全 文 ：洋椿苦素对人宫颈癌 Hela细胞增殖的抑制作用研究
刘 怡1，陈 辉2，王 凤1，阙昌田1，杨胜群1，曾 南1*
(1 成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室———
省部共建国家重点实验室培育基地，成都 611137;2 电子科技大学附属医院·四川省人民医院，成都 610072)
摘 要 目的:研究洋椿苦素(cedrelone)体外对人宫颈癌 Hela细胞增殖的抑制作用，并探讨其诱导细胞凋亡的作用机制。方
法:采用 CCK-8 法计算不同浓度的洋椿苦素作用人宫颈癌 Hela细胞后的 IC50及增殖抑制率;Hoechst 33258 荧光染色法和流式细胞
术 Annexin V-FITC / PI双染法检测洋椿苦素对 Hela细胞凋亡的诱导作用;流式细胞术 PI单染法检测洋椿苦素对 Hela细胞生长周
期的影响;Ｒeal-time PCＲ法测定 CDK2、cyclinA mＲNA 表达。结果:不同浓度的洋椿苦素作用 Hela细胞 48 小时后均能抑制其生长，
其 IC50值为 1． 4μg /ml。洋椿苦素作用 24 小时后，Hela细胞呈典型的凋亡形态学改变，细胞体积缩小，胞核致密浓染，呈半月状或呈
碎块状。0． 21μg /ml、0． 42μg /ml、1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1． 89μg /ml、4． 22μg /ml的洋椿苦素作用 Hela细胞 24 小时后的凋亡率分别
为 3%、4． 1%、6． 2%、7%、8． 4%、58． 5%。洋椿苦素作用于 Hela细胞 24 小时后，可使细胞生长停滞在 S期，即 DNA合成期，并剂量
依赖性地下调 CDK2、cyclinA mＲNA表达水平。结论:洋椿苦素对人宫颈癌 Hela 细胞增殖具有良好抑制作用，作用发挥与下调
CDK2、cyclinA mＲNA表达从而抑制 Hela细胞 S期 DNA合成，诱导其凋亡有关。
关键词 洋椿苦素;Hela细胞;细胞凋亡;细胞周期;细胞周期调控因子;流式细胞术
洋椿苦素(cedrelone)是从巴西当地植物鹧鸪花属巴西海木
(Trichilia catigua A)中分离出来的一种柠檬酸类化合物。巴西
海木作为一种民间滋补药，可治疗勃起功能障碍、健忘，并缓解
疲劳，民间应用较广泛。近年来，体内外实验证实柠檬酸类化合
物可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡而干扰癌细胞转移。已
有研究表明洋椿苦素能抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖、
粘附、迁移并诱导其凋亡［1，2］，本实验旨在探究洋椿苦素对人宫
颈癌 Hela细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 洋椿苦素，白色粉末，规格 5 mg，纯度≥98%，
上海源叶生物技术有限公司，批号 1254859。称取 4． 22 mg洋椿
苦素粉末，加入 100μl 二甲基亚砜(DMSO)溶液充分溶解配制
成 42． 2mg /ml储备液，4℃冰箱保存，备用。吸取洋椿苦素储备
液 1μl至 1ml离心管中，加入 9μl DMSO溶液稀释至 10μl，再取
稀释液 1μl同法稀释 1 次，使之终浓度为 0． 42mg /ml，取 10μl进
样测定。色谱条件如下:高效液相色谱仪:Waters2695;固定相:
Phenomenex C18 色谱柱，4． 8 × 250mm，5μm;流动相:70% 水，
30%乙腈;流速:1ml /min;柱温:30℃。纯度测定人为四川省人
民医院临床药学部白雨鑫，洋椿苦素高效液相图谱见图 1。长
春碱，白色粉末，规格 5mg，纯度≥98%，Selleckchem 公司，批号
S1248，称取 5 mg长春碱粉末，加入 61． 7μl DMSO溶液充分溶解
配制成 81mg /ml母液，4℃冰箱保存，备用。
图 1 洋椿苦素高效液相色谱图
1． 2 细胞 人宫颈癌 Hela 细胞，四川省人民医院人类疾病基
因研究四川省重点实验室提供。
1． 3 试剂 CCK-8 试剂盒，索莱宝公司，批号 20150408 ;Ho-
echst试剂盒，碧云天公司，批号 C0003-2;Annexin V-FITC /PI 双
染试剂盒、细胞周期 DNA提取试剂盒，南京凯基公司，批号分别
为 20150528、20150511;DMEM 培养基，美国 life 公司，批号
