全 文 ：马比木根中喜树碱含量的 HPLC测定方法
蒲尚饶 ,杨朗生 ,蹇 凯 ,马明东　(四川农业大学都江堰分校 ,四川都江堰 611830)
摘要　[目的 ]建立马比木根中喜树碱含量的测定方法。 [方法]采用高效液相色谱法。色谱柱为SHIM-PACKVP-ODSC18(250.0mm×
4.6mm, 5.0μm),流动相为甲醇-水(50∶50, V/V),流速 1.0ml/min,检测波长 254nm,柱温 40℃。 [结果 ]喜树碱进样量在 0.2 ～ 1.0
μg时 ,与峰面积线性关系良好(r=0.999 5);回收率(n=9)为 99.8%～ 101.3%, RSD为 0.56% ～ 1.32%。 [结论]该方法简便、快速、准
确 ,适用于马比木的质量控制。
关键词　高效液相色谱法;喜树碱;马比木
中图分类号　S718.43　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)06-02934-02
DeterminationMethodofCamptothecinContentinRootsofNothapodytespittosporoides(Oliv.)SleumbyHPLC
PUShang-raoetal　(DujiangyanSchoolofSichuanAgriculturalUniversity, Dujiangyan, Sichuan611830)
Abstract　 [ Objective] TheresearchaimedtoestablishaHPLCmethodfordeterminingthecontentofcamptothecinintherootsofNothapo-
dytespittosporoides(Oliv.)Sleum.[ Method] TheseparationwasmadeonaSHIM-PACKVP-ODSC18 column(250.0mm×4.6 mm, 5.0
μm)withmethanol-water(50∶50, V/V)asthemobilephaseataflowrateof1.0 ml/minand40℃.Thedetectivewavelengthwassetat254
nm.[ Result] Thesimplesizeofcamptothecinhadagoodlinearrelationshipwiththepeakareasintherangeof0.2-1.0μg(r=0.999 5).
Therecoverywas99.8%-101.3%, withRSDof0.56%-0.98%(n=9).[Conclusion] Thismethodisrapid, simpleandaccurate, which
wassuitableforthequalitycontrolofNothapodytespitosporoides(Oliv.)Sleum.
Keywords　 HPLC;Camptothecin;Nothapodytespitosporoides(Oliv.)Sleum
基金项目　四川农业大学院级攻关项目。
作者简介　蒲尚饶(1963-),男 ,四川都江堰人 ,副教授 ,从事药用植物
研究。
收稿日期　 2009-10-23
　　马比木 [ Nothapodytespitosporoides(Oliv.)Sleum.] ,为
茶茱萸科假柴龙属植物 ,灌木或小乔木 ,分布于贵州 、湖南 、
湖北 、四川等地 [ 1] 。喜树碱(camptothecin, CPT)是我国特有
树种喜树(CamptothecaacuminataDecne.)中所含有的喹啉类
衍生物生物碱 ,具有显著的抗癌活性 ,目前已有 4种以喜树
碱为前体合成的喜树碱衍生物获得美国食品和药物管理局
(FDA)批准用于临床治疗结肠癌 、直肠癌和复发性卵巢
癌 [ 2-3] 。喜树碱自 Wal等首次从喜树植物(Camptothecaacu-
minataDecne.)中分离出以来 ,国内外有关喜树碱提取分离
和含量测定的研究已有许多报道 [ 4-11] ,喜树碱的生产也一直
是以喜树的种子为原料。然而近年来 ,许多喜树碱生产厂家
却改用马比木的根提取制备喜树碱 ,究其原因却未见有相关
报道。笔者以马比木根为原料 ,制备了喜树碱单体;采用
HPLC法测定马比木根中喜树碱的含量。该方法操作简便 、
准确性高 、稳定性好 ,适用于马比木中喜树碱的含量测定。
1　材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　植物材料。马比木生料由成都邦普生物技术有限公
司提供 ,其形态由四川农业大学易同培教授鉴定 ,确定为马
比木。
1.1.2　试剂。喜树碱对照品由四川农业大学天然产物实验
室制备 ,含量为 98.6%;甲醇(色谱纯);重蒸水(自制);硅胶
(100 ～ 200目 ,青岛海洋化工厂);其他试剂均为分析纯。
1.1.3　仪器。高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括 LC-
10ATvp输液泵 , SPD-10Avp可变波长紫外检测器 , CTO-10AS
柱温箱 , N2000色谱数据处理系统;TU-180PC紫外 -可见分
光光度计(北京普析通用仪器有限公司);超声器(昆山超声
仪器有限公司), Eppendorfcentrifuge5804R离心机(德国)。
1.2　方法
1.2.1　喜树碱单体的制备。将马比木根 60 ℃烘干 ,粉碎后
过 40目筛 ,取马比木根粉 1 kg,依次加入 10、8、6L的 80%乙
醇回流提取 3、2和 1 h,合并 3次提取滤液 , 70 ℃减压浓缩回
收乙醇 ,得浓缩液 1 L。将浓缩液用氯仿萃取 5次 ,每次用氯
