物 (UBC851,
UBC856)。根据预试验结果 ,对影响 ISSR-PCR的
模板浓度 、退火时间及引物浓度等主要参数设置了
不同梯度处理 ,其扩增反应体系的优化主要采用单
因素试验 。 DNA模板浓度设 110、 100、 90、80、 70、
60、40、20 ng/μl8个浓度;TaqDNA聚合酶设 2.50、
2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.75、0.50 U8个梯
度;引物设 0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、
0.10 μmol/L8个浓度;dNTP设 0.45、0.40、0.35、
0.30、0.25、0.20、0.15、0.10 mmol/L8个浓度。每
一个合适的条件确定后 ,即作为后续优化的一个条
件。另外退火温度的设定采用梯度 PCR模式 ,自动
设定温度 48 ～ 55 ℃,生成温度梯度为 48.0、48.4、
49.3、50.5、52.2、53.6、54.4、55.0 ℃。
PCR反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性 1
min,退火 1 min, 72℃延伸 2 min,共 40循环 , 72 ℃
延伸 l0min, 4℃保存 。扩增产物于 2%的琼脂糖凝
胶电泳 , 100bpladderDNAMark作为标准分子量对照 ,
溴化乙锭(EB)染色 ,紫外凝胶成像系统照相留底。
2　结果与分析
2.1　DNA提取结果
经过提取与优化的龙荔基因组 DNA呈米白色
絮状和无色透明沉淀 ,电泳结果呈均一条带 ,说明提
取的 DNA较纯 ,蛋白质 、多糖和酚类等杂质基本去
除(图 1)。采用紫外分光光度法测定其浓度 ,结果
表明所提取的 DNA的 260/280比值在 1.75 ～ 1.86
范围内 ,纯度较高 ,符合 ISSR-PCR的要求 。
2.2　ISSR-PCR反应体系的优化
2.2.1　DNA模板浓度对 ISSR-PCR扩增的影响　
DNA模板浓度是影响 ISSR-PCR扩增效果的因素之
一。试验设置 8个模板浓度梯度 ,结果模板量在 40
～ 100 ng之间均得到较好的扩增结果(图 2),说明
ISSR反应对该 DNA模板浓度不太敏感 ,但在 70、80
1 ～ 10:龙荔基因组DNA
1-10:genomicDNAofDimocarpusConfinis
图 1　DNA电泳检测图
Fig.1　TheresultofgenomicDNAgelelectrophoresis
146 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
ng/μl时所扩增的条带亮度最高 。综合各方面因
素 ,选择 75ng/μl作为反应体系中模板的浓度 。
2.2.2　TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR扩增的
影响　在 PCR反应中 , Taq酶的用量受到反应体积 、
酶活性的影响 , Taq酶浓度过高不仅增加试验成本 ,
而且会导致非特异性产物增加 ,而浓度过低则会使
酶过早耗完 ,导致产物合成率下降甚至扩增失败 。
在 20μl的反应体系中 ,分别设置了 1.3、1.2、1.1、
1.0、0.9、0.8、0.7、0.6 U8个浓度梯度的酶用量分
析 。ISSR扩增图谱表明 , Taq酶用量为 0.6 ～ 0.9
U时条带较少且模糊不清 ,酶量在 1.0 ～ 1.3 U时
均可扩增出清晰可读的条带 ,而酶量在 1.0 U时扩
增效果最佳(图 5)。综合以上因素 ,在 20 μl的反
应体系中选择 1.0 U为最佳的 Taq酶用量 。
2.2.3　dNTP浓度对 ISSR-PCR扩增的影响　dNTP
是 ISSR-PCR反应的原料底物 。dNTP浓度过低会
降低合成效率 ,过高则导致聚合酶错误掺入 ,造成浪
费。根据图 4显示 , dNTP浓度为 0.10 ～ 0.35
mmol/L时均有扩增产物 ,而当其浓度大于 0.35
mmol/L时 ,扩增的条带较少且模糊不清。 dNTP浓
度为 0.2 mmol/L时扩增的条带最清晰 ,为最适浓
度。
2.2.4　引物浓度对 ISSR-PCR扩增的影响 　引物
浓度的高低也是 PCR反应中的影响因素。如图 5
所示 ,引物浓度为 0.10 ～ 0.20 μmol/L时 ,扩增条
带较少;引物浓度为 0.25 ～ 0.40 μmol/L时 ,扩增
结果相同;而当引物浓度为 0.25 μmol/L时 ,条带最
清晰明亮;引物浓度为 0.40 μmol/L时 ,条带减弱甚
至缺失。因此 ,本研究选择 0.25 μmol/L引物浓度
作为龙荔 ISSR反应的最佳浓度。
2.2.5　退火温度对 ISSR-PCR扩增的影响 　退火
温度的高低不仅直接影响到引物与模板 DNA的特
异性结合 ,而且明显影响到 ISSR-PCR扩增谱带式
1471期 　　　　　　潘丽梅等:龙荔基因组 DNA的提取及ISSR-PCR体系的建立与优化
1 ～ 8:退火温度(℃),依次是 55.0、54.4、53.6、52.2、50.
5、 49.3、48.4、48.0,
1-8:AnnealingTemperaturegradient(℃), folowedby55.