2015-02;磷酸缓冲液(PBS)、双抗溶液、胰蛋白酶，美国 Hyclone
公司，批号分别为 AZC183924、J120051、20140707;胎牛血清，四
季青公司，批号 140922;二甲基亚砜(DMSO)溶液，美国 Sigma-
Aldrich公司;Trizol，Invitrogen 公司，批号 15596026 ;HiFiScript
cDNA第一链合成试剂盒，康为世纪公司，批号 00071407;引物，
上海生工生物工程技术服务有限公司。
1． 4 仪器 FC酶标仪(美国 Thermo公司)，BX51 荧光显微镜
(日本 OLYMPUS 公司)，FC 500 MCL /MPL 流式细胞仪(美国
Beckman Counter)，CCL-050A-8 CO2 恒温细胞培养箱(新加坡
ESCO公司)，900LC1200LC-1 超净工作台(Heal Force 公司)，
7500 Fast System Q-PCＲ仪(美国 Applied Biosystems公司)。
1． 5 方法 Hela细胞用含有 10%胎牛血清、1%双抗溶液的高
糖 DMEM培养于 37℃、5% CO2 培养箱中，当细胞密度汇合至
90% ～95%时，用 0． 25%的胰酶消化传代。
1． 5． 1 CCK-8 法测定洋椿苦素对 Hela细胞增殖的影响 Hela
细胞以 5 × 103、100μl /孔接种于 96 孔板中，37℃、5% CO2 培养
箱中培养 24 小时，待细胞汇合至 60% ～ 80%时，弃去培养液，
各组分别加入 100μl 用含有 2% 胎牛血清、1% 双抗溶液的
DMEM溶液稀释的 0． 42μg /ml、1． 05μg /ml、2． 1μg /ml、3． 15μg /
ml、4． 22μg /ml的洋椿苦素溶液，空白对照组为含有 0． 1% DM-
SO的 DMEM 溶液，另设长春碱对照组，浓度分别为 40． 55μg /
ml、8． 11μg /ml、1． 62μg /ml、0． 81μg /ml、0μg /ml，每组 3 个复孔。
于培养箱中孵育 48 小时后，每孔加入 100μl 的 CCK-8 溶液，置
于培养箱中孵育，4 小时后酶标仪测定 450nm处的吸光度(OD)
值。所得数据用 Graph Prism 处理，计算洋椿苦素及长春碱对
56中药药理与临床 2016;32(1)
* 通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.01.018
Hela细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)。实验重复 3 次。
细胞增殖率 =(给药组 OD值 /对照组 OD 值)× 100%;细胞增殖抑
制率 =［(1 －给药组 OD值)/对照组 OD值］× 100%。
1． 5． 2 Hoechst 染色法观察细胞凋亡形态变化 细胞爬片在
75%乙醇中浸泡 5 分钟，超净工作台内吹干后置于六孔板中，每
孔接种 2 × 105 个细胞，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 24 小时，
待细胞汇合至 60% ～ 80%时，弃去培养液，每孔分别加入 2ml
浓度为 0． 21μg /ml、0． 42μg /ml、1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1． 89μg /
ml的洋椿苦素溶液，0． 1% DMSO 溶液为对照组。培养箱中孵
育 24 小时后，弃去培养液，用 PBS 清洗 3 遍，加入 0． 5ml 固定
液，固定 10 分钟后去固定液，PBS 清洗 3 遍，每孔加入 0． 5ml
Hoechst33258 染色液，染色 5 分钟。去染色液，PBS 清洗 3 遍。
滴一滴抗荧光淬灭液于载玻片上，盖上贴有细胞的细胞爬片，
让爬片接触封片液。荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化
并照相。实验重复 3 次。
1． 5． 3 Annexin V-FITC /PI 双染法检测 Hela 细胞凋亡 Hela
细胞以每孔 2 × 105 个细胞接种于六孔板中，置于 37℃、5% CO2
培养箱中培养 24 小时。待细胞汇合至 60% ～ 80%时，去培养
液，每孔分别加入 2ml 浓度为 0． 21μg /ml、0． 42μg /ml、1． 05μg /
