全 文 ：收稿日期:2014-02-18
基金项目:四川省科技支撑计划项目(2010SZ0319;2012SZZ026)
作者简介:聂东(1968-),男,副教授,主要从事运动医学和中医药保健方向的教学和研究工作;Tel:0816-2200228。E-mail:myniedong@
163.com。
余甘子抗脑缺氧作用及对低压运动后抗氧化物质的影响
聂 东1,田 徽1,2,江 北1,马 骁2,周 莉1,刘晓梅1
(1.绵阳师范学院生命科学与技术学院,四川 绵阳621000;2.成都中医药大学药学院中药教研室,四川
成都611137)
摘要 目的:观察余甘子抗脑缺氧作用及对模拟高原低压环境下小鼠运动后血清抗氧化物质的影响。方法:
采用小鼠断头、腹腔注射亚硝酸钠,测定余甘子对脑缺血缺氧小鼠的存活时间的影响;采用小鼠负重游泳实验,测
定小鼠在低压环境下力竭游泳时间;采用游泳实验,测定小鼠游泳后不同时间血清乳酸(LD)含量;采用定时不负重
游泳实验,测定小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、以及一氧化氮(NO)及丙二
醛(MDA)含量。结果:余甘子组与空白对照组比较,断头、腹腔注射亚硝酸钠小鼠的存活时间均显著延长(P<
0.05);余甘子组与低压空白对照组比较,运动小鼠力竭时间显著延长(P<0.01);余甘子组小鼠游泳后血清乳酸曲
线下面积显著减少(P<0.01);定时游泳后,余甘子组小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-Px)活性显著升高(P<0.01),丙二醛(MDA)含量显著下降(P<0.01)、一氧化氮(NO)含量显著上升(P<
0.01)。结论:余甘子对脑缺氧小鼠模型有显著的脑保护作用,可提高低压环境下运动后机体的抗氧化功能。
关键词 :余甘子;脑缺氧;低压环境;乳酸;抗氧化物质
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)08-
余甘子系大戟科植物余甘子Phyllanthusem-
blicaL.的干燥成熟果实,又名油甘子、滇橄榄、橄
榄子、庵摩勒、久如拉、麻顶帮,是一种具护肝、抗心
血管系统疾病、抗衰老等多种生物活性且安全性较
高的藏族习用药材〔1-3〕,同时也是卫生部公布即可以
作为食品也可以作为药品的食品或保健食品开发的
重要原料之一。《本草纲目》中也载其“主补益气,久
服轻身,延年益寿”,目前也有研究报道发现余甘子
在模拟高原环境下具有缓解小鼠体力疲劳的作
用〔4〕,笔者注意到余甘子的很多药效实验显示其与
抗高原反应良药红景天相似〔5-7〕,因此其有开发为高
原运动食品的广阔应用前景。目前,关于余甘子在
低压环境中提高运动能力的具体机理笔者未见文献
报道,本实验通过研究余甘子对脑缺血缺氧模型的
保护作用以及余甘子对低压环境下小鼠运动后血清
抗氧化物质的影响,探讨其在高原上缓解运动疲劳
作用的机理,为进一步开发余甘子提供理论依据。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 清洁级昆明小鼠,体质量18~20
g,雌雄各半,由四川大学华西医学院实验动物中心
提供,许可证号:SCXK(川)-10-2006。
1.2 药物与试剂 余甘子、红景天购自成都市荷花
池中药材市场,经绵阳师范学院生科院罗明华教授
鉴定系2010年版中国药典一部收载品种Phyllan-
thusemblica L. 的 果 实 及 Rhodiolacrenulata
(Hook.f.et.Thoms.)H.Ohba.的根茎;乙醇、亚硝
酸钠等试剂购于成都科龙试剂有限公司,分析纯;丙
二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过
氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮(NO)、血清乳酸试
剂盒(LD)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1.3 主要仪器 UltroSPec3300pro紫外可见分
光光度计(美国Amersham公司);Buchi461旋转蒸
发仪(瑞士Buchi公司);5415D离心机(德国 Ep-
pendof);EIX800U全波长扫描酶标仪(美国Biotek
