全 文 ：野生植物余甘子提取物抗氧自由基性能分析研究
郭亚力1 ,李聪2 ,欧灵澄2 ,张举成2 ,程伟贤2 ,李云川2
(1.红河学院化学系 , 云南 蒙自 661100;2.云南大学应用化学系 ,昆明 650091)
　　摘　要:　用电子顺磁共振法 、DPPH 分光光度法 、联苯三酚红/ H2O2/ Fe2+分光光度法对野生植物余甘子
提取物的抗氧化性进行了分析检测及活性研究.并用自己研究出的玫红光敏化合物微生物纸片法进行了抗
氧自由基性能检测对照.结论:余甘子对自由基的清除率可以达到 30-80%, 具有很好的抗氧化能力及氧自
由基清除作用.新的抗自由基性能检测方法简便易行 ,适用快速.
关键词:　余甘子;自由基检测;抗氧化;抗氧剂;微生物法;DPPH
中图分类号:　Q94-33　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1008-9128(2004)06-0010-05
　　余甘子为大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblica L.
的干燥成熟果实.冬季至次春果实成熟时采收 , 除去杂
质 ,干燥.新鲜果实呈棕褐色至墨绿色 , 球形或扁球形 ,
性味甘 、酸 、涩 、凉.可入药 , 清热凉血 ,消食健胃 , 生津止
咳.用于血热血瘀 , 消化不良 , 腹胀 , 咳嗽 , 喉痛.目前的
人工栽培及野生余甘子果实都用作为食品加工原料.余
甘子提取物成分较复杂 ,多糖 、多酚类 、咖啡碱 、SOD、维
生素C 等多种生物活性物质 , 可提取没食子酸及超氧化
物歧化酶(SOD).有人对其抗氧化 、抗缺氧 、抗疲劳 、抗肿
瘤 、降血脂 、降胆固醇 、自主活动度 、血液粘稠性及胃肠
消化功能等进行了一些探索性实验研究.其主要原因之
一是具有良好的抗氧自由基功能 , 具有极好的开发生产
保健食品及绿色食品用天然抗氧化剂的潜力.因此 , 余
甘子的研究及加工越来越受到人们的重视[ 1-5] .以下就
自己提取分离得到的余甘子抗氧化提取物为样品进行
抗氧自由基性能分析研究及讨论.
1　实验部分
1.1 材料与仪器
Bruker-EMX 6/1 顺磁共振仪(德国 Bruker 公司).
DPPH(1 , 2-二苯基-2-苦基肼),日本东京化成株式会
社生产 , A.R ,紫色结晶;无水乙醇(A.R);Mueler-Hin-
ton(MHA)琼脂培养基(法国生物梅里埃公司);枯草杆菌
(Bacillus subtilus-1.3382)(本课题组培养);玫瑰红 6G
国产生化试剂.
1.2余甘子提取物的提取
市场购入的中药材干燥余甘子 , 粉碎后称取 100g ,
以石油醚脱脂 3 次.加入工业乙醇回流提取 4 小时 , 趁
热过滤 , 提取 3 次合并滤液.提取液减压回收溶剂得到
余甘子提取物质。以 50%乙醇为溶剂 , 配制成 0.1g/ L
的余甘子提取物样品液.
1.3 余甘子提取物质的抗自由基性能电子自旋
共振(ESR)法研究
顺磁共振仪测试参数:中心磁场=3385.0Gs , 扫宽=
500.0Gs , 微波频率=1.5GHz ,扫描时间=2min , 扫描次数
=1 ,放大倍数=2.5×104样品用量=20μl.
0.001mmol/ L DPPH 溶液 , 以无水乙醇为溶剂配成 ,
为空白对照样.
　第 2 卷　第 6期　　　　　　　　　　　　　　红河学院学报　　　　　　　　　　　　　　Vol.2　No.6
　2004 年 12月　　　　　　　　　　　　Journal of Honghe University　　　　　　　　　　　　　Dec.2004
收稿日期:2004-10-25
基金项目:云南省省校合作项目(2000YK-01)
第一作者:郭亚力(1956-),男 ,河南堰城人 ,教授 ,现从事天然产物分析研究.