ml、1． 47μg /ml、1． 89μg /ml、4． 22μg /ml 的洋椿苦素溶液，0． 1%
DMSO溶液为对照组。24 小时后，用不含 EDTA 的胰酶消化收
集各组细胞于 1． 5ml EP管中，离心(1500rpm，5 min)后，用 PBS
清洗 2 遍，加入 500μl Binding Buffer 充分吹打重悬细胞，加入
5μl Annexin V-FITC和 5μl PI，混匀，室温避光孵育 15 分钟，上
流式细胞仪检测。实验重复 3 次。
1． 5． 4 PI单染法检测细胞周期 同 1． 5． 4方法将药物作用于细
胞、收集细胞后，离心(1500rpm，5 min)，用 PBS清洗 2 遍，每管加
入 500μl 70%乙醇，4℃，过夜。弃去乙醇，PBS 清洗 2 遍，加入
100μl ＲNA酶溶液，37℃水浴 30 分钟，再加入 400μl PI 溶液，
4℃，避光孵育 30分钟。上流式细胞仪检测。实验重复 3次。
1． 5． 5 Ｒeal-time PCＲ法检测 CDK2、cyclinA mＲNA表达 Hela
细胞以 5 × 105 个细胞接种于 60mm 培养皿中，置于 37℃、5%
CO2 培养箱中培养 24 小时。待细胞融合至 60% ～80%时，去培
养液，每孔分别加入 3ml 浓度为 1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1．
89μg /ml的洋椿苦素溶液，0． 1% DMSO 溶液为对照组。24 小
时后，弃培养液，用 Trizol 法提取细胞总 ＲNA，进行纯度鉴定。
以提取的总 ＲNA为模板，按试剂盒说明反转录合成 cDNA。实
验所用引物及碱基序列见表 1。PCＲ 反应体系:UltraSYBＲ Mix-
ture (with ＲOX II)(2 ×)5 μl，PCＲ Forward Primer(5 μM)0．
25μl，PCＲ Ｒeverse Primer(5 μM)0． 25μl，cDNA 4． 5μl，总体积 10
μl。PCＲ反应程序:50℃，20s;95℃，10 min;95℃，15s，60℃，1
min，循环 42 次;95℃，30s。实验数据根据目的基因和内参基因
各自的 C t值，采用相对定量 2 －△△C t法计算出各样品中目的基
因的相对表达量。各组实验数据应用 Graph Prism 5 软件进行
数据处理和 t-test分析。
表 1 GAPDH、CDK2、cyclinA引物序列
基因名称 引物类别 序列(5＇to 3＇) 大小
GAPDH Forward GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 138bp
Ｒeverse TGGTGAAGACGCCAGTGGA
CDK2 Forward TGCCTGATTACAAGCCAAGTT 197bp
Ｒeverse GAGTCGAAGATGGGGTACTGG
cyclinA Forward CACTCACTGGCTTTTCATCTTC 104bp
Ｒeverse CAGAAAACCATTGGTCCCTC
2 结果
2． 1 洋椿苦素对 Hela细胞生长的影响 不同浓度洋椿苦素均
能抑制 Hela细胞生长，并随着洋椿苦素浓度的提高，其对 Hela
细胞的抑制作用越显著，洋椿苦素对 Hela细胞生长的 IC50为 1．
4μg /ml。长春碱对 Hela细胞生长的 IC50为 8． 05μg /ml。不同浓
度的洋椿苦素及长春碱对 Hela 细胞增殖率与增殖抑制率的影
响见表 2、表 3。
表 2 不同浓度洋椿苦素体外对 Hela细胞增殖生长的影响(珋x ± s，n
= 4)
药物
浓度
(μg /ml)
OD值
增殖率
(%)
增殖抑制率
(%)
0 2． 01 ± 0． 09 100
0． 42 1． 80 ± 0． 1 89． 66 ± 4． 87* 10． 34 ± 4． 87*
洋椿苦素 1． 05 1． 25 ± 0． 08 62． 42 ± 4． 08＊＊ 37． 58 ± 4． 08＊＊
2． 1 0． 54 ± 0． 05 26． 65 ± 2． 56＊＊ 73． 35 ± 2． 56＊＊
3． 15 0． 52 ± 0． 05 25． 76 ± 2． 30＊＊ 74． 24 ± 2． 30＊＊
4． 22 0． 43 ± 0． 02 21． 45 ± 0． 95＊＊ 78． 55 ± 0． 95＊＊
与空白组比较 * P ＜0． 05，＊＊ P ＜0． 01(下同)
表 3 不同浓度长春碱体外对 Hela细胞的增殖率(珋x ± s，n = 4)
