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人肠内菌对藏药余甘子鞣质部位代谢的研究*
杨光辉 吴玲芳 张晓雪 朱丹 邵岩岩 毛鑫 梁文仪 陈文静 石任兵 张兰珍#
杨光辉，男，在读硕士生
# 通信作者:张兰珍，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向:中药和民族药药效物质和质量标准研究，E-mail:zhanglanzhen01@ 126． com
* 国家自然科学基金资助项目(No． 81274187) ，北京中医药大学科研创新团队项目(No． 2011 － CXTD － 12) ，北京中医药大学中青年教师资
助项目(No． 2009TYB22 － JS027)
(北京中医药大学中药学院 北京 100102)
摘要:目的 研究人肠内菌对藏药余甘子鞣质部位的代谢。方法 采用人肠内菌与余甘子鞣质部
位在厌氧条件下，37 ℃共温孵培养的方法进行代谢，代谢样品通过离心、甲醇沉淀蛋白后，运用
HPLC-MSn 法对代谢物进行定性分析，运用 HPLC-UV 法对样品进行定量分析，并绘制时间含量曲
线。结果 余甘子鞣质部位在人肠内菌作用下用 HPLC-MSn 检测出 13 个成分，其中 4 个为代谢成
分焦性没食子酸、甲基没食子酸、尿石素 B 和尿石素 A;4 个为原型成分没食子酸、柯里拉京、galloyl
glucose、digalloyl glucose和 5 个待指认成分。样品中没食子酸、柯里拉京、鞣花酸 3 个指标性成分
的含量随人肠内菌代谢时间延长呈先增加后减少的趋势。结论 余甘子鞣质部位可被人肠内菌代
谢，代谢后其原型活性成分仍有保留，并且有新生成的抗癌活性成分出现。
关键词:余甘子;鞣质部位;人肠内细菌;代谢
中图分类号:Ｒ284． 2 doi:10． 3969 / j． issn． 1006-2157． 2016． 01． 009
Effects of human gut microbiota in vitro on transformation of the total
tannins content of Phyllanthus emblical L． *
YANG Guanghui，WU Lingfang，ZHANG Xiaoxue，ZHU Dan，SHAO Yanyan，MAO Xin，LIANG
Wenyi，CHEN Wenjing，SHI Ｒenbing，ZHANG Lanzhen#
(School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102)
Abstract:Objective To study in vitro the effect of human intestinal bacteria on the transformation of to-
tal tannins extracted from emblic leafflower (Yuganzi，Phyllanthus emblica L．) ，a usually used Tibetan
herbal medicine． Methods Based on the earlier stage work of the extraction of total tannins from Phyl-
lanthus emblica L．，activated human gut microbiota was anaerobically incubated in the culture medium
GAM containing the total tannins at 37℃ for 72 hours． After centrifugation and protein precipitation，the
characteristics of the metabolites were determined by using HPLC /MSn and the contents of each compo-
nent determined were measured by using HPLC-UV，on which the time-content curve was drawn．
Ｒesults Total 13 components were determined，including four metabolites (pyrogallic acid，methyl-de-
rivative of gallic，urolithin B，and urolithin A) ，four prototype components (gallic acid，corilagin，gal-