DOI :10.13963/j.cnki.hhuxb.2004.06.003
往0.001mmol/L DPPH 溶液 , 再加入余甘子提取物
样品液 C0 ,使余甘子提取物样品液浓度为 0.0001 g/L ,
充分混匀 ,为测试样.分别用顺磁共振仪检测.
1.4 余甘子的抗氧化物抗自由基性能 DPPH 分
光光度法研究
经实验确定 DPPH 的最大吸收波长为 520 nm , 余甘
子提取物样品液在此实验条件下几乎无色 , 对 DPPH 的
测量峰 520nm形不成干扰 ,实验选用 520nm 作为测定波
长.实验发现 , 在 pH6.88 缓冲介质中 , DPPH 自由基显紫
红色 ,改变缓冲溶液用量 , DPPH 溶液吸光度基本不发生
变化 ,实验选用 pH6.88的近中性缓冲溶液.由于抗氧剂
样品与 DPPH 的反应极快 , 1min 内便能完成 85%的反应
度.反应 5 min 后吸光度基本不变.实验选取 10min 为反
应时间.DPPH 对温度不敏感 ,实验选用在室温下反应.
往10mL比色管中依次加入 pH 6.88 标准磷酸盐缓
冲溶液4mL, 0.1777mmol/ L DPPH 溶液 4mL ,混匀 ,再加入
一定量余甘子提取物样品液 , 蒸馏水加至 10.00mL 刻
度 ,充分混匀 , 10min后在 520nm 处测吸光度.
定义余 甘子对 DPPH 自由基 的清除率 K =
[ 1—(Ai — Aj)/ Ac] ×100%,式中:Ai =加余甘子反应后
DPPH溶液吸光度;Aj=不加 DPPH ,只加余甘子及水的
溶液的吸光度;Ac =未加余甘子 , 只加 DPPH 及水的溶
液的吸光度.
1.5 余甘子提取物的抗羟自由基性能联苯三酚
红/ H2O2/Fe2+分光光度法测定
取30%H2O2 溶液 6mL , 用水稀释定容至 100mL , 使
用时再按需要逐级稀释 , 当日配用 , 密封暗处存放;0.
1mmol/ L 连苯三酚红溶液:准确称取连苯三酚红 40.
04mg , 蒸馏水稀释定容至 1000mL;3.8mmol/ L EDTA -
Fe2+溶液:准确称取 FeSO4·7H2O 晶体 211.30mg , ED-
TA282.90mg ,共溶于蒸馏水中 , 稀释定容至 200mL;pH9.1
的0.1mol/L Na2CO3—NaHCO3 缓冲溶液;上述试剂均为
国产分析纯.10%(w/v)的余甘子提取物样品溶液.
往10mL具塞比色管中 , 依次加入 pH9.2 的碳酸钠
—碳酸氢钠缓冲溶液 2mL , 3.8mmol/L++EDTA-Fe2+
溶液 0.7mL , 0.1mmol/ L连苯三酚红溶液 3.5mL , 0.6%
H2O2 溶液 0.7mL ,蒸馏水补充至刻度后在 25℃保温反应
30min(上面每加一次均需摇匀), 测 544nm 处的吸光度
A544 .
不加 H2O2 时的吸光度 A0 , 加入 H2O2 后的 A544 为
Ab ,则羟自由基产生量可用 ■A = A0-Ab 来表征.
在加H2O2 之前加入一定量的余甘子提取物样品溶
液 ,测定其吸光度 As ,则表观抗羟自由基氧化率 S 可按
下式计算:S(%)=(As-Ab)/(Ao -Ab)×100
1.6 余甘子提取物抗单线态氧自由基性能玫瑰
红光敏化合物微生物法研究
以 50%乙醇为溶剂 , 分别配制 4.0 、2.0、1.0、0.1g/ L
的余甘子提取物样品液 C0、C1 、C2 、C3 备用.以无水乙
醇为溶剂 ,分别配制 3.60、1.80、0.90g/ L的玫瑰红 6G 为
C0、C1 、C2玫瑰红光敏剂(氧化剂);按体积比 1:1 配制不
同浓度的玫瑰红光敏剂与余甘子提取物混合溶液;将
8mm 的滤纸片浸入混合溶液片刻后取出 , 除尽溶剂后
暗中保存 ,备用.