药物
浓度
(μg /ml)
OD值
增殖率
(%)
增殖抑制率
(%)
0 1． 39 ± 0． 29 100
长春碱 0． 81 1． 06 ± 0． 08 75． 86 ± 5． 69＊＊ 24． 14 ± 5． 69＊＊
1． 62 0． 70 ± 0． 08 50． 13 ± 4． 48＊＊ 49． 87 ± 4． 48＊＊
8． 11 0． 61 ± 0． 01 44． 02 ± 0． 98＊＊ 55． 98 ± 0． 98＊＊
40． 55 0． 49 ± 0． 01 35． 20 ± 0． 76＊＊ 64． 80 ± 0． 76＊＊
2． 2 洋椿苦素对 Hela细胞形态学的影响 Hoechst33258 荧光
染色照片显示，对照组 Hela细胞形态饱满，结构完整，呈正常均
匀蓝色。0． 21μg /ml、0． 42μg /ml 的洋椿苦素作用后，细胞形态
与对照组相比无明显变化。1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1． 89μg /ml
洋椿苦素作用 Hela细胞 24 小时后，细胞表现为典型的凋亡形
态学改变，即细胞体积缩小，胞核呈致密浓染，呈半月状或呈碎
块状，见图 2。
图 2 洋椿苦素对 Hela细胞形态变化的影响
A:空白组;B:0． 21μg /ml洋椿苦素;C:0． 42μg /ml 洋椿苦素;D:1． 05μg /
ml洋椿苦素;E:1． 47μg /ml洋椿苦素:F:1． 89μg /ml洋椿苦素
2． 3 洋椿苦素对 Hela细胞凋亡的影响 见图 3。流式细胞术
Annexin V-FITC /PI双染法检测可区别活细胞、死亡细胞、早期
凋亡细胞和晚期凋亡细胞。正常细胞 FITC 及 PI 拒染(A － /P
－)，在流式细胞分析图上为 C3 区域;早期凋亡细胞为 A + /P
－，在分析图上为 C4 区域;晚期凋亡细胞或坏死细胞为 A + /P
66 中药药理与临床 2016;32(1)
+，在分析图上为 C2 区域。由图 3 可知，0． 21μg /ml、0． 42μg /
ml 、1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1． 89μg /ml 和 4． 22μg /ml 洋椿苦素
作用 Hela细胞 24 小时后，细胞凋亡率(C2 + C4)分别为 3%、4．
1%、6． 2%、7%、8． 4%、58． 5%，空白组为 3． 4%。
图 3 洋椿苦素对 Hela细胞凋亡的影响
A:空白组;B:0． 21μg /ml洋椿苦素;C:0． 42μg /ml洋椿苦素;D:1． 05μg /ml 洋椿苦素;E:1． 47μg /ml 洋椿苦素:F:1． 89μg /ml 洋椿苦素;G:4． 22μg /ml
洋椿苦素
2． 4 洋椿苦素对 Hela细胞周期的影响 PI单染法检测细胞周
期结果显示，Hela细胞经洋椿苦素作用 24 小时后，Hela 细胞被
强烈阻滞在 S期。且随洋椿苦素浓度升高，细胞周期阻滞作用
显著增强，0． 21μg /ml、0． 42μg /ml 、1． 05μg /ml、1． 47μg /ml、1．
89μg /ml和 4． 22μg /ml洋椿苦素作用后，Hela 细胞中处于 S 期
的细胞比例分别为 27． 4%、31． 7%、32%、41． 5%、61． 9%、72．
3%，对照组为 30． 4%，见图 4。
2． 5 洋椿苦素对 Hela 细胞 CDK2、cyclinA mＲNA 表达的影响
见表 4，随洋椿苦素浓度升高，CDK2、cyclinA mＲNA 表达下
降。
表 4 洋椿苦素对 Hela细胞 CDK2、cyclinA mＲNA表达的影响(珋x ±
s，n = 4)
组别
浓度
(μg /ml)
CDK2 mＲNA
相对表达量
cyclinA mＲNA
相对表达量
空白对照 1 1
洋椿苦素 1． 05 0． 83 ± 0． 53* 0． 54 ± 0． 23
洋椿苦素 1． 47 0． 74 ± 0． 18＊＊ 0． 44 ± 0． 06＊＊
洋椿苦素 1． 89 0． 47 ± 0． 33＊＊ 0． 09 ± 0． 02＊＊
图 4 洋椿苦素对 Hela细胞周期的影响
A:空白组;B:0． 21μg /ml洋椿苦素;C:0． 42μg /ml洋椿苦素;D:1． 05μg /ml 洋椿苦素;E:1． 47μg /ml 洋椿苦素:F:1． 89μg /ml 洋椿苦素;G:4． 22μg /ml
洋椿苦素
76中药药理与临床 2016;32(1)