loyl glucose，and digalloyl glucose)and five components to be determined． The accumulated contents of
gallic acid and ellagic acid were the highest at Hour 12，10-fold higher than that of the beginning;the
accumulated content of corilagin was the highest at Hour 6 with twice higher of the beginning．
Conclusion After the total tannins from Phyllanthus emblica L． were transformed by human gut microbi-
ota in vitro，certain bioactive prototype components remained and antitumor components were found．
Keywords:Phyllanthus emblica L．;total tannins;human gut microbiota;metabolism
64
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine
第 39 卷第 1 期 2016 年 1 月
Vol． 39 No． 1 Jan． 2016
余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子 Phyllan-
thus emblica L． 的干燥成熟果实，为常用藏药，与诃
子、毛诃子在藏药中并称“三大果”。余甘子具有生
津止渴，润肺化痰，清热解毒，消食化积之功效［1 － 2］。
余甘子主要含有鞣质、小分子酚酸类、黄酮类、挥发
油类、维生素类等化学成分，具有明显的抗衰老、抗
肿瘤、降脂、降压等作用［3 － 5］。
可水解鞣质类成分在人肠内菌群的作用下可发
生水解、失去内酯环、脱羟基等反应生成小分子酚酸
成分，这些小分子成分吸收入血后发挥药效［6］。余
甘子鞣质部位及酚酸在人肠内菌中的代谢研究尚未
报道。本文采用体外人肠内菌模型研究余甘子鞣质
部位人肠内菌代谢过程，确定代谢产物。测定余甘
子 3 个主要成分没食子酸、柯里拉京、鞣花酸的不同
代谢时间含量变化。探讨藏药余甘子鞣质部位在肠
内菌作用后的成分变化，为余甘子药效物质基础研
究提供依据。
1 材料
1． 1 仪器
LTQ-Orbitrap XL 型静电场轨道阱组合式高分
辨质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司) ;TQX-Ⅱ型厌
氧培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司) ;MLS-
378 型高压灭菌锅(日本 Sanyo 公司) ;ＲCT basic 型
加热磁力搅拌器(德国 Ika Werke 公司) ;Biofug-
eStratos型台式离心机(德国 Heraeus 公司) ;AE240
型十万分之一电子天平(瑞士 Mettler公司)。
1． 2 试剂和药物
胰蛋白胨(批号 20140108) ，酵母浸膏(批号
20130829) ，大豆蛋白胨(批号 20140111) ，可溶性淀
粉 (批 号 20131119) ，硫 代 乙 醇 酸 钠 (批 号
20130129) ，L-半胱氨酸盐(批号 20130722)均购于
国药集团化学试剂有限公司。牛肝浸粉(批号
20140228) ，蛋白胨(批号 20140310) ，血清消化粉
(批号 20140320) ，牛肉膏(批号 20130818) ，均为北
京奥博星生物技术有限责任公司产品。
没食子酸为实验室自制，纯度 ＞ 98%;柯里拉
京(批号 140109，纯度 ≥98%，上海融和医药科技有
限公司) ;对羟基苯甲酸(批号 20130508，纯度 ≥
99%，上海源叶生物科技有限公司) ;鞣花酸(批号
MUST －14031010，纯度 ≥98%，成都曼思特生物科
技有限公司)。
余甘子药材购自西藏藏医院，产地尼泊尔，经北
京中医药大学阎玉凝教授鉴定为大戟科叶下珠属植
物余甘子 Phyllanthus emblica L．的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2． 1 对照品溶液的制备
精密称取对照品没食子酸 10． 21 mg、柯里拉京
5． 68 mg和内标物对羟基苯甲酸 2． 55 mg 分别置于
10、25、25 mL 容量瓶中，加 50%甲醇溶解并稀释至
