全 文 ：收稿日期: 2002- 07- 15
作者简介:蔡英卿 ( 1962- ) ,男 ,副教授 .研究方向:植物分子生物学与遗传资源 .
* 通讯作者 .
余甘子基因组 DNA提取及 RAPD反应条件优化
蔡英卿 1, 2 , 赖钟雄1* , 桑庆亮 1, 2 , 郭志雄 1 , 郭玉琼 1 , 潘东明 1
( 1.福建农林大学亚热带果树研究所 ,福建 福州 350002; 2.泉州师范学院生物系 ,福建 泉州 362000)
摘要: 以余甘子叶片为材料 ,研究了余甘子基因组 DNA提取方法及 RAPD反应条件 .结果表明 ,采用改良的 SDS方法 ,提
取的 DNA质量较高 ,适宜于 RAPD-PCR分析 .在 25μL反应体积中 , RAPD分析的优化反应体系为: 0. 6 mmo l· L- 1
Mg2+ 、 500- 600μmo l· L- 1 dN TP、 300 nmo l· L- 1随机引物、 25 ng DNA、 1.00- 1.25 U Taq DN A聚合酶 .
关键词: 余甘子 ; DN A提取 ; RAPD; 优化
中图分类号: S667.9, Q78 文献标识码: A 文章编号: 1006-7817( 2003) 01-0089-04
Genomic DNA extraction and optimization of RAPD analytic conditions of
Phyllanthus emblica L.
CAI Ying-qing
1, 2 , LAI Zhong-Xiong
1 , SAN G Qing-liang
1, 2 , GUO Zhi-x iong
1 , GUO Yu-qiong
1 ,
PAN Dong-ming
1
( 1. Institute of Subtr opical Fruits, Fujian Ag ricultur e and Fo restr y Univ ersity, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Depa rt-
ment of Bio lo gy , Quanzhou Teache rs Colleg e, Quanzhou, Fujian 362000, China)
Abstract: The method o f genomic DN A ex t raction and the optimiza tion o f RAPD analytic conditions w ere studied in Phy l-
lanthus emblica L. The r esults show ed tha t high g rade genomic DN A was obtained by the revised SDS method. Th e opti-
mal PCR sy stem fo r RAPD analysis w as as fo llow s: 0.6 mmo l· L- 1 Mg2+ , 500- 600μmo l· L- 1 dN TP, 300 nmol· L- 1
random primer , 25 ng DNA template, 1.00- 1.25 U Taq polymerase in 25μL reaction so lution.
Key words: Phyllanthus emblica L. ; DNA ex tr action; RAPD; optimi zation
余甘子 (Phyllanthus embl ica L. )是大戟科叶下珠属 (油柑属 )的一种落叶灌木或小乔木 ,其果实具有
抗衰老、抗癌等药用功效 ,是药食兼用的保健果品 .目前余甘子已成为我国沿海地区丘陵综合开发的重要
经济树种之一 [1 ] ,被联合国卫生组织指定为在全世界范围内推广种植的 3种保健植物之一 [ 2] .我国余甘子
种质资源非常丰富 ,但品种分类很混乱 ,建立余甘子种质资源与品种鉴别的方法十分迫切 . RAPD-PCR技
术 [3 ]是由 Williams et al于 1990年创立的一种 DN A分子标记技术 ,因其具有操作简单快捷 ,灵敏度高 ,通
用性好 ,且无需预先了解物种基因组的相关分子生物学信息等优点而广泛应用于种质资源分析 [4- 6 ] .鉴于
此 ,我们拟采用 RAPD技术进行余甘子种质资源的研究 .本文首先报道余甘子基因组 DNA提取方法及其
RAPD-PCR分析的最佳反应体系 ,为进一步进行余甘子种质资源的 RAPD分析奠定基础 .
1　材料与方法
1.1　材料
余甘子主栽品种“粉甘”成年树嫩叶采自福建农林大学校园 .取新鲜叶片置于 - 20℃保存 1 d,次日提
取 DNA,或置 - 70℃超低温冰箱保存备用 .