3 讨论
宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二大常
见肿瘤。目前，临床治疗以手术切除、放疗、化疗相结合的综合
疗法为主。但宫颈癌对多数抗癌药物不敏感，化疗有效率不超
过 15%［3］，因此寻求一种高效的抗宫颈癌药物显得尤为迫切。
洋椿苦素作为一种新的提取物，已被证实可诱导乳腺癌细胞凋
亡，但其对人宫颈癌 Hela细胞的作用鲜见报道。因此本实验以
Hela细胞为研究对象，观察洋椿苦素对肿瘤细胞增殖的影响。
CCK-8 法实验发现，不同浓度的洋椿苦素作用 Hela 细胞 48 小
时后，能明显抑制其增殖，且随药物浓度的提高，抑制作用增强，
一定范围内呈剂量-效应依赖关系，半数抑制浓度为 1． 4μg /ml。
无限增殖是癌细胞的特性之一，而细胞凋亡是细胞死亡的
主要方式［4］，因此诱导癌细胞凋亡是评价抗癌药物疗效的一个
重要指标。细胞形态尤其是细胞核形态改变是细胞凋亡最典
型的特征，是判定凋亡最直观的指标之一，目前流式细胞术 An-
nexin V-FITC /PI 双染法是常用检测方法［5，6］。本实验显示，洋
椿苦素作用 Hela 细胞 24 小时后，Hoechst 荧光染色和 Annexin
V-FITC /PI双染法均证实细胞发生凋亡形态学改变，早期及晚
期凋亡细胞增加，且有一定剂量依赖关系。
细胞增殖是通过细胞周期调控实现的。细胞增殖周期失
控是癌细胞的重要特征［7］，因此诱导癌细胞周期阻滞是抗癌治
疗的一个重要思路。流式细胞术 PI双染法实验显示，洋椿苦素
作用 Hela细胞 24 小时后，细胞生长停留在 S 期，即 DNA 合成
期［8］，导致细胞内 DNA 合成受阻，提示洋椿苦素能通过抑制
Hela细胞 S期 DNA合成从而影响其增殖，并诱导凋亡。
细胞周期蛋白(cyclins)与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶
(cyclin dependent kinase，CDKs)均为细胞周期调控因子，二者在
细胞周期中起正向调节作用。细胞周期蛋白分为 cyclinA、cy-
clinB、cyclinC、cyclinD、cyclinE 五种亚型，cyclinA 为细胞在 S 期
所必需的周期蛋白。细胞中存在多种 CDKs，S 期主要受 CDK2
调控，CDK2 与 cyclinA特异性结合，参与细胞 DNA 的复制与合
成，并促进细胞分裂。cyclinA /CDK2 复合物正常表达可使细胞
顺利完成 DNA合成并通过 S期，如果该复合物表达出现异常升
高，则使具有缺陷的 DNA 丧失修复时间而直接进入细胞周期，
致使其出现异常增殖即生成肿瘤［9，10，11］。本实验显示洋椿苦素
作用 Hela细胞 24 小时后，可下调 CDK2、cyclinA mＲNA水平，抑
制二者的活性。
综上，本实验表明洋椿苦素可抑制 Hela 细胞增殖，诱导其
凋亡，并使 Hela 细胞生长停滞在 S 期，并下调 CDK2、cyclinA
mＲNA表达水平，提示洋椿苦素可通过影响 CDK2、cyclinA 表达
实现对 Hela细胞 S期 DNA合成的阻滞。但 CDK2、cyclinA仅仅
是细胞周期调控因子中很局限的一部分，本实验目前仅观察了
洋椿苦素对 Hela细胞中细胞周期正向调控因子的影响，未涉及
负向调控因子，如 p21、p27。而正向调控因子与负向调控因子
与其上下游蛋白之间是一个复杂的调控网络，包括多种信号通
路，信号通路之间常常亦是相互影响的。因此，洋椿苦素作用
Hela细胞的分子机制尚需深入研究。
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The study of cedrelone inhibiting human cervix cancer Hela cells proliferation
Liu Yi1，Chen Hui2，Wang Feng1，Qu Chang Tian1，Yang Sheng Qun1，Zeng Nan1*
(1Pharmacy College，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137;2Affiliated Hospital of University of Electronic Science and
Technology·Sichuan Provincial People＇s Hospital，Chengdu 610072)
