全 文 ：文章编号: 1009 - 5276( 2003) 09 - 1589 - 03 中图分类号:R931. 6 文献标识码:A 收稿日期: 2002 - 09 - 21
余甘子护肝作用的实验研究
李 萍1 林启云1 谢金鲜1 李爱媛1 谢 彬2
( 1. 广西中医学院药理教研室, 530001, 广西南宁; 2.广西中医学院药学院 1997 级实习生 / /
第一作者女, 1967 年生,讲师硕士)
摘 要:方法:分别采用扑热息痛( AAP)、硫代乙酰胺( TAA)一次性腹腔注射( ip)造成急性肝损伤小鼠模型,
检测血清谷丙转氨酶( ALT)、谷草转氨酶( AST )、碱性磷酸酶( ALP)、肝糖元水平, 计算肝脏系数, 并作病理观察。
结果: 余甘子水提醇沉物各剂量组均可降低 AAP、TAA 所致的急性肝损伤小鼠血清 ALT、AST、ALP的活性及肝
脏系数, 并能增加肝糖元含量,改善肝脏组织病理损伤,其作用呈剂量依赖性。结论:余甘子水提醇沉物对 AAP、
TAA 所致的急性肝损伤具有预防作用。
关 键 词:余甘子; APP造膜; TAA造模; 护肝作用
1 实验材料
动 物 昆明种小白鼠,体重 20~ 25g , 雌雄兼用,由本
院动物实验中心提供,桂医动字第 11004 号。
药 物 新鲜余甘子, 清水洗净, 去核取肉, 加 10 倍果
肉量蒸馏水浸泡 30 分钟, 煎煮 2 次,过滤, 合并滤液,浓缩至
小体积,加入 4%明胶水溶液, 不断搅拌, 加热, 过滤, 去渣,
用 3倍 95%乙醇沉淀 24 小时,过滤, 去渣, 浓缩至 2g /ml分
装备用,临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。联苯双酯滴丸:
山东省德州制药厂,批号 20000309。
试 剂 AAP, 广西南宁市制药集团公司, 批号
970619; TAA, 江苏太仓县化学工业公司中心试验室, AR, 批
号851107; ALT 试剂盒、AST 试剂盒、ALP 试剂盒, 上海申
能生物技术有限公司生产, 批号分别为 980903、980712、
980525。
2 实验方法
AAP肝损伤182 取 60 只小鼠随机分为 6 组, 每组 10
只小鼠, ¹ ~ »组为余甘子水提醇沉物高、中、低剂量组( 7.
0, 3. 5, 1. 8g /kg ) ; ¼ 组为联苯双酯阳性对照( 45mg /kg ) ; ½
组为 AAP模型组对照组 (蒸馏水, 20ml /kg ) ; ¾ 正常对照组
(蒸馏水, 20ml /kg)。每日 1次, 连续给药 10 天, 于末次给药
后1 小时, 除正常对照组外, 其他各组小鼠均 ip5% 的 APP
溶液( 400mg /kg) , 禁食不禁水, 24 小时后摘眼球采血, 取肝
备检。
TAA肝损伤192 动物、分组、给药方法及时间同 AAP4
肝损伤。不同的是于末次给药后 1 小时, 除正常对照组外,
其他各组动物均 ip0. 1%的 TAA 溶液( 80mg /kg) , 禁食不禁
水, 16 小时后摘眼球采血, 取肝备检。
检测项目
肝糖元测定:按蒽酮法进行172。
血清 ALT、AST、ALP 活性测定 : 分别按照 ALT、AST、
ALP 试剂盒使用说明书,用 TBA - 120型全自动生化分析仪
测定。
取肝脏称重,计算肝脏系数: 肝脏系数= (肝脏重量 /体
重) @ 100% 。
肝组织病理学检查:取经中性福尔马林溶液固定的肝组
织标本, 石蜡包埋 ,超薄切片厚 5Lm, 作 HE 染色, 光镜下观
察肝细胞变性坏死程度。
分级标准: ( - )表示肝组织无肿胀、坏死及炎性细胞浸
润; ( + )表示轻度肝细胞肿胀, 单个肝细胞坏死,或少许炎性
细胞浸润; ( 6 )表示中度肝细胞肿胀, 或肝细胞灶性坏死, 或