1.2　试剂与仪器
Taq酶、 dN TP、随机引物、 10× Buf fer ( 500 mmo l· L- 1 KCl、 15 mmo l· L- 1 MgCl2、 100 mmol· L- 1
Tris-HCl , pH 8.3)均购自 Sangon公司 (上海生工生物工程公司 ) ; 100 bp DN A Ladder M arker为宝生物
工程有限公司 ( T AKARA)产品 ;其余均为国产或进口分析纯试剂 . Mastercycler Gradient PCR仪为德国
Eppendo rf公司产品 .
福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷 第 1期
Journal of Fujian Ag riculture and Fo restr y Univ er sity ( Na tural Science Edition) 2003年 3月
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 2003. 01. 021
1.3　余甘子基因组 DNA的提取
采用改良的 SDS方法 [7 ]提取余甘子基因组 DNA.取 0.75 g幼嫩叶片于冰冻预冷研钵中 ,加液氮研磨
至粉状 ,移至 10 mL离心管中 ,加 3 500μL提取缓冲液 Ex t BufferⅠ [8- 10 ] [500 mmo l· L- 1 NaCl、 100
mmol· L- 1 Tris-HCl ( pH 8.0)、 50 mmol· L- 1 EDT A ( pH 8.0)、 10 mmol· L- 1 2-巯基乙醇、 30 g· L- 1
PV P] ,同时加入 500μL 200 g· L- 1 SDS,振荡混匀后于 65℃水浴中温育 20 min,期间不时轻摇 .加 1 500
μL 5 mol· L- 1 KAc混匀 ,于冰水上反应 20 min,后于 25 000 g、 4℃下离心 20 min.取上清液 ,并移到另
一 10 mL离心管中 ,加 2 500μL异丙醇 ,混匀 ,放在 - 20℃冰箱中 40 min.取出于 20 000 g、 4℃下离心
20 min.弃上清液 ,将离心管倒扣于灭菌滤纸上 10 min,排尽残液 ,并加入 700μL Ex t Buf ferⅡ 液 ( 50
mmol· L- 1 Tris-HCl、 10 mmol· L- 1 EDT A, pH 8.0) ,静置 1 h,然后转移到 1. 5 mL Eppendorf管中 , 15
000 g、 4℃下离心 25 min,取上清液于另一 1.5 mL Eppendo rf管中 ,加 75μL冰预冷 3mol· L- 1 NaAc,同
时加入 500μL异丙醇 ( 0.6- 1. 0倍体积 )充分混匀 ,静置 5min,之后于 10 000 g、 14℃下离心 10 min.弃上
清液 ,以 30μL冰预冷体积分数为 80%的乙醇沉淀 ,常温下 8 000 r· min- 1离心 2 min.弃上清液 ,加 150
μL TE Buffer ( 10 mmo l· L- 1 Tris-HCl、 10 mmol· L- 1 EDT A, pH 8.0)于 4℃或常温溶解后 ,移入 - 20
℃冰箱中保存备用 .
1.4　基因组 DNA检测
将提取的 DNA样品用 T E Buffer适当稀释 ,经 W FZ800-D3B型紫外可见光分光光度计检测 ,读取
260 nm和 280 nm的 D值 ,以 8 g· L- 1琼脂糖凝胶电泳分析检测 DNA的完整性 .
1.5　 PCR扩增条件优化
扩增反应的总体积 25μL[含 1μL 10× Buffer ( 500 mmo l· L- 1 KCl、 15 mmol· L- 1 MgCl2、 100 mmol
· L- 1 Tris-HCl, pH 8.3) ,比较 DNA模板、 Taq酶用量以及 dN TP、随机引物浓度对 RAPD扩增的影响 ,
寻找优化条件 .优化条件试验所用引物为 Sangon公司产品 S22 ,优化组合检验试验所用引物分别为 S36、
S55、 S56 .反应程序为: 94℃ ,预变性 4 min; 94℃ ,变性 1 min→ 38℃ ,复性 1. 5 min→ 72℃ ,延伸 2 min, 45
个循环 ;最后一个循环 72℃、延伸 10 min.取 8μL扩增产物用于 15 g· L- 1琼脂糖凝胶电泳 , EB染色 ,用
BIO-RAD凝胶成像仪观察 ,拍照 .