Objective:To investgate the effect of cedrelone on proliferation of human cervix cancer Hela cells in vitro and to explore the molecular
mechanism．Methods:The CCK-8 assay was employed to dertermine the IC50 values and inhibiton rate of cedrelone on Hela cells． Cells apop-
tosis were detected by Hoechst 33258 fluorescent staining and Annexin V-FITC /PI double staining assay via flow cytometric analysis． Cell cy-
cle was detected by PI single staining through flow cytometric analysis． The expression of CDK2 and cyclinA was dectected by Ｒeal-time PCＲ．
Ｒesults:After the treatment with different concentration of cedrelone for 48 hours，Hela cells growth was inhibited and the IC50 of cedrelone on
86 中药药理与临床 2016;32(1)
Hela cells was 3． 345 μg /ml． Marked morphological changes of cell apoptosis such as condensation of chromatin and nuclear fragmentations
were found after Hela cells were treated with cedrelone for 24 hours． After treated with 0． 5，1，2． 5，3． 5，4． 5，10μg /ml cedrelone for 24
hours，the inhibition rate of Hela cells was 3%，4． 1%，6． 2%，7%，8． 4%，58． 5%，respectively and the control group was 3． 4% ． The cell cy-
cle was arrested in S phase via the treatment with cedrelone for 24 hours，which lead to inhibit DNA synthesis． The expression of CDK2，cycli-
nA mＲNA was down-regulated． Conclusion:It was indicated that cedrelone could influence the proliferation of Hela cells and induce apoptosis
via suppressing DNA synthesis in S phase via down-regulating the expression of CDK2 and cyclinA．
Key words cedrelone(洋椿苦素);Hela cells;cell apoptosis;cell cycle;cell cycle regulator;flow cytometry
西瑞香素体外抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞增殖的活性研究
*
黄俊飞1，2，3，俸婷婷1，2，3，陆 毅1，2，3，张 雪1，2，3，陈丽珍，周 英1，2，3＊＊
(1 贵州大学 药学院，贵阳 550025;2 贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵阳 550025;
3贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵阳 550025)
摘 要 目的:研究西瑞香素对破骨细胞分化及成骨细胞增殖作用的影响。方法:以依普黄酮(10-8 mol /L)作为阳性对照，采
用 1α，25-(OH)2VitD3 诱导乳兔骨髓细胞获得破骨细胞，通过 TＲAP活力测定、TＲAP +细胞计数和骨吸收陷窝面积检测西瑞香素
