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国际医药卫生导报 2006年 第12卷 第17期(半月刊)IMHGN
余甘子水解单宁成分对血管壁细胞的影响
呙爱秀
湖南省环境生物职业技术学院附属医院 湖南衡阳 421001
摘 要 目的 观察具有高度抗氧化活性的余甘子水解单宁化合物1,6-di-o-galloyl-b-d-glucose (Phy-16)对动脉
内皮细胞粘附性及动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 ①人脐静脉内皮细胞（ECV-304）经Phy-16预处理后，加入
氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）共同孵育，测定其培养液MDA含量，并加入单核细胞，观察内皮细胞对单核细胞的
粘附率；②用phy-16作用于大鼠主动脉平滑肌细胞后，用ox-LDL与平滑肌细胞孵育，用MTT法观察平滑肌细胞的增
殖效应。结果 Phy-16抑制ox-LDL导致的内皮细胞培养液MDA升高，并且能抑制ox-LDL所诱导的内皮细胞对单核细
胞粘附率的升高，同时有促使平滑肌细胞增殖的效应。结论 Phy-16有降低血管内皮细胞与单核细胞粘附及促进平
滑肌细胞增殖的作用。
关键词 水解单宁 内皮细胞 增殖
动脉粥样硬化是危害人类健康的一类主要疾病，大
量的研究表明低密度脂蛋白（LDL）在体内的氧化产物
氧化型低密度脂蛋白（oxidized LDL, ox-LDL）是造
成动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一[1]，大量的临
床研究也表明抗氧化剂如丙丁酚、维生素E等可显著降
低动脉粥样硬化的发生、发展[2]。
现代医药研究表明中药余甘子(Phyllanthus
embolica L.)有较强的心血管活性，富含单宁类化合
物，对动脉粥样硬化有较好疗效[3]。本实验用的1,6-
di-o-galloyl-b-d-glucose (Phy-16)即来源于余甘子新
的水解单宁类成分[4]与抑制血小板功能，抑制炎症反应
[5]等方面有较好作用的corilagin化学结构相似，其对
血管内皮粘附及血管平滑肌的增殖作用仍未见报道。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞 ECV-304(人脐静脉内皮细胞株)，购自
中国科学院上海药物研究所；人外周血单核细胞，密度
梯度离心法制备；大鼠主动脉平滑肌细胞，酶消化法原
代培养。
1.1.2 样品与试剂 Phy-16购自中科院上海药物所；
培养液RPMI1640和DMEM均由GIBCO BRL生产；特级无
支原体新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所生
产，中国药品生物制品检定所监制；MTT（溴化四唑
蓝），胶元酶Ⅱ型，弹性蛋白酶，维生素E均由Sigma
生产；常用化学试剂均为分析纯；医用净化工作台，
苏州净化设备公司产，YJ-1450型；二氧化碳培养箱，
德国Hereaus公司生产；倒置相差显微镜，日本Olympus
公司生产，BH-2型；生物显微镜：日本Olympus公司
生产，CK-2型。本实验用氧化LDL（ox-LDL）1mg/ml
参照文献[6]自行制备。
1.2 实验方法
1.2.1 单核细胞粘附率的测定
实验分8组，即空白组、LDL组、ox-LDL组、维
生素E组、及4个浓度的加药组（0.083，0.83，8.3，
83umoL/ml）。
将人脐静脉内皮细胞（ECV-304）用含15%新生牛
血清的RPMI1640培养基按常规方法在37℃ CO2培养箱中
进行传代培养，待其贴壁生长达到80%的融合状态后，
用0.05%的胰蛋白酶消化、分离，终止消化反应，吸
出少量细胞悬液计数后，将细胞悬液以1×105个/ml的
密度接种，每孔1ml，用上述培养基继续培养。待细
胞贴壁后，给药组加入不同浓度的样品，其余各组加
相同体积生理盐水，继续培养3 0分钟后，空白组加
PBS，LDL组加LDL，ox-LDL组、维生素E组及样品组
加ox-LDL，每孔均为100μL，继续置于37℃ CO2培
养箱中培养。4小时后每孔吸取培养液1ml，按说明书测
定MDA含量。
调整每孔的单核细胞细胞数为3.24×105个，置于
37℃ CO2培养箱中培养；1小时后每孔吸取培养液100
μL进行细胞计数。
MDA含量的计算见公式1，单核细胞粘附率的计算
见公式2
1.2.2 主动脉平滑肌细胞增殖抑制实验（改良MTT
法）[ 7 ]
设空白组1组，其余分为8组，即阴性对照组、LDL
组、ox-LDL组、维生素E组、Phy-16四个浓度加药组
（0.1、0.01、0.001、0.0001mmoL/L）。
将3 ～8代贴壁生长的大鼠主动脉平滑肌细胞用胰
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1007-1245（2006）17-0140-03
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酶常规消化后，用含20%小牛血清的DMEM培养基将细胞
浓度调整为1×105个/ml，每孔80μL，继续培养。
细胞贴壁后各治疗组加入ox-LDL同时加入各浓度受试样
品、维生素E，同时设单独的各浓度受试样品组，继续培
养8小时。维生素E的终浓度为0.1mmoL/L，LDL及ox-LDL
的终浓度为50μg/ml，各治疗组Phy-16的终浓度分别为
0.1、0.01、0.001、0.0001 mmoL/L。细胞和药物在37
℃、含5% CO2培养箱中孵育12h后，每孔加入MTT液