刻度，摇匀，分别作为没食子酸、柯里拉京和对羟基
苯甲酸对照品溶液。精密称取对照品鞣花酸 4． 50
mg于 25 mL容量瓶中，加二甲亚砜溶解并稀释至刻
度，作为鞣花酸对照品溶液。
2． 2 藏药余甘子鞣质部位的制备
采用本实验室建立的藏药余甘子鞣质部位提取
纯化工艺，制备藏药余甘子总鞣质部位，总鞣质含量
54． 17%，没食子酸、柯里拉京、鞣花酸的质量分数分
别为:4． 54%、1． 61%、3． 67%。
2． 3 人肠内菌的制备
2． 3． 1 普通厌氧培养基的制备
A液:称取胰蛋白胨 10 g、大豆蛋白胨 3 g、 蛋
白胨 10 g、酵母浸膏 5 g、消化血清粉 13． 5 g、牛肝浸
出粉 1． 2 g和牛肉膏 2． 2 g，置于 500 mL烧杯中，加
适量蒸馏水溶解。转移至 1 000 mL烧杯中，加入蒸
馏水至 700 mL，加热电磁炉搅拌溶解。然后转移至
1 000 mL容量瓶中。
B液:称取葡萄糖 3 g，磷酸二氢钾 2． 5 g、氯化
钠 3 g和可溶性淀粉 5 g，置于 100 mL烧杯中，加适
量蒸馏水加热溶解。
C液:称取 L-半胱氨酸盐酸盐 0． 3 g 和硫代乙
醇酸钠 0． 3 g，置于 100 mL 烧杯中加适量蒸馏水加
热超声溶解。
将配置好的 B液和 C液转移至 A液中，再加蒸
馏水至 990 mL，用饱和 NaOH 调节 pH 至 7． 1 ～
7． 2，加蒸馏水至 1 000 mL［7］。
2． 3． 2 培养基的分装及灭菌
将配置好的普通厌氧培养基分装于 500、250、
100 mL 具塞三角瓶中，用牛皮纸封口，0． 07 MPa，
121 ℃灭菌 20 min，待自然冷却备用。
2． 3． 3 人肠内菌群的活化
厌氧环境下，取人肠内混合菌储备液 1 mL于装
有 9 mL 普通厌氧培养基的螺口试管中，加盖，封口
膜封口，37 ℃厌氧环境中培养 24 h。
2． 4 人肠内菌对余甘子鞣质部位的代谢
2． 4． 1 代谢过程考察
精密称取余甘子鞣质部位 2． 88 mg，在无菌、厌
氧条件下加 2． 8 mL 普通厌氧培养基溶解，超声处
理，加入活化后人肠内菌群 200 μL，37 ℃恒温、无氧
74第 1 期 杨光辉等 人肠内菌对藏药余甘子鞣质部位代谢的研究
环境下分别培养 0、1、2、4、6、12、24、36、48、72 h，每
个时间点平行 3 组。
2． 4． 2 代谢物处理
取代谢后样品 10 000 r /min 高速离心 10 min，
取上清液 1 mL加 3 mL甲醇除蛋白，100 μL内标，
80 μL缓冲液(1 moL /L 磷酸 －磷酸二氢钾) ，涡旋
混合 3 min，10 000 r /min 离心 10 min。取上清液，
0． 45 μm滤膜过滤，20 μL进样 HPLC检测。
2． 4． 3 HPLC-UV条件
Diamonsil C18 (2)柱 (4． 6 mm × 250 mm，5
μm) ，流动相甲醇(A)－ 0． 02% 磷酸溶液(B) ，梯
度洗脱:0 ～ 15 min，5% ～ 15% A;15 ～ 20 min，15%
～20% A;20 ～ 35 min，20% ～ 30% A;35 ～ 50 min，
30% ～60% A;50 ～ 60 min，60% ～ 90% A;60 ～ 70
min，90% A;70 ～ 72 min，90% ～5% A。流速 1 mL /
min，检测波长 270 nm，柱温 30 ℃。
HPLC-MSn 条件同上，ESI 负离子模式，雾化气
流:1． 50 L /min，离子源温度:300 ℃，质量扫描范
围:m/z 100 － 1200。
2． 4． 4 专属性考察
按照“2． 4． 3 HPLC-UV”条件，测定空白普通
厌氧培养基、空白普通厌氧培养中加入对照品没
食子酸、柯里拉京、鞣花酸和内标物，测定人肠内
菌代谢鞣质部位 0、2、4、6、12、24、36、48、72 h色谱
图，见图 1。空白普通厌氧培养基所含内源性物质
不干扰没食子酸、柯里拉京、鞣花酸 3 个成分和内
标物的测定，3 个被测成分峰形良好，分离度符合
要求。
2． 4． 5 没食子酸、柯里拉京、鞣花酸在空白培养基
中线性关系考察
精密吸取梯度递增量的没食子酸、柯里拉京、鞣
花酸对照品储备液于 2 mL 容量瓶中，加 50%甲醇
稀释至刻度，配置没食子酸浓度分别为:0． 026、
0. 051、0． 102、0． 153、0． 306、0． 459、0． 613、0． 817、
1. 021 g /L;柯里拉京浓度分别为:0． 114、0． 023、
0. 034、0． 068、0． 102、0． 136、0． 182、0． 227 g /L;鞣花
酸浓度分别为:0． 009、0． 027、0． 054、0． 081、0． 108、