明显炎性细胞浸润; ( 7 )表示重度肝细胞肿胀,或肝组织片
状坏死,或大量炎性细胞浸润。
统计方法 实验数据以ŠX ? S 表示, 两组间均数差异采
用 t检验。
3 实验结果
余甘子水提醇沉物对 AAP 所致急性肝损伤小鼠的影响
各组血清 ALT、AST、ALP 活性的变化: 模型组 ALT、
AST、ALP明显高于正常组( P < 0. 01) , 说明造模成功。与
模型组比较,余甘子各剂量组均能显著降低 ALT、AS T、ALP
的活性( P < 0. 05~ 0. 01)。见表 1。
表 1 AAP所致急性肝损伤小鼠血清中 ALT、AST、ALP
活性的影响(ŠX ? s, n= 10)
组 别 剂 量
( g /kg)
ALT
( U /dl)
AST
( U /dl)
A LP
(U /dl)
正常对照 - 50. 5 ? 25. 1 117. 5 ? 22. 7 17. 5? 2. 6
模型对照 - 476. 2 ? 51. 6 v 318. 1? 59. 8v 46. 5? 5. 7 v
联苯双酯 0. 045 264. 9 ? 39. 0 n 199. 0? 34. 3n 27. 6? 3. 5 n
余甘子 7. 0 269. 4 ? 41. 7 n 203. 3? 31. 7n 24. 8? 4. 3 n
余甘子 3. 5 325. 5 ? 39. 2 n 227. 8? 36. 9n 32. 5? 4. 5 n
余甘子 1. 8 415. 5 ? 46. 0 s 266. 6? 30. 1s 40. 6? 3. 9 s
注: 与正常组比较, v P < 0. 01; 与模型组比较, n P < 0. 01, s P < 0.
05。
各组肝糖元含量及肝脏系数的变化: 与正常组比较, 模
型组肝糖元的含量明显降低, 肝脏系数明显提高( P < 0.
01) , 说明造模成功。与模型组比较,余甘子各剂量组均可显
著提高肝糖元含量( P < 0. 05~ 0. 01) ;高、中剂量组可明显
降低肝脏系数( P < 0. 01) ,但低剂量组则无显著性差异( P
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中 医 药 学 刊 2003年 9月第 21卷第 9期
DOI：10.13193/j.archtcm.2003.09.179.lip.106
> 0. 05)。见表 2。
表 2 AAP所致急性肝损伤小鼠肝糖元及肝脏系数的
影响(ŠX ? s, n= 10)
组 别 剂 量
( g /kg)
肝糖元
( g /100g 肝组织) 肝脏系数
正常对照 - 0. 0954 ? 0. 014 3. 96 ? 0. 46
模型对照 - 0. 0374 ? 0. 017 v 5. 27 ? 0. 66 v
联苯双酯 0. 045 0. 1122 ? 0. 039 n 4. 43 ? 0. 45 s
余甘子 7. 0 0. 1067 ? 0. 042 n 4. 46 ? 0. 52 s
余甘子 3. 5 0. 0999 ? 0. 038 n 4. 62 ? 0. 56 s
余甘子 1. 8 0. 0789 ? 0. 040 s 4. 90 ? 0. 43
注:与正常组比较, v P < 0. 01;与模型组比较, n P < 0. 01, s
P < 0. 05。
表 3 AAP所致急性肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响
( n= 8)
肝细胞变性 肝细胞坏死 炎症反应
- + 6 7 - + 6 7 - + 6 7
正常对照组 8 0 0 0 8 0 0 0 7 1 0 0
模型对照组 0 2 3 3 0 1 2 5 0 1 2 5