20μL，培养4h。然后每孔加入三联液溶解100μL，在
37℃ CO2培养箱中放置12h后，用酶标仪在570nm单波
长下测定各孔的OD值。
1.2.3 结果处理
结果用(x±S)表示，统计分析采用方差分析和q检
验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Phy-16对氧化型低密度脂蛋白促单核细胞粘附
的影响
2.1.1 Phy-16对内皮细胞培养液MDA的影响 ox-
LDL脉内皮细胞相互作用后，使细胞培养液MDA浓度升
高，维生素E使此作用下降。除极低剂量组外，Phy-
16组的MDA的含量均低于LDL组，见图1A。
2.1.2 对内皮细胞粘附的影响 ox-LDL组与LDL组
相比，单核细胞粘附率增高，加入维生素E后单核细胞粘
附率明显下降。除极低剂量组外，各Phy-16组的单核细
胞粘附率均低于ox-LDL组，且随浓度的升高，粘附率
降低，见图1B。
图1 Phy-16对氧化型低密度脂蛋白促单核细胞粘附的影
响A组：等量PBS； B组：LDL组(50mg/L)； C组：LDL组
(50mg/L)；D组：维生素E(0.1mmol/L) + ox-LDL(50mg/
L)；E组: Phy-16(0.083mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； F
组：Phy-16(0.83mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； G组： Phy-
16(8.3mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； H组：Phy-16(83mmol/
L) + ox-LDL(50mg/L)。
注： ＃＃： 与B组相比 p<0.01； **： 与C组相比 p<0.
01
2.2 Phy-16对平滑肌细胞增殖的影响
2.2.1 Phy-16对氧化型低密度脂蛋白所致平滑肌细
胞增殖的影响 ox-LDL与大鼠主动脉平滑肌细胞
（VSMC）作用后，光密度明显增加。如预先加入维生
素E，ox-LDL使VSMC光密度下降（低于ox-LDL组）。
除极低剂量以及低剂量外，治疗组的中剂量组和高剂量
组的吸光度值均高于ox-LDL组，且吸光度随样品浓度
的升高而升高。见图2A。
2.2.2 Phy-16对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响
除极低剂量组外，Phy-16各组吸光度均明显高于阴性对
照组，且随浓度的升高而升高，见图2B。
图2 Phy-16对平滑肌细胞增殖的影响
A组：等量PBS； B组:LDL组(50mg/L)； C组：LDL组(50mg/
L)； D组：维生素E(0.1mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)；E
组：Phy-16(0.0001mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； F组：
Phy-16(0.001mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； G组： Phy-
16(0.01mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)； H组： Phy-16(0.
1mmol/L) + ox-LDL(50mg/L)。
注：A图 ＃＃：与B组相比 p<0.01； **： 与C组相比p
<0.01；B图 *：与A组相比 p<0.05； **：与A组相比p
<0.01。
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3 讨论
尽管动脉粥样硬化的发生机制至今尚未完全阐明，
但内皮自由基氧化损伤和内皮下平滑肌增殖在动脉粥样
硬化过程中扮演重要角色，减轻或防止内皮的自由基损
伤作用，抑制内皮下平滑肌增殖，目前认为是防止动
脉粥样硬化的有效措施[7]。
本实验中我们发现，ox-LDL与内皮细胞作用后，
培养液脂质过氧化物MDA含量显著增高，说明内皮细胞
被损伤，发生了脂质过氧化，加入单核细胞后，单核
细胞粘附到内皮细胞的数量也明显增高，这再次验证了
ox-LDL有促进单核细胞与血管内皮细胞粘附的作用。加
入天然抗氧化剂Phy-16后不仅能使MDA降低，还能使单
核细胞与内皮细胞的粘附率显著降低，且表现出一定的
量效关系。
很多实验研究发现，ox-LDL在穿入到血管内皮层下
以后，不仅能够刺激动脉平滑肌细胞由收缩型向分泌型
转化[8]，还能促使动脉平滑肌细胞增殖[8]，使其由动
脉中膜迁移到内膜，吞噬大量脂质后最终形成泡沫细
胞。本次实验再次证明了ox-LDL对主动脉平滑肌细胞
的促增殖作用和抗氧化剂维生素E对此的拮抗作用。
ox-LDL促进平滑肌细胞增殖的确切机制至今尚无定论，
大多数研究表明ox-LDL主要是通过上调细胞内细胞核增
殖抗原（PCNA）[9]，加速相关的细胞周期调控蛋白如
P21、P57与PCNA的结合来促进细胞增殖。然而本实验
提示，天然抗氧化剂Phy-16单用或与ox-LDL合用均有促
平滑肌增殖作用，单用时的促增殖作用还有一定的剂量
依赖性，故推测药物的抗自由基氧化作用和抑制平滑肌
增殖作用在抗动脉粥样硬化中可能存在不一致现象。动
脉粥样硬化时平滑肌增值机制与Phy-16的促增殖作用是
否存在差异，这两种条件下增殖的平滑细胞是否也存在
差异，这有待进一步的研究。
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收稿日期：2006-04-24
药 物 研 究