2　结果与分析
　 1- 4. DN A样品 ; M . 100 bp DN A Ladder Mark er.
　图 1　余甘子基因组总 DNA电泳图谱
　 Fig. 1　 Th e gel-electroph oresis profil es of the to-
tal genomic DNA of P . embl ica
2.1　余甘子 DNA的提取
所提取的 DNA样品的色泽为白色或近白色 ,D ( 260 nm ) /
D ( 280 nm )为 1.70- 1.89, DN A产量高 , DN A的得率为 238.5-
360.0μg· g- 1 . DN A琼脂糖电泳图谱如图 1所示 .由图 1可以
看出 ,余甘子基因组 DNA电泳得到的条带比较整齐、清晰 ,基
本无降解 ,完整性好 .由此可见 ,所提取 DNA的质量和产量都
较高 .
DN A提取质量往往是 RAPD分析成功与否的关键 .余甘
子叶片中含有大量的酚类物质 ,易与 DNA结合成复合物 ,难溶
解 ,又易抑制 Taq酶活性 ,从而影响 PCR扩增 .本试验采用新
鲜幼嫩的余甘子叶片为材料 ,同时又在提取液中加入 30 g·
L
- 1
PV P,有效地消除了酚类物质的干扰 .
2.2　模板 DNA用量对 PCR扩增的影响
模板 DNA的用量是制约 RAPD扩增产量及特异性的一个
因素 .本试验设置 4个梯度 ( 25、 50、 75、 100 ng )进行扩增试验 ,
结果见图 2.由图 2可见 ,模板用量为 25 ng时扩增带数多而且清淅 ; 50 ng时次之 , 75 ng时更次 .因此 ,适
宜的模板 DNA用量为 25 ng.
·90· 福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
2.3　 Taq DNA聚合酶用量对 PCR扩增的影响
本试验设置了 0. 75、 1.00、 1.25、 1.50、 2.00 U Taq聚合酶用量梯度进行扩增比较 ,结果如图 3所示 .由
图 3可见 , Taq聚合酶用量为 0. 75 U时 , DN A扩增强度极弱 ,几乎扩增不出条带来 .用量为 1.00- 1.25 U,
扩增出的条带数量多且较清晰 .用量上升到 1. 50和 2. 00 U时 ,扩出的条带逐渐变得模糊不清 .因此 , Taq
酶用量以 1.00- 1.25 U为宜 .
2.4　 dNTP浓度对 PCR扩增的影响
本试验分别比较了 200、 300、 400、 500、 600μmo l· L- 1 dN TP对扩增的影响 ,结果如图 4所示 .由图 4
可以看出 , dN TP浓度为 200- 400μmo l· L- 1时 ,条带无或较模糊 ;当提高到 500- 600μmol· L- 1时 ,条
带较多且较清晰 .由于 dN TP能与 Mg2+ 结合而且影响反应液中游离 Mg2+ 的浓度 ,因此所需最大激活
Taq酶活性的精确 Mg2+浓度就取决于 dN TP浓度 .如果 dN T P浓度过低 , Mg2+ 不能有效地激活 Taq酶 ,
合成产物的量就少 ,如果 dN TP浓度高 , dN T P与 Taq酶竞争与 Mg2+结合 ,使 Taq酶无法正常完全发挥
聚合作用 .从本试验看 , dN TP浓度以 500- 600μmol· L- 1较合适 .
1- 4.模板 DN A用量依次为 25、 50、 75、
100 ng; M . 100 bp DNA Ladder Mark er.
图 2　模板 DNA用量对扩增结果
的影响
Fig. 2　 Ef fect of tem plate DN A concen-
t ration on RAPD resul ts
　
1- 5. Taq酶用量依次为 0. 75、 1. 00、
1.25、 1.50、 2.00 U; M . 100 bp DN A Lad-
der Mark er.