公司)。
2 方法
2.1 药物的制备 取余甘子药材,10倍量水浸泡
30min,武火煮沸,文火煎煮2h,过滤;滤渣加10倍
量水,武火煮沸,文火煎煮2h,过滤。合并两次滤
液后用。滤渣用10倍量60%乙醇80℃浸渍90
min,45℃旋转蒸发回收乙醇至干。加入合并后的
两次滤液,旋蒸浓缩定容至相应剂量体积即得。
2.2 余甘子对脑缺血缺氧小鼠的影响 昆明小鼠
50只,分为空白对照组对照组、红景天阳性对照组
及余甘子低、中、高剂量组,每组50只。空白对照组
灌胃生理盐水20mL/kg,余甘子组灌胃20mL/kg
余甘子水煎液,红景天组灌胃20mL/kg红景天水
煎液。连续灌胃3d,末次灌胃给药30min后,迅速
·0541· JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第8期2014年8月
网络出版时间：2014-07-31 11:16
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1286.R.20140731.1116.035.html
从小鼠耳后颈部断头。记录从断头开始小鼠张口次
数以及至最后一次张口的时间,即为小鼠存活时间。
另取昆明小鼠50只,雌雄各半,按以上方式分组给
药,连续灌胃3d,末次灌胃给药30min后,按10
mL/kg腹腔注射4%亚硝酸钠溶液,记录从腹腔注
射开始至小鼠腹式呼吸消失的时间,即为小鼠存活
时间〔8,9〕。
2.3 低压环境的模拟 顶部具塞真空干燥器,其橡
胶塞打2个孔,一孔由橡胶管连接真空泵,另一孔由
橡胶管连接空气,由管夹控制空气进出量,抽气使真
空表指针达到0.03~0.035mPA间且平衡为标准,
以此达到模拟高原的低压环境。
2.4 余甘子对低压小鼠负重游泳能力的影响 取
昆明小鼠60只,分为常压空白对照组、低压空白对
照组、低压+余甘子低剂量组、低压+余甘子中剂量
组、低压+余甘子高剂量组、低压+红景天阳性对照
组,每组10只。空白对照组灌胃20mL/kg生理盐
水,余甘子组灌胃20mL/kg余甘子水煎液,红景天
组灌胃20mL/kg红景天水煎液。灌胃后,除常压
空白对照组外,其他组都放入模拟低压环境饲养,于
第3天给药60min后,将小鼠置于低压环境中装满
水的1000mL烧杯中,负重体质量5%铅块,水温
为室温,进行游泳实验。以头部全部沉入水中10s
不能浮出水面,记录各组自游泳开始至力竭状态的
时间作为小鼠力竭游泳时间〔8〕。
2.5 余甘子对低压小鼠游泳后不同时间血清乳酸
的影响 取昆明小鼠60只,分为常压空白对照组、
低压空白对照组、低压+余甘子低剂量组、低压+余
甘子中剂量组、低压+余甘子高剂量组、低压+红景
天阳性对照组,每组10只。空白对照组灌胃20
mL/kg生理盐水,余甘子组灌胃20mL/kg余甘子
水煎液,红景天组灌胃20mL/kg红景天水煎液。
灌胃后,除常压空白对照组外,其他组都放入模拟低
压环境饲养,于第3天各组取10只小鼠迅速眼球取
血,12000rpm离心分离血清,每组小鼠于末次给药
30min后从内眦静脉丛采血,然后不负重置于低压
环境中装满水的1000mL烧杯中泳游泳10min,取
出后立即再次从内眦静脉丛采血,在低压环境休息
20min后第3次采血。上述3个时间点的血样按
血清乳酸测定试剂盒要求测定各时间段血清乳酸,
并计算曲线下面积〔10〕。
曲线下面积=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min
血乳酸值+2×游泳后休息20min血乳酸值)
2.6 余甘子对低压小鼠游泳后血清抗氧化物质的
影响 取昆明小鼠60只,分为常压空白对照组、低
压空白对照组、低压+余甘子低剂量组、低压+余甘
子中剂量组、低压+余甘子高剂量组、低压+红景天
阳性对照组,共6组,每组10只。空白对照组灌胃
20mL/kg生理盐水,余甘子组灌胃20mL/kg余甘
子水煎液,红景天组灌胃20mL/kg红景天水煎液。
灌胃后,除常压空白对照组外,其他组都放入模拟低
压环境饲养,于第3天给药60min后,将小鼠不负
重置于低压环境中装满水的1000mL烧杯中游泳
15min,迅速眼球取血,12000r/min离心分离血
清,按试剂盒要求测定各组小鼠血清 MDA、SOD、
GSH-Px、NO含量。