联苯双酯组 1 4 3 0 1 4 2 1 0 4 3 1
余甘子高剂量组 1 4 2 1 1 4 2 1 0 4 3 1
余甘子中剂量组 0 3 4 1 0 3 2 3 0 2 4 2
余甘子低剂量组 0 1 5 2 0 1 4 3 0 1 4 3
病理学检查:正常组镜下见肝细胞索排列规则, 肝小叶
结构正常,未见肝细胞变性、坏死等病理变化。模型组镜下
见肝细胞不同程度变性 (以细胞浊肿为主) , 并有灶性坏死,
汇管区伴中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞浸润。余甘子
各剂量组及联苯双酯组肝细胞的坏死程度较模型组有所减
轻。见表 3。
余甘子水提醇沉物对 TAA 所致急性肝损伤小鼠的影响
各组血清 ALT、AST、ALP 活性的变化: 模型组 ALT、
AST、ALP明显高于正常组( P < 0. 01) , 说明造模成功。与
模型组比较 ,余甘子高、中两个剂量组能显著降低小鼠血清
中ALT、AST、ALP的活性 ( P < 0. 05~ 0. 01) , 而小剂量组
则无显著性差异( P > 0. 05)。见表 4。
表 4 TAA所致急性肝损伤小鼠血清中 ALT、AST、ALP
活性的影响(ŠX ? s, n= 10)
组 别 剂 量
( g /kg)
ALT
(U /dl)
AST
( U /dl)
ALP
( U / dl)
正常对照 - 45. 2? 8. 2 98. 9 ? 42. 5 20. 3? 3. 3
模型对照 - 485. 0? 71. 2v 274. 6 ? 53. 9 v 44. 0? 7. 7 v
联苯双酯 0. 045 300. 3? 39. 5n 184. 5 ? 46. 1 n 29. 7? 3. 3 n
余甘子 7. 0 333. 6? 44. 5n 209. 5 ? 37. 5 n 31. 0? 3. 0 n
余甘子 3. 5 381. 5? 36. 8n 220. 7 ? 45. 2 s 35. 6? 3. 9 s
余甘子 1. 8 426. 0? 45. 6 255. 8 ? 47. 8 39. 6? 3. 4
注: 与正常组比较, v P < 0. 01;与模型组比较, n P < 0. 01, s P < 0.
05。
各组肝糖元含量及肝脏系数的变化: 与正常组比较, 模
型组肝糖元的含量明显降低, 肝脏系数明显提高( P < 0.
01) , 说明造模成功;与模型组比较, 余甘子高、中剂量组可明
显提高小鼠肝糖元含量, 但低剂量组则无显著性差异;高剂
量组可明显降低小鼠肝脏系数( P < 0. 01) , 而中、低 2 个剂
量组则无显著性差异( P > 0. 05)。见表 5。
表 5 TAA所致急性肝损伤小鼠肝糖元及肝脏系数的
影响(ŠX ? s, n= 10)
组 别 剂 量
( g /kg)
肝糖元
( g /100g肝组织) 肝脏系数
正常对照 - 0. 1001 ? 0. 020 3. 81 ? 0. 30
模型对照 - 0. 0635 ? 0. 026 v 4. 98 ? 0. 70 v
联苯双酯 0. 045 0. 1323 ? 0. 042 n 4. 06 ? 0. 39 n
余甘子 7. 0 0. 1288 ? 0. 050 n 4. 17 ? 0. 23 n
余甘子 3. 5 0. 1097 ? 0. 052 s 4. 35 ? 0. 69
余甘子 1. 8 0. 0835 ? 0. 046 4. 46 ? 0. 28
注:与正常组比较, v P < 0. 01;与模型组比较, n P < 0. 01, s
P < 0. 05。
表 6 TAA所致急性肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响
(n= 8)
肝细胞变性 肝细胞坏死 炎症反应