将固体培养基加热熔化 ,冷却至 50℃左右接入枯草
杆菌菌种 ,搅拌均匀至自然冷却 ,制成带菌平整培养面;
分放浸蘸过混合溶液的滤纸片放于培养皿中 ,使其保持
一定距离 ,放妥后用无菌镊子轻压 , 使紧贴平板表面 , 并
用200W 可见光灯在距标本 20cm 处光照 75min 后 ,再放
于 35℃恒温箱培养 18h;取出培养皿 , 准确测量抑菌圈直
径 d(mm).上述操作除引入 、培养细菌外 , 均在无菌条
件下进行.
2　结果与讨论
2.1电子自旋共振(ESR)法研究结果及讨论
电子顺磁共振(EPR 或 ESR)是唯一可直接检测自
由基信号的方法.主要用来研究具有未成对电子结构的
自由基 、原子 、分子(包括三线态分子),其灵敏度比 NMR
高 230 倍(理论值), 且不会对自由基产生破坏作用 , 是
目前自由基检测的首选方法。本实验以 DPPH(1 , 1-二
苯基-2-苦基肼自由基 , C18H12N5O6)为自由基发生物 ,
在试样条件下加入余甘子提取物样品 , 检测 DPPH 产生
的 DPPH 自由基信号及加入余甘子提取物样品后 DPPH
11★郭亚力 ,李聪 , 欧灵澄 ,张举成 , 程伟贤 ,李云川　野生植物余甘子提取物抗氧自由基性能分析研究
自由基减少后的信号.根据谱峰高度的相对变化 , 可以
估算自由基数量的变化 ,反映余甘子提取物的自由基清
除能力[ 6-9] .对 DPPH 空白及 DPPH+余甘子提取物样品
进行检测 ,等到顺磁共振图谱(ESR)如图 1:
图1　余甘子提取物样品液对 DPPH 自由基清除的影响
根据测量图谱峰高(mm), 可以比较余甘子提取物
样品液的氧自由基的清除率.
Ar =(H对照-H测试)/ H对照 ×100%
　=(48.6-21.9)/48.6×100%=54.9%
根据 ESR 实验数据可以看出 , 在以上实验条件下 ,
54.9%的 DPPH 自由基由于余甘子提取物的作用而减
少 ,说明余甘子提取物具有较好的自由基清除作用.
2.2 DPPH 分光光度法研究结果及讨论
由于大多实验单位均不具备顺磁共振仪 , 采用通用
仪器设备替代顺磁共振仪进行自由基检测是目前自由
基检测方法研究的一个重要内容.本方法采用分光光度
法进行自由基检测.其原理是:由于 DPPH 具有特殊的紫
色 ,其产生的自由基在与抗氧化物质进行反应的过程
中 ,由于 DPPH 的浓度降低 ,其紫色也随着消退 , 利用抗
氧化物使其褪色的效应 ,可利用分光光度法对抗氧化物
的抗氧化性能进行分析研究 , 推知抗氧物的抗氧化能
力.
按实验方法加入不同体积的余甘子提取物样品液 ,
测出 Ai , Aj , Ac , 计算出 Ai-Aj 值 ,据此再计算出其相应
的自由基清除率 K ,结果见图 2.
图 2　余甘子抗氧剂性能分析结果
从图 2可知 , 余甘子为具备捕获 DPPH 自由基能力
的物质 ,其捕获 DPPH 自由基的能力与抗氧剂用量均呈
量效关系:随着余甘子抗氧剂用量的增加 ,其捕获的
DPPH自由基也越多.
2.3 联苯三酚红/ H2O2/Fe2+分光光度法测定结
果及讨论
根据实验显示 ,余甘子具有一定的清除羟自由基的
作用 ,随着余甘子浓度的提高 ,其对羟自由基的清除率
也越高 ,但当其浓度达到近 42%后 , 其抗氧化作用即无
明显改变.
根据实验A544数据 , 计算出余甘子提取物不同用量
时的羟自由基氧化抑制率 ,结果见图 2.
图 3　不同浓度的余甘子提取物对表观
羟基自由基清除率 S%的影响
根据实验可以看出 ,余甘子抗氧化提取物对羟基自
由基的清除能力在 30%左右.当余甘子提取物加入量达
到1ml后其对羟基自由基的清除率达到最大 , 再增加则
无明显效果.方法简便快速 、操作简单.