0． 144、0． 160 g /L。
取 1 mL普通厌氧培养基于 5 mL 离心管中，依
次加入 200 μL 上述溶液 2． 8 mL 甲醇，100 μL 内
标，80 μL 缓冲液，按照“2． 3． 2”代谢物处理方法处
理后，0． 45 μm 滤膜过滤，进样 20 μL，HPLC 检测。
得到没食子酸、柯里拉京、鞣花酸工作曲线。见
表 1。
A 空白普通厌氧培养基;B 空白普通厌氧培养基中加入对
照品和内标物;C 鞣质部位不同转化时间点色谱图;1．没食子
酸;2．内标(对羟基苯甲酸) ;3．柯里拉京;4．鞣花酸。
A blank GAM;B GAM containing reference substance and
internal standard;C metabolites of total tannins at different time
spots;1 gallic acid;2 internal standard (PHBA) ;3 corilagin;4
ellagic acid．
图 1 空白培养基与加入样品后 HPLC色谱图
Fig． 1 HPLC chromatograms of blank culture
medium and culture medium containing samples
2． 4． 6 基质混合对照品制备
分别精密吸取空白普通厌氧培养基 1 mL 于 5
mL离心管中，分别加入 200 μL 低、中、高 3 个浓度
对照品没食子酸 0． 051、0． 459、1． 021 g /L，柯里拉京
0． 114、0． 068、0． 227 g /L，鞣花酸 0． 009、0． 081、
0. 180 g /L，配成低、中、高 3 个浓度基质混合对
照液。
2． 4． 7 精密度考察
取低、中、高 3 个浓度基质混合对照液一天内连
续 6 次进样，测定该方法日内精密度。连续测定 4
d，测定该方法的日间精密度，日内精密度 ＲSD≤
5． 12%;日间精密度 ＲSD≤5． 19%，符合目前生物样
品分析方法指导原则的有关规定。
84 北京中医药大学学报 第 39 卷
表 1 空白培养基中 3 个被测成分的标准曲线(n = 5)
Table1 Standard curves of gallic acid，corilagin and ellagic acid in blank medium(n = 5)
被测成分
Component
标准曲线
Equation r
线性范围
Linear range(mg /L)
最低定量限
LLOQ(mg /L)
没食子酸 Gallic acid Y = 11． 195X + 0． 057 2 0． 998 7 1． 25 ～ 49． 81 1． 25
柯里拉京 Corilagin Y = 10． 501X － 0． 074 6 0． 997 8 0． 55 ～ 11． 08 0． 55
鞣花酸 Ellagic acid Y = 14． 569X + 0． 057 7 0． 998 4 0． 44 ～ 8． 78 0． 44
2． 4． 8 稳定性考察
取低、中、高 3 个浓度基质混合对照液，分别置
于室温保存(20 ～ 30 ℃) ，24 h 后分别连续测定 4
次，考察样品短期稳定性;冷冻于 － 70 ℃，30 d 后充
分解冻，考察样品长期稳定性;冷冻于 － 70 ℃，在室
温中充分解冻，然后再次冷冻，每个平行操作 3 份，
重复 3 个冻融周期以后，考察样品的三周期冻融稳
定性。结果显示被测物在上述保存条件下 ＲSD ≤
6%。表明 3 个被测成分在实验放置条件下稳定。
2． 4． 9 回收率考察
取基质混合对照品高、中、低 3 个浓度样品加内
标物，测定被测物峰面积与相应浓度的标准品溶液
中被测物的色谱峰面积的比值，3 个被测物及内标
在低、中、高 3 个浓度样品中绝对回收率≥75% ，
ＲSD≤6． 2%。
2． 5 测定结果
2． 5． 1 没食子酸、柯里拉京、鞣花酸转化时间 －含
量曲线
按照 2． 4． 1 方法以鞣质部位为底物进行人肠内
菌转化实验，HPLC 法测定转化不同时间点底物中
没食子酸、柯里拉京、鞣花酸 3 个指标性成分定量，
(每个时间点的含量为 3 次平行试验的平均值)并
绘制转化时间 －含量曲线，见图 2。
图 2 没食子酸、柯里拉京、鞣花酸人肠内菌代
谢 72 h时间 －含量曲线
Fig． 2 Time-content curves of gallic acid，
corilagin，and ellagic acid in 72 hours
图 2 显示藏药余甘子鞣质部位中没食子酸、柯
里拉京、鞣花酸 3 个指标性成分含量随转化时间的
增长均呈现先增加后减少趋势，其中没食子酸、鞣花
酸累积含量在 12 h 达到最大，为初始浓度的 10 倍