- + 6 7 - + 6 7 - + 6 7
正常对照组 8 0 0 0 8 0 0 0 7 1 0 0
模型对照组 0 1 4 3 0 1 3 4 0 1 2 5
联苯双酯组 0 5 2 1 1 4 1 2 0 4 3 1
余甘子高剂量组 0 4 3 1 1 4 2 1 0 4 3 1
余甘子中剂量组 0 2 5 1 0 2 4 2 0 2 4 2
余甘子低剂量组 0 1 5 2 0 0 5 3 0 2 2 4
病理学检查:正常组镜下可见肝细胞索结构清晰,肝细
胞形态较正常。模型组肝脏损伤严重,镜下可见严重灶性坏
死和间质炎,有嗜酸性小体形成, 出现大片肝细胞坏死。余
甘子低剂量组肝脏病变较模型组略轻, 但差别不大; 中剂量
组肝细胞轻度浊肿;高剂量组肝脏病变明显减轻, 无明显水
样变性,肝细胞较正常。联苯双酯组偶有轻度浊肿。见表
6。
4 讨 论
AAP为一种常用的研究药物代谢、药物相互作用和筛
选抗肝炎药的急性肝损伤模型药。治疗量 AAP主要的代谢
途径是与葡萄糖醛酸或硫酸结合, 少数在细胞色素 P - 450
催化下经氧化形成芳香化的毒性中间代谢产物, 该产物通过
与 GSH 结合而解毒。当给予大剂量 AAP 后, 因结合代谢途
径饱和,肝脏 GSH 耗竭, 大量毒性代谢物与肝内生物大分子
结合,导致肝细胞坏死172。凡能减少毒性代谢产物形成, 促
进其解毒; 或直接保护肝细胞免受损害的药物均能减轻
AAP的活性。
据报道, 142一些药物可作为 GSH 前体物,或直接与毒性
代谢产物结合; (下转第 1593页)
#1590#
余甘子护肝作用的实验研究
量氯仿溶解后转于 10ml量瓶中, 加氯仿至刻度,作为供试品
溶液。精密吸取供试品溶液 4Ll、对照品溶液 4Ll及 8Ll分别
交叉点于同一硅胶 G 薄层板上, 按/ 线性关系考察0 项下方
法展开、扫描测定, 结果见表 2。
加样回 收 试验: 精 密称 取 已知 含 量 的保 精 片
(批号 960502)共 6 份,分别加入一定量的靛玉红对照品, 按
样品测定项下方法操作, 定容于 10ml量瓶中, 各精密吸取
4Ll按前述方法点样、展开、扫描测定,结果见表 3。
表 2 保精片中靛玉红含量测定结果
批号 样品量
( g)
吸收峰
面积积分
含 量
( mg) ( % ) ŠX( % )
RSD
( % )
每片含量
(m g)
931119 2. 1085 3466. 10 0. 5701 0. 02704
1. 9624 3152. 08 0. 5159 0. 02629 0. 026147 3. 72 0. 07844
2. 0857 3197. 28 0. 5237 0. 02511
940202 1. 9268 4870. 92 0. 8127 0. 04218
1. 9836 4960. 66 0. 8282 0. 04175 0. 041450 2. 21 0. 12435
2. 1473 5190. 52 0. 8679 0. 04042
950824 2. 0561 5083. 31 0. 8494 0. 04131
1. 9482 4689. 58 0. 7814 0. 04011 0. 040993 1. 89 0. 12298
2. 1249 5278. 53 0. 8831 0. 04156
960502 2. 0254 4389. 06 0. 7295 0. 03602
1. 8867 4090. 22 0. 6779 0. 03593 0. 035537 2. 14 0. 10661
2. 1315 4442. 86 0. 7388 0. 03466
表 3 加样回收率试验结果
编号 样品量( g) 含量( mg) 加入量( mg)总含量( mg) 吸收值积分值 测得量( mg)回收量( mg)回收率( % ) ŠX( % ) RSD( % )