仿 0.4L,分出氯仿液 ,常压回收氯仿至 50ml左右 ,加 30g层
析硅胶拌匀 , 70℃左右烘干 、磨细 ,放入预先装好 200g硅胶
柱的上端 (Υ35 mm×800 mm),用混合液 (氯仿∶甲醇 =
100∶1)洗脱 ,每 100 ml收集 1瓶 ,薄层检测(展开剂为氯
仿∶甲醇 =98∶2,紫外光检测),收集合并合格部分 ,浓缩至有
大量晶体析出为止 ,静置 ,次日真空抽滤得结晶 ,将结晶用
300ml混合液(甲醇∶氯仿 =1∶1)回流溶解 1 h,趁热过滤 ,滤
液浓缩至有大量晶体析出为止 ,静置过夜 ,次日真空抽滤 , 60
℃真空烘干 ,得产品 0.72g。该产品经中国科学院成都生物
研究所质谱与核磙共振分析 ,鉴定为喜树碱 ,分子式为
C20 H16O4N2 ,分子量为 348.34,喜树碱含量为 98.60%。
1.2.2　色谱条件 。色谱柱:SHIM-PACKVP-ODSC18 (250.0
mm×4.6 mm, 5.0μm);流动相为甲醇 -水(50∶50);流速为
1.0ml/min;柱温 40℃;进样量为 10μl;检测波长为 254nm。
在该色谱条件下 ,喜树碱对照品溶液和样品溶液的色谱图见
图 1。
1.2.3　对照品溶液的配制及标准曲线的制备。精密称定喜
树碱对照品 5.0 mg,置于 50ml量瓶中 ,加甲醇适量 ,超声波
助溶后用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,作为对照品储备液(0.1
mg/ml),备用 。精密吸取喜树碱对照品储备液 2.0、4.0、6.0、
8.0、10.0ml,分别置于 10 ml量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇
匀 ,即得系列标准溶液。分别精密吸取系列标准溶液各 10
μl,按上述色谱条件进行分析。以进样量 (μg)为横坐标
(X),色谱峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。
1.2.4　供试品溶液的制备。将马比木根 60 ℃烘干 ,粉碎后
过 40目筛。取粉末约 1 g,精密称定 ,置于圆底烧瓶中 ,用甲
醇提取 3次 ,每次 10 ml, 60℃回流 3、2、1h,离心(转速 5 000
责任编辑　李菲菲　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(6):2934-2935, 2942
r/min, 5 min),合并离心液于 50 ml量瓶中 ,用甲醇稀释至刻 度 ,摇匀 , 0.45μm滤膜滤过 ,即得供试品溶液。
图 1　对照溶液 (a)和供试溶液(b)色谱图
Fig.1　 Chromatogramsofcontrolsolution(a)andtestsolution(b)
1.2.5　精密度试验 。精密吸取同一喜树碱标准溶液 10 μl,
重复进样 6次 ,记录色谱图 ,测定峰面积 。
1.2.6　重复性试验 。取同一批马比木根 ,按 “1.2.4”方法平
行制备供试品溶液 5份 ,按上述色谱条件进样 ,测定峰面积。
1.2.7　稳定性试验。对同一供试品溶液 ,分别在室温下放
置 0、2、4、6、8、10、12 h后进样 ,每次 10 μl。记录色谱图 ,测
定峰面积。
1.2.8　回收率试验。取含量已知的马比木粉末(根部喜树
碱的含量 1.26 mg/g)0.25g,共 9份 ,精密称定 , 3份为 1组 ,
按低 、中 、高浓度分别精密加入喜树碱对照品贮备液 1.5、
3.0、4.5ml,按 “1.2.4”所建立的方法制备供试溶液 ,按上述
色谱条件进样 ,测定峰面积 ,计算喜树碱的含量 ,并分别根据
加入量计算平均回收率和 RSD。
1.2.9　样品含量测定。取 4个批次马比木的根 , 60℃烘干 ,
粉碎过 40目筛 ,每个批次各取 3份(每份约 1 g),精密称定 ,
按 “1.2.4”所述方法制备供试品溶液 。在该研究的色谱条件
下 ,进样 10 μl,分别测定峰面积 ,用回归方程计算各样品中
喜树碱的含量及 RSD。
2　结果与分析
2.1　标准曲线的绘制　试验制得标准曲线的回归方程为:
Y=5.15×106X-7.49×103 (r=0.999 5)。结果表明 ,当喜
树碱的进样量在 0.2 ～1.0 μg时 ,与峰面积线性关系良好。
2.2　精密度试验　试验得出 ,其峰面积相对标准偏差
(RSD)为 0.85%,表明色谱系统精密度良好。
2.3　重复性试验　试验计算出喜树碱的平均含量为
0.126%, RSD为 1.70%,表明试验重复性良好。
2.4　稳定性试验　试验测得 , 其峰面积的 RSD为 0.98%,
表明样品溶液在 12 h内的稳定性良好 。
2.5　回收率试验　试验计算出 ,加入贮备液 1.5、3.0、4.5ml
时 , 3个浓度的平均回收率分别为 99.8%、101.3%、100.3%;
RSD分别为 0.56%、0.98%、1.32%。
2.6　样品含量测定结果　在该研究的色谱条件下 ,测得各
样品中的喜树碱含量及 RSD见表 1。
3　结论与讨论
喜树碱溶解于甲醇 、乙醇 、氯仿等有机溶剂 ,由于甲醇毒
性太大 ,因此在喜树碱单体制备时 ,选择乙醇作为提取溶剂 。
喜树碱含量测定时 ,考虑到 HPLC分析时的流动相为甲醇 -
水混合液 ,因此以甲醇为提取溶剂 ,并对比了 3种提取方法
(超声提取 、60 ℃回流提取和室温搅拌提取)的提取效果 ,试
验结果表明 , 60℃回流提取的提取效率高。
表 1　马比木根中喜树碱的含量(n=3)
Table1　ThecontentofcamptothecininrootsofNothapodytespit-
tosporoides(Oliv.)Sleum
批号
BatchNo.