0, 54.4, 53.6, 52.2, 50.5, 49.3, 48.4, 48.0
图 6　退火温度对 ISSR-PCR扩增的影响
Fig.6　EfectofAnnealingTemperatureonISSR-PCR
样。为建立良好的 ISSR-PCR扩增体系 ,本试验先
根据原先的 PCR反应条件进行引物的初筛 ,选择能
看到清晰条带的引物 ΜBC851进行退火温度的确
定 。如图 6所示 ,当退火温度为 48.0 ～ 49.3 ℃时 ,
扩增的条带亮度弱且主带缺失;退火温度为 50.5℃
时 ,条带亮度增强但主带亮度仍较弱;退火温度为
52.2 ～ 55.0 ℃时 ,扩增的条带较多且主带清晰 ,但
以 53.6 ℃时扩增效果最佳。因此 ,龙荔 ISSR-PCR
扩增的最适退火温度为 53.6 ℃。
综合以上结果得出 ,龙荔 ISSR扩增的最佳反应
体系为:1 ×Bufer缓冲液(含适量 Mg2+), 1 UTaq
DNA聚合酶 , 0.20 mmol/LdNTP, 0.25 μmol/L引
物 , DNA模板 70 ～ 80 ng/μl, ddH2O补足至体积为
20 μl。反应循环参数为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃
变性 1min, 53 ～ 54℃退火 1min, 72℃延伸 2min,
循环 40次 , 72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存 。运用上述
优化条件对 10个龙荔品种进行 ISSR-PCR扩增 ,获
得了较好的 ISSR-PCR指纹图谱(图 7),表明优化确
立的 ISSR-PCR反应体系稳定可靠 , 可用于龙荔品
种的分子鉴定和遗传关系分析等研究 。
3　讨　论
　　龙荔为龙眼的近缘植物 ,其组织中同样富含酚
类 、多糖 、单宁及色素等物质 ,其中多酚类物质氧化
后会与 DNA结合 ,使得到的 DNA呈现棕褐色沉淀 ,
难以去除和溶解 [ 8 ～ 10] ,用传统的 SDS和 CTAB法提
取 DNA时 ,酚类 、多糖等物质包裹并结合了部分
DNA,使其不能释放 ,严重影响了 DNA的纯度 ,达不
到后续分子研究的要求。因此 ,在龙荔基因组 DNA
的提取过程中 ,最关键的问题是防止酚类物质的氧
化及多糖类物质的污染。本试验参照传统 CTAB
法 ,主要改进之处在于样品研磨过程中加入了 PVP,
图 7　引物 UBC851对 10份龙荔种质材料的 ISSR-
PCR扩增结果
Fig.7　AmplificationresultsofISSR-PCRon10speciesofDi-
mocarpusconfinesusingtheprimerUBC851
研磨后加提取液时同时加入 β -巯基乙醇。 PVP是
酚的络合物 ,能有效去除多酚 ,减少酚的污染;β-巯
基乙醇是一种抗氧化剂 ,其作用是与多酚物质竞争
氧 ,有效防止酚氧化成醌类物质 ,避免褐变[ 8] ,因此
两种物质都能很好地防止酚类物质的氧化。多糖污
染是木本植物 DNA提取中最常遇到的问题 ,多糖污
染的 DNA呈粘稠胶状 ,不但给实验操作带来不便 ,
更重要的是多糖对反应体系中的酶活性产生抑制作
用 ,严重影响分子生物学研究的下游工作 [ 9] 。因
此 ,本试验在水浴后加入 1/10体积的 KAc,亦是在
传统 CTAB法基础上所作的另一改进 ,使得多糖等
次生代谢物质首先被去除 ,所提取的 DNA完全符合
ISSR-PCR的要求。
ISSR标记技术和 RAPD原理比较相似 ,所不同
的是 ISSR所用引物序列来源于简单重复序列区域 ,
比 RAPD引物序列长 ,退火温度高。乔玉山等 [ 11 ]和
Jonsson等[ 12 ]的研究认为 , ISSR标记比 RAPD检测
多态性更为灵敏 ,反应系统更为稳定。但 ISSR扩增
易受多种因素的干扰 ,如模板 DNA浓度 、Taq酶量 、
dNTP浓度 、引物浓度以及退火温度等 。因此 ,在研
究时应先建立起合适的反应体系并进行优化 ,以获
得适合该物种的重复性和可靠性较高的 ISSR谱带。
本试验采用单因素完全试验设计 ,逐一研究各因素
不同处理水平的影响 ,所建立的 ISSR反应体系为该
种分子标记在龙荔乃至龙眼遗传育种领域的应用提
供了技术支持 。
本试验同时表明 ,模板浓度对龙荔 ISSR反应影
响最小 ,在所设的几个浓度梯度中均扩增出清晰的
条带 ,而 TaqDNA聚合酶浓度 、引物浓度 、dNTP浓
度以及退火温度对该体系的影响较为明显 。 Taq
DNA聚合酶的用量直接关系到试验结果 ,量多不仅
增加试验成本而且容易产生非特异性扩增产物 ,量
少则会使酶过早地消耗完 ,产物合成效率低。本试
148 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
验在 20 μl反应体系中只用 0.25 U的 TaqDNA聚
合酶就能获得稳定清晰的谱带。引物浓度也会对
PCR产物产生明显的影响 ,当引物浓度太低 ,不能
进行有效的扩增 ,浓度太高会增加引物二聚体的形
成 ,导致条带不稳定及清晰度下降。 dNTP作为 PCR
反应的原料之一 ,选择合适的浓度至关重要 。而引
物的退火温度也极大地影响着 ISSR反应的进行 ,由
于引物碱基序列长短不同 ,使得引物的退火温度也
不尽相同 ,对于 ISSR引物的退火温度 ,一般根据引
物的 Tm值浮动 1 ～ 3℃。当然 ,影响龙荔 ISSR-PCR
反应产生良好清晰带型的因素很多 ,在具体的实验
过程中 ,不同的系统构建和优化需要灵活调节 ,只有
这样才能得到分析所需的谱带 ,得出可靠的结果 ,满
足后续研究的要求。
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(责任编辑　林　涛)
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