对破骨细胞分化及骨吸收活性的影响;并采用 MTT法测定西瑞香素对 MC3T3-E1Subclone14 成骨细胞增殖作用的影响。结果:不同
浓度的西瑞香素均对破骨细胞分化及骨吸收活性均具有抑制作用，其中 10-5 mol /L剂量组的抑制作用最为显著;西瑞香素对成骨细
胞增殖具有促进作用，其中 10-5 mol /L剂量组的促进作用最为显著。结论:西瑞香素能抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞增殖。
关键词 西瑞香素;破骨细胞;骨吸收;成骨细胞
西瑞香素(Daphnoretin)为香豆素类化合物，在菊科、芸香
科、云实科、豆科以及瑞香科植物中均有发现，其中大量存在于
了哥王中［1］，具有抗病毒［2］、抗肿瘤［3］、抗炎［4］等作用，而在抗
骨质疏松的作用方面未见相关报道。原发性骨质疏松症是以
骨量减少，骨组织的显微结构发生改变，以松质骨骨小梁变细、
断裂、数量减少，皮质骨多孔和变薄为特征，以致骨的脆性增高，
易发生骨折的一种全身性骨骼疾病［5］。其中破骨细胞的异常
分化导致骨量减少，从而促使骨质疏松病症发生，破骨细胞是
骨髓系细胞经细胞因子 ＲANKL 和 M-CSF 共同刺激后分化而
成，在维持骨代谢平衡中发挥重要作用［6］。破骨细胞的形成和
活性异常可导致骨质疏松、类风湿关节炎、关节置换后假体无
菌性松动等许多疾病，因此破骨细胞是治疗这些疾病的药物作
用靶点之一［7］，除此之外，治疗骨质疏松还可通过促进成骨细
胞增殖来实现。本研究采用抗骨质疏松的市售药依普黄酮为
阳性对照，研究西瑞香素对破骨细胞及成骨细胞的活性作用，
旨在为抗骨质疏松药物的开发提供数据支持和理论依据。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 西瑞香素(Cas:2034-69-7，分子式:C19 H12 O7，
MW:352． 3;标品:由中检所提供，含量以 99． 4%计;样品:购于
上海丰寿生物科技有限公司，纯度:≥96%);依普黄酮(西亚试
剂有限公司，Cas:35212-22-7，分子式:C18 H16 O3，MW:280． 3，纯
度:≥98%，批号:2014-06-10)。西瑞香素含量测定采用 Agilent
C18 柱(250mm ×4． 6mm，5um)，0． 1%磷酸水:甲醇-48:52，检测
吸收波长 340nm，出峰时间 8min 左右。图(a)为标品(浓度
57ug /ml，含量 99． 4%)，图(b)为样品(浓度 54ug /ml，经计算含
量为 96． 2%)。
(a)标品 (b)样品
1． 2 动物及细胞 48 h内新西兰大白兔，批号:SCXK(黔)2012-
001;MC3T3-E1Subclone14细胞株(中国科学院上海细胞库)。
1． 3 试剂 α-MEM 培养基(Gibco)，PBS 磷酸缓冲溶液，甲苯
胺蓝(Sigma)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TＲAP)染色试剂盒(Sig-
ma)，抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)测试盒(南京建成生物工程
研究所)，Tritonx-100(MP Biomedicals) ，DMSO(MP Biomedic-
als) ，MTT(Solabio) ，苏木素(Sigma)。
1． 4 仪器 3111 型 CO2 培养箱 (Thermo);BX51TF 型正置研
究型荧光显微镜(Olympus);倒置荧光相差显微镜及成像系统
(宁波舜宇仪器有限公司);1510 型酶标仪(Thermo)。盖破片和
骨磨片(兰州军区兰州总医院骨科研究所)的预处理［8，9］。盖玻
片:将 1． 0 cm × 1． 0 cm玻片洗净、擦干、灭菌后备用;骨磨片:将
购得的骨切片修剪约成 0． 5 cm × 0． 5 cm，超声波清洗、消毒、杀
96中药药理与临床 2016;32(1)
* 基金项目:贵州省国际科技合作计划项目(黔科合外 G字［2013］7009 号);贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字［2012］2173 号);贵州省
科技创新人才团队建设［黔科合人才团队(2015)4010 号］ ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.01.019