2.7 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件对实
验数据进行分析,计量资料以表示,各组间比较采用
单因素方差分析(One-wayANOVA)检验。以P<
0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 余甘子对脑缺血缺氧小鼠的影响 结果如表
1所示,与空白对照组比较,余甘子高剂量组的断头
小鼠张口次数、存活时间显及亚硝酸钠小鼠存活时
间显著延长(P<0.05或P<0.01),余甘子中、低
剂量组小鼠断头及亚硝酸钠小鼠存活时间有延长趋
势但差异无统计学意义。
表1 余甘子对脑缺血缺氧小鼠的影响(􀭵x±s,n=10)
组别 剂量/(g/kg)
断头小鼠
张口次数/次
断头小鼠
存活时间/s
亚硝酸钠小鼠
存活时间/s
空白对照组 - 11.90±2.88 15.37±4.13 596.54±74.84
红景天组 0.9 16.70±4.85* 23.47±5.86** 707.11±111.90**
余甘子高剂量组 13.5 16.40±4.70* 20.08±6.29* 710.26±92.71**
余甘子中剂量组 1.4 13.20±4.16 16.92±4.06 651.64±88.21
余甘子低剂量组 0.4 12.30±2.98 16.28±4.31 645.30±80.10
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
3.2 余甘子对低压小鼠负重游泳能力的影响 结
果如表2所示,各给药组及空白对照组与低压空白
对照组的小鼠游泳时间均有显著性差异(P<
0.01),余甘子各剂量均能延长小鼠在低压环境下的
·1541·JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第8期2014年8月
游泳时间(P<0.01)。
表2 余甘子对低压小鼠负重游泳能力
影响的实验结果(􀭵x±s,n=10)
组别 剂 量/(g/kg) 游泳时间/s
常压空白对照组 - 887.84±319.68**
低压空白对照组 - 542.96±313.96
红景天组 0.9 1898.88±248.13 **
余甘子高剂量组 13.5 1399.38±260.17 **
余甘子中剂量组 1.4 1049.66±361.17 **
余甘子低剂量组 0.4 1017.38±338.42 **
注:与低压空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
3.3 余甘子对低压小鼠游泳后不同时间血清乳酸
的影响 结果如表3所示,常压环境小鼠乳酸及常
用乳酸曲线下面积均显著低于低压组(P<0.05),
余甘子各剂量组小鼠血清小鼠游泳休息20min后
的血乳酸值和小鼠运动后血乳酸的曲线下面积较低
压空白对照组显著降低(P<0.05或P<0.01)。
3.4 余甘子对低压小鼠游泳后血清抗氧化物质的
影响结果 结果如表4所示,常压空白对照组与低
压空白对照组SOD、GSH-Px活性及 MDA、NO含
量均有显著性差异(P<0.05);与低压空白对照组
比较,余甘子各剂量组小鼠血清 MDA含量显著降
低(P<0.01);余甘子高、中剂量组小鼠血清SOD、
GSH-Px显著升高(P<0.01);余甘子高剂量组小
鼠血清NO含量显著升高(P<0.01)。
表3 余甘子对低压小鼠游泳后及曲线下面积的影响(􀭵x±s,n=10)
组别 剂量/(g/kg)
血清乳酸含量/(mmol/L)
游泳前 游泳10min 游泳后休息20min
乳酸曲线下面积
常压空白对照组 - 3.24±0.27 6.55±0.67* 3.85±0.42** 152.94±12.69**
低压空白对照组 - 3.49±0.32 7.19±0.58 4.42±0.46 169.40±12.78
红景天组 0.9 3.32±0.30 6.59±0.70* 3.98±0.47* 155.39±14.91*
余甘子高剂量组 13.5 3.33±0.29 6.56±0.59* 3.93±0.37* 154.29±8.22**
余甘子中剂量组 1.4 3.40±0.27 6.65±0.46 4.02±0.50 156.89±10.46*
余甘子低剂量组 0.4 3.27±0.31 6.54±0.66* 3.93±0.48* 153.66±12.64**