左右，柯里拉京在 6 h累积含量最高，为初始浓度的
2 倍左右，36 h后 3 个成分代谢近完，代谢率分别稳
定在 78． 2%，69． 7%，16． 7%。
2． 5． 2 代谢产物 HPLC － MS 分析
根据 2． 4． 3 HPLC － MSn 条件进行代谢产物的
液质检测，见图 3。通过数据分析和文献比对，推测
化合物结构信息，见表 2。
图 3 余甘子鞣质部位人肠内菌代谢物总离子流图
Fig． 3 Total ion chromatograms of the total tannins
content transformed by human hut microbiota
经分析确认 2、3、8、10 成分为原型成分没食子
酸、galloyl glucose、digalloyl glucose、柯里拉京。1、5、
7、12 成分为代谢成分焦性没食子酸、甲基没食子
酸、尿石素 B、尿石素 A。其中 1、5 属于没食子酸在
人肠内菌的代谢产物，7、12 是鞣花酸在肠内菌的代
谢产物［8 － 10］。其他代谢成分的确认还需进一步结
构解析。
3 讨论
肠内细菌的水解酶系对化合物进行水解是肠道
内细菌代谢药物的一大特征。余甘子鞣质部位主要
为可水解鞣质及其酚酸类，其中没食子酸、柯里拉
京、鞣花酸等在肠内菌作用下含量随着转化时间的
延长均呈现先增加后减少的趋势，没食子酸和鞣花
酸增加的倍数比柯里拉京大很多，在肠吸收代谢一
94第 1 期 杨光辉等 人肠内菌对藏药余甘子鞣质部位代谢的研究
表 2 余甘子鞣质部位人肠内菌代谢物液质数据表
Table 2 LC/MSn data of prototype components and metabolites in vitro (negative ion mode)
峰号
No．
保留时间
t(min)
母离子
MS1［M － H］－
碎片离子 Fragments
MS2 m /z 成分
Component
1 8． 46 125． 025 4 106． 833 2，96． 893 9，81． 048 2，52． 843 7 焦性没食子酸 pyrogallic acid*
2 10． 53 169． 014 9 124． 923 7，96． 842 2，82． 254 7 没食子酸 gallic acid
3 18． 24 331． 142 0 287． 187 7，256． 125 8，202． 019 1 没食子酰葡萄糖 galloyl glucose
4 18． 47 403． 184 7 385． 222 9，288． 132 3，285． 181 9 C15H31O12
*
5 20． 62 211． 073 5 166． 987 1 尿石素 B UrolithinB*
6 21． 62 255． 088 7 207． 080 7，165． 077 5 C12H15O6
*
7 25． 42 183． 030 5 168． 011 7，123． 960 5
没食子酸甲基衍生物
methyl-derivative of gallic acid*
8 27． 63 483． 080 0 331． 138 4，313． 072 8，271． 024 2 二没食子酰葡萄糖 digalloyl glucose
9 32． 18 520． 212 7 476． 280 6，391． 213 7 C23H36O13
*
10 35． 52 633． 075 1 463． 115 1，301． 010 9，275． 082 2，185． 024 0 柯里拉京 corilagin
11 36． 74 237． 062 3 190． 955 4，84． 921 3 C8H13O8
*
12 40． 95 227． 104 3 183． 066 8 尿石素 A urolithinA*
13 41． 34 587． 270 1 577． 303 0，569． 262 5 C28H43O13
*
注:* 为代谢产物。
Note:* metabolites．
段时间后 3 个成分含量都开始减少直至稳定。说明
余甘子鞣质部位在人肠内菌的作用下发生代谢转
化，大分子可水解鞣质可分解为柯里拉京，没食子酸
和鞣花酸，柯里拉京又可水解为没食子酸和鞣花酸。
通过 HPLC-MS技术分析初步确定了 4 个代谢
产物，其中尿石素 A ，尿石素 B 已被证实在一定浓
度下具有诱导癌细胞凋亡，抑制蛋白酶活性的功
效［11］，焦性没食子酸可抑制基质金属蛋白酶的作
用，同样具有抗癌作用，说明余甘子鞣质部位经肠内
菌代谢后产生的代谢产物，具有与余甘子相同的抗
癌作用，也是余甘子抗癌药效物质基础之一。
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05 北京中医药大学学报 第 39 卷