12 红河学院学报　　2004.6 / 化学·生物
2.4 玫瑰红光敏化合物微生物法研究实验结果
该实验主要用于检测植物抗氧化剂对单线态氧1O2
的清除能力.选取玫瑰红 6G(Rhodamine 6G)作为单线态
氧1O2的发生体系[ 10-13] .利用天然植物提取物清除活性
氧1O2的特性 , 减少活性氧对细菌生长的抑制作用 ,使得
抑菌圈直径减小.
根据实验记录抑菌圈直径变化数据见表 1.计算表
观抗氧化率 S 见表 2:
S =(d无抗氧剂 - d加抗氧剂)/(d无抗氧剂 - d纸片)×
100%
表 1　余甘子提取物与玫瑰红光敏剂(氧化剂)
对抑菌圈直径 d的影响
玫瑰红
浓度 余甘子提取物(g/ L)
2.0 1.0 0.5 0.0
C0 10.4 10.9 11.8 13.2
C1 9.8 10.2 10.9 12.4
C2 8.6 9.4 10.0 11.1
表 2　余甘子提取物与玫瑰红光敏剂(氧化剂)
作用的表观抗氧化率 S(%)
玫瑰红
浓度 余甘子提取物(g/ L)
2.0 1.0 0.5 0.0
C0 21.2 15.4 5.8 0.0
C1 25.0 20.5 11.4 0.0
C2 34.4 28.1 15.6 0.0
随着余甘子提取物浓度的提高 , 其抗氧化能力增
大 ,随氧化剂(玫瑰红浓度的减小 , 其抗氧化率增加。 随
实验条件的不同 , 余甘子提取物对单线态氧自由基1O2
的清除率在 5-35%间变化。
3　结论
根据以上四种抗氧自由基性能检测方法得到的结
论是:余甘子中提取得到的抗氧化物具有明显的氧自由
基清除作用。在相同条件下 ,余甘子对自由基的清除率
与其使用的浓度呈正相关.但当其浓度达到一定时 , 其
效果增加即不再明显.在以上四种实验方法下 , 余甘子
提取物的自由基清除率在 30-80%之间不同 , 这主要因
为实验条件测试方法及体系中自由基种类的差异所造
成的.其中后两种方法仪器等实验条件简单 , 一般实验
室易于进行.
光敏化合物微生物纸片法为自由基检测的新方法 ,
实验条件简单 ,操作分别的特点。特别是使用该方法可
以同时对照检测大批量样品 , 极大地降低了检测成本 、
节约研究时间.具有大的使用价值.利用光敏化合物光
照产生活性自由基来检测物质的抗自由基性能 , 也是一
种新的研究思想方法.
总之 ,余甘子中成分的抗氧化功能及清除自由基的
作用是显著的.因此 , 余甘子的清热凉血 , 消食健胃 , 生
津止咳功效外 , 还具有清除各种自由基及防止人体内氧
自由基的危害作用 ,有可能成为食品 、烤烟及日用化妆
品中的抗氧化剂.特别在保健食品开发中 , 利用余甘子
的抗氧化性及较强的氧自由基清除特性而作为一种新
型食品添加剂使用.
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[ 责任编辑　黄兆龙]
Analysis and Studies on the Capability of Resistance to
Oxidation of Phyllanthus Emblica L.
GUO Ya-li1 , LI Cong2 , OU Ling -cheng2 ,
ZHANG Ju-cheng2 , CHENGWei-xian2 , LI Yun-chuan2
(1.Department of Chemistry , Honghe University , Mengzi Yunnan 661100 , China;
2.Department of Applied Chemistry , Yunnan University , Kunming 650091 , China)
Abstract:　Using the ESR method , DPPH Photometric method 、Pyrogallol red H2O2/Fe2+ Photometric
method and microbiological method to analysis and investigating the resistance to oxidation capability of substances
recovered from Phyllanthus emblica L.Contrasted result by a new photosensitized compound microbiological
method.The result:Scavenging percentage of free radical of Phyllanthus emblica L.is arrive at 30-80%, so it
has finer ability of antioxidant and scavenging free radical.This new photosensitized compound microbiological
method has characteristic of simple , convenient and speediness.
Key words:　Phyllanthus emblica L.;analysis of free radical;antioxidation;antioxidant , microbiologi-
cal method;DPPH
14 红河学院学报　　2004.6 / 化学·生物