1 0. 9924 0. 3527 0. 204 0. 5567 3355. 84 0. 5511 0. 1984 97. 25
2 1. 0876 0. 3865 0. 204 0. 5905 3623. 94 0. 5974 0. 2109 103. 38
3 1. 0263 0. 3647 0. 204 0. 5687 3406. 19 0. 5598 0. 1951 95. 64
4 0. 9862 0. 3505 0. 408 0. 7585 4601. 48 0. 7662 0. 4157 101. 89 98. 24 3. 59
5 1. 0012 0. 3558 0. 408 0. 7638 4466. 48 0. 7429 0. 3871 94. 88
6 0. 9901 0. 3519 0. 408 0. 7599 4479. 36 0. 7451 0. 3932 96. 37
3 讨论与小结
以氯仿为溶媒提取靛玉红, 当样品提取至无色时, 取样
检测无斑点检出,表明提取完全,时间约需 18 小时, 故先浸
渍过液再提 6 小时,可保证提取完全。
靛玉红所用展开剂曾以苯 -氯仿 -丙酮( 5: 4: 1)及氯仿
- 乙醇( 9: 1)试验, 分离效果不佳, 后应用前述展开剂, 获得
满意效果。
经过 4 批样品含量测定分析, 含量变化幅度较大, 最高
为 0. 12435mg /片, 最 低为 0. 07844mg /片 , 平 均为 0.
108095mg /片,其原因可能与原药材来源不稳定或制剂操作
有关,制定质量标准时可考虑按 4批样品平均值的 2 /3 确定
其低限。
用薄层色谱及其扫描法对保精片进行绵萆 、甘草的鉴
别以及靛玉红的含量测定,方法可靠, 专属性强,可作为保精
片的质量控制标准。
参考文献
112中国医学科学院药物研究所.中药志1M2.第 1册,第 2版, 北京:
人民卫生出版社, 1982, 10: 301
122中国药典1M2. 一部,北京:人民卫生出版社,化学工业出版社,
1985, 65
(上接第 1590页)或诱导 GSH 合成,因而促进毒性代谢产物
解毒;或抑制 P - 450, 使足够的硫酸盐把 AAP 引向代谢途
径,从而减少毒性代谢产物形成, 保护肝细胞的结构和功能。
余甘子对 AAP 所致小鼠急性肝损伤有保护作用,提示其可
能是通过上述途径实现的。
TAA是通过干扰 RNA 从胞浆的转运过程而导致肝细
胞坏死的122。余甘子对 TAA 所致小鼠急性肝损伤有较好
的保护作用, 提示该药可能促进 RNA 从胞浆的转运, 从而
减轻肝损伤。
本实验分别采用 AAP、TAA 复制了两种小鼠急性肝损
伤模型, 观察余甘子水提醇沉物对急性肝损伤的保护作用。
结果表明,余甘子各剂量组能明显抑制 AAP、TAA等所致动
物肝损伤后血清中的 ALT、AST 和 ALP 的升高, 明显提高
糖元含量,显著降低肝脏系数, 改善肝组织病理状态, 减轻肝
细胞变性、坏死。说明余甘子对 AAP、TAA 等所造成的急性
肝损伤均具有较好的保护作用。上述两种毒物对肝脏损伤
的机理各不相同,因而可以认为余甘子对肝脏的保护作用不
是通过单一保护机制实现的。
参考文献
112吕圭源,王一涛主编.中药新产品开发学1M2.北京:人民卫生出
版社, 1997: 1397
122谢卓丘.六味地黄煎剂对小鼠实验性肝损伤的保护作用1J2.中国
药科大学学报, 1989, 20( 6) : 350
132陈奇主编.中药药理实验方法学,第一版1M2.北京:人民卫生出
版社, 1993, 837
142张小山,李宏春,古宇环,等.肝毒清对小鼠急性肝损伤保护作用
的药理研究1J2.新中医, 2000, 32( 1) : 35
#1593#
保精片质量控制方法研究