注:与低压空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表4 余甘子对低压小鼠游泳后血清抗氧化物质的影响结果(􀭵x±s,n=10)
组别 剂 量/(g/kg) MDA/(nmol/mL) SOD/(U/mL) GSH-Px/(U/mL) NO/(μmol/L)
常压空白对照组 - 4.61±0.95 * 82.23±16.57* 79.78±15.02* 64.78±8.95*
低压空白对照组 - 5.52±1.40 67.79±14.72 63.87±11.25 53.82±12.31
红景天组 0.9 2.24±0.92 ** 102.17±15.78** 93.27±12.33** 71.12±10.70**
余甘子高剂量组 13.5 2.10±0.84 ** 95.76±14.29** 91.37±13.56** 66.43±9.28**
余甘子中剂量组 1.4 3.44±0.78 ** 89.11±10.34** 88.20±9.93** 61.03±7.10
余甘子低剂量组 0.4 4.22±1.07 ** 80.92±16.98 65.32±10.8 57.72±11.10
注:与低压空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
4 讨论
当平原地区的人急速进入高原时,高原低氧的
环境会造成机体氧供应不足,产生急性高原病,现代
研究也表明,高原病与脑缺氧有密切的关系〔11〕。因
此课题组研究了余甘子对脑缺血缺氧模型的保护作
用,本实验结果显示,余甘子能显著提高断头小鼠张
口次数及存活时间(P<0.05),能显著提高亚硝酸
钠小鼠存活时间(P<0.01)。这说明余甘子具有的
抗脑缺氧作用。
乳酸是无氧代谢的产物。当机体处于剧烈运动
或低压环境中,氧耗增加或摄氧量减少导致机体供
氧不足时,机体通过对葡萄糖无氧酵解的方式来获
得能量,同时产生代谢产物乳酸,因此,如果出现机
体内乳酸增加或大量积累的现象,则表明机体的氧
供不足,有氧代谢能力下降,有氧代谢供能减少,无
氧代谢供能增加。在高原缺氧的环境下运动,由于
糖分解加速,致使丙酮酸和 NADH 生成速度大大
加快,同时缺氧抑制线粒体氧化丙酮酸和 NADH,
上述因素共同起作用,可以明显地提高乳酸生成速
率〔12〕。本实验结果显示,余甘子能显著提高小鼠在
低压环境的负重游泳能力能力(P<0.01),而且低
压环境由于供氧不足,小鼠负重游泳能力能力显著
下降(P<0.05),且乳酸产生显著高于常压小鼠(P
<0.05),乳酸的消除也显著低于常压小鼠(P<
0.01),这吻合高原训练早期的现象,在给予余甘子
后,小鼠在低压环境的负重游泳能力显著提高(P<
0.01),乳酸产生及代谢接近常压小鼠,提示余甘子
具有提高低压环境下小鼠有氧代谢能力的作用,从
·2541· JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第8期2014年8月
而减少乳酸生成并促进其消除。
运动使体内自由基生成增加,缺血组织中黄嘌
呤脱氢酶激活成黄嘌呤氧化酶,同时 ATP分解加
剧,使AMP生成增加,进一步使黄嘌呤生成增加,
在黄嘌呤氧化酶的作用下,产生超氧化物阴离子自
由基。另外运动时线粒体呼吸链电子传递加快,呼
吸链可以产生自由基,辅酶Q作为氧化呼吸链的汇
合点,就可以自由基形式进行电子传递,运动时氧化
代谢加快,促使呼吸链产生更多自由基。在氧运输
过程中,血红蛋白和肌红蛋白自动氧化成高铁血红
蛋白和高铁肌红蛋白过程中也可以产生自由基。研
究发现,在众多自由基中,氧自由基与运动的关系最
为密切。当生物体内氧自由基的含量增加时,氧自
由基就会与生物膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过
氧化反应。细胞膜系统脂质过氧化的结果就会使膜
的液态性、流动性改变,膜上的酶、受体及离子通道
受损,内质网结构改变,甚至破坏。在高原中运动
时,高原低氧低压的环境使体内氧化与抗氧化之间
的平衡紊乱,脂质过氧化反应更加增强,抗氧化酶的
保护功能进一步减弱〔13,14〕。丙二醛(MDA)是脂质
过氧化物降解产物中的产物,其可间接获取自由基
水平信息;超氧化物歧化酶(SOD)主要由肝细胞产
生,存在于肝细胞胞浆和线粒体,是重要的超氧阴离