图 3　 Taq DNA聚合酶用量对扩增
结果的影响
Fig. 3　 Effect of Taq DNA polymerase
concent rat ion on RAPD resul ts
1 - 5. dN T P浓度分别为 200、 300、 400、
500、 600μmol· L- 1; M . 100 bp DNA Lad-
der Mark er.
图 4　 dNTP浓度对扩增结果的影响
Fig. 4　 Effect of dN T P concent rations on
RAPD resul ts
　
　 1- 5.引物浓度分别为 200、 300、 400、 500、
600 nmol· L- 1; M. 100 bp DNA Ladd er
M ark er.
　图 5　引物浓度对扩增结果的影响
　 Fig. 5　 Ef fect of random prim er concent ra-
tion on RAPD result s
2.5　引物浓度对 PCR扩增的影响
RAPD扩增时 ,有的引物可能对于某一基因组 DNA不能扩增 ,
所以应先对引物进行筛选 ,再设置梯度进行优化 .本试验在预备试验
中已初步筛选出可以扩增出较多条带的 S22引物 ,所以我们设置
200、 300、 400、 500、 600 nmol· L- 1等 5个引物浓度 ,扩增结果见图
5.由图 5可见 ,引物浓度为 300 nmol· L- 1时能扩增出的条带多且
清晰 ,太高或太低扩增效果都不好 .因此 ,引物浓度以 300 nmol·
L
- 1为宜 .
2.6　 RAPD反应程序的确定
扩增反应的程序对扩增效果的影响也很大 .我们在参考一般
RAPD分析的反应程序的基础上 ,经过反复试验 ,确定适宜的 PCR
扩增程序为: 94℃ ,预变性 4 min; 94℃ ,变性 1 min→ 38℃ ,复性 1.5
min→ 72℃ ,延伸 2 min, 45个循环 ; 72℃ ,延伸 10 min.在此反应程
序下 ,按照上述优化反应条件 ,即:在扩增反应总体积 25μL中 ,包含
0. 6 mmol· L- 1Mg2+ 、 500μmol· L- 1 dN TP、 300 nmol· L- 1引物、
·91·第 1期 蔡英卿等: 余甘子基因组 DN A提取及 RAPD反应条件优化
　 1- 3.所用引物分别为 S36、 S56、 S55;
M . 100 bp DNA Ladder Mark er.
　图 6　优化体系的扩增结果
　 Fig. 6　 Am pli fi ed resul ts u nder the op ti-
mal RAPD conditions
25ng模板 DNA、 1. 25 U Taq DN A聚合酶 ,进行 RAPD扩增 ,结果如
图 6所示 .由图 6可以看出 ,扩增出的条带都较清晰 .通过多次试验 ,扩
增结果稳定性好 .
3　讨论
从本试验可以看出 ,采用改良的 SDS法 ,可以从余甘子叶片中提
取较高纯度和产量的 DNA,该方法适宜作为余甘子的 RAPD分析 .其
技术关键之一是在细胞核被裂解之前 ,加入 PV P来消除酚类物质和蛋
白质的干扰 ;其次是采用幼嫩的叶片作为提取材料 ,因为幼嫩叶片积累
的次生物质较少 .
RAPD-PCR反应涉及诸多因子 ,且对每个因子参与反应体系的条
件极为敏感 .通过对余甘子 RAPD-PCR反应体系中影响扩增结果的
因素分析研究 ,建立了余甘子 RAPD的优化反应系统 ,即在 25μL反
应体积中 ,含 0. 6 mmol· L- 1 Mg2+ 、 500- 600μmol· L- 1 dN T P、 300
nmo l· L- 1引物、 25 ng模板 DNA、 1. 00- 1. 25 U Taq DN A聚合酶 .该研究对进一步进行余甘子种质资源
的 RAPD分析以及相关的分子生物学研究有重要参考价值 .
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(责任编辑:施晓棠 )　　
·92· 福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