喜树碱含量∥%
Contentofcamptothecin
RSD
%
1 0.126 1.10
2 0.123 1.60
3 0.125 1.30
4 0.122 1.50
　　采用紫外分光光度计测定喜树碱对照品的紫外光谱 ,试
验结果表明 ,喜树碱最大吸收波长为 254nm,该试验选择 254
nm为检测波长。在流动相的优化中 ,选用了甲醇 -水的体
系 ,以不同配比(70∶30、65∶35、60∶40、50∶50、40∶60)进行了考
察 ,并与文献报道的方法 [ 7]比较。结果表明:甲醇的比例越
高 ,喜树碱峰保留时间越短 ,当甲醇∶水(50∶50)时 ,出峰时间
适中 ,色谱峰形好 ,喜树碱的色谱峰与邻近杂峰的分离度大
于 1.5,理论塔板数大于 3 000。
该研究用马比木的根为原料 ,制备喜树碱单体和测定喜
树碱的含量 。在所测定的 4个批次样品中 ,喜树碱含量在
0.122%～ 0.126%。证明马比木根中富含喜树碱 ,是生产喜
树碱的好原料。所建立的高效液相色谱法测定马比木根中
喜树碱的含量 ,具有方法简便 、快速 、准确的特点 ,为马比木
的质量控制提供了可靠的方法。
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(下转第 2942页)
293538卷 6期　　　　　　　　　　　　　　　　蒲尚饶等　马比木根中喜树碱含量的 HPLC测定方法
5　竹节参及近似品种中其他成分含量
5.1　含氮化合物含量　20世纪 80年代研究表明 [ 19] ,黔产
竹节参 16种氨基酸总量为 13.704%,其中 7种必需氨基酸
总含量为 4.777%,占氨基酸总量的 34.890%,酸性氨基酸含
量为 3.611%,中性氨基酸为 7.823%。谷氨酸 、天冬氨酸 、脯
氨酸 、亮氨酸 、精氨酸 、赖氨酸含量相对较高。陈永波等 [ 22]
利用高效液相色谱和红外光谱法检测鄂产竹节参中的 17种
氨基酸 ,其中门冬氨酸 、酪氨酸 、精氨酸 、丙氨酸 、赖氨酸的含
量较高 ,含硫氨基酸较少 ,不含胱氨酸 。向东山等 [ 23]采用单
因素和 L9 (34)正交试验法则得鄂产竹节参中蛋白质得率最
佳为 9.86%。
5.2　糖类含量　黔产竹节人参中总糖含量约 41.51%,其中
多糖 18.33%,低聚糖 19.98%,还原糖 3.20%[ 24] 。鄂产竹节
参中多糖含量为 12.68%[ 25] 。 20世纪 80年代末 ,大谷弘
等 [ 26]从日本生长的竹节参分离出 2种具有活化网状内皮系
统作用的多糖 ,竹节参多糖(tochibanan)A、B,即分子量约为
23 000的 β-1, 4-半乳聚糖和分子量约为 40 000的含 L-阿拉
伯糖 7.9%, D-半乳糖 87.1%, D-葡萄糖 1.6%和半乳糖醛酸
3.5%的复杂多糖。袁菊丽等 [ 27]采用正交试验法测得陕西眉
县产珠子参多糖含量最高为 40.12%。钮子七含糖量为
13%[ 28] 。此外竹节参中还含有大牻牛儿烯 (gerinacrene)
D[ 29] 。
6　小结
竹节参 、珠子参等在我国民间药用历史悠久 ,前者长于
抗炎止咳 ,后者长于养阴清肺 ,由于它们的特殊功效已经越
来越引起人们的注意 ,但是药材的来源研究却极其混乱 ,众
多文献对竹节参 、珠子参等的来源记载不一致 ,从此尚未有
最有效的药材质量保证标准。因此 ,对它们的化学成分进行
详尽的研究并比较不同品种之间的化学成分差异 ,对该属植
物的分类具有重要意义。
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