子清除剂,可减缓、抵御自由基损害,保护细胞;谷胱
甘肽过氧化物酶(GSH-Px)也可以清除由自由基诱
发的脂质过氧化物,保护细胞膜结构和功能的完整
性;一氧化氮(NO)是内皮细胞分泌的一种活性物
质,它具有扩张血管、防止血小板聚集、激活,防止白
细胞和血小板黏附于血管内皮细胞等作用。人体内
NO代谢及氧化抗氧化系统功能状态与健康密切相
关,一旦NO代谢异常及氧化抗氧化系统的动态平
衡发生紊乱或破坏,就会导致体内自由基浓度过高
及一系列自由基反应病理性加剧,造成生命反应异
常。同样超氧阴离子也是的NO猝灭剂,生成超氧
亚硝酸阴离子,过量的亚硝酸阴离子可,导致羟自由
基的大量生成从而引发脂质过氧化。因此,本实验
选取 MDA、SOD、GSH-Px、NO四个与抗氧化密切
相关的指标,测定这几种物质在给予余甘子小鼠在
低压环境游泳后血清中的变化〔15-17〕。实验结果显
示,余甘子能显著提高在低压环境中不负重定时游
泳后小鼠血清中的SOD(P<0.01)、GSH-Px(P<
0.01)、NO(P<0.01)的含量,显著降低 MDA的含
量。这说明余甘子在低压环境中提高运动能力可能
与改变机体抗氧化物质相关,即促进机体产生
SOD、GSH-Px、NO,减少 MDA。
本实验结果证实,余甘子对脑缺血缺氧有保护
作用,能显著提高小鼠低压缺氧环境中运动能力,其
作用机制与提高小鼠有氧代谢能力和抗自由基损伤
作用有关。总之,本实验为今后进一步开发利用余
甘子高原运动食品奠定坚实基础。
参 考 文 献
[1]李萍,谢金鲜,林启云.余甘子对D-半乳糖胺致小鼠急
性肝损伤的影响[J].云南中医中药杂志,2003,24(1):
31-33.
[2]崔炳权,林元藻.余甘子的抗衰老作用研究[J].时珍国
医国药,2007,18(9):2100-210.
[3]王娅绿,王大全,秦彦文等.余甘子抗脂质过氧化和保
护血管内皮的实验研究[J].中国药学杂志,2003,38
(10):805-806.
[4]张钢,周思敏,田怀军等.余甘子对模拟高原环境小鼠
抗疲劳作用的实验研究[J].解放军药学学报,2011,27
(3):208-211.
[5]崔炳权,黄伟侨,林元藻.余甘子抗疲劳、抗缺氧作用实
验研究[J].中国现代中药,2006,10(6):26-28.
[6]吴万征,李朝晖,梁球.西藏红景天提取物抗缺氧作用
的实验研究[J].中药材,2005,28(1):41-42.
[7]关鑫.红景天的临床功效与药理作用研究[J].中国医
药导报,2011,7(32):14.
[8]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版
社,1993:780-783.
[9]王洋,王建,班炳坤,等.麝香与冰片及其配伍对脑缺血
缺氧小鼠模型的影响[J].中药药理与临床,2011,27
(2):96-98.
[10]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规
范[S].北京:清华同方电子出版社,2003.91-93.
[11]杨燕,马慧萍,张汝学等.急性高原病发病机制的研究
进展[J].医学综述,2010,16(17):2561-2563.
[12]吴环成.高原训练“乳酸矛盾现象”剖析[J].长江大学
学报(自然科学版),2010,7(3):658-659.
[13]聂金雷,张勇.运动与自由基研究的新进展[J].天津体
育学院学报,2001,16(2):32-34.
[14]崔建华,张西洲,何富文,等.不同海拔高度不同高原
居住时间血中 MDA和SOD的测定[J].高原医学杂
志,1999,9(4):12-14.
[15]崔建华,王引虎,张西洲,等.红景天对高原人体运动
后自由基和血清肌酸激酶的影响[J].航天医学与医学
工程,2001,14(6):448-452.
[16]崔建华,张西洲,王引虎,等.银杏叶片对高原人体运
动后一氧化氮及一氧化氮合酶的影响[J].中国临床康
复,2004,8(33):7512-7513.
[17]周伯庭,丁志刚,李新中,等.茶多酚对染铅小鼠 NO、
NOS、MDA、SOD 的影响[J].中国医院药学杂志,
2008,28(18):1563-1565.
·3541·JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第8期2014年8月