全 文 ：中国农学通报 2012,28(30):289-295
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
柠檬苦素(Limonin)是一类具有呋喃环的三萜类
化合物，主要存在于芸香科 (Rutaceae)和楝科
(Meliaceae)植物组织中。迄今为止已发现 300余种柠
檬苦素类化合物，主要存在于柑橘和柚子等植物的果
实的核、囊衣和内果皮等部位[1]，其代表物柠檬苦素和
诺米林具有强烈苦味[2]。据研究报道，由于柠檬苦素
具有抗菌[3]、抗癌[4]、抗病毒[5]和昆虫拒食活性与昆虫不
育[6]等活性作用，其提取工艺和药用功能开发已引起
了医学界和食品界的广泛关注。由于柠檬苦素类化合
基金项目：福建省质量技术监督局科技项目“金柑生物活性物质—柠檬苦素类化合物的提取、分离及鉴定”(FJQI2009017)。
作者简介：孟鹏，男，1980年出生，在读博士生，主要从事食品营养、安全和检测方面的研究。通信地址：350002福建省福州市杨桥西路山头角 121
号，福建省产品质量检验研究院食品检验研究所，E-mail：mpfcii@163.com。
收稿日期：2012-03-04，修回日期：2012-05-18。
响应面法优化超临界CO2萃取金柑籽中
柠檬苦素工艺条件的研究
孟 鹏
（福建省产品质量检验研究院/国家加工食品质量监督检验中心（福州），福州 350002）
摘 要：优化超临界CO2萃取柠檬苦素的工艺条件，为金柑籽中柠檬苦素的开发提供理化依据。采用单
因素试验研究夹带剂、夹带剂浓度、萃取温度、萃取时间、萃取压力和二氧化碳流量对柠檬苦素提取率的
影响，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法建立了二次多项式数学模型，并分析模型的有效性与
各因素间的交互作用。在萃取压力为33 MPa，萃取温度为50℃，萃取时间为2.5 h的条件下，柠檬苦素
提取率达 3.98 g/kg。在最佳条件下得到实验结果与模型预测值吻合，说明所建立的模型是切实可行
的。超临界CO2萃取技术的运用，有利于柠檬苦素提取的工业化推广和应用。
关键词：金柑籽；柠檬苦素；超临界CO2；响应面
中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 论文编号：2012-0715
Technical Parameter Optimization for Supercritical CO2 Extraction of Limonin from
the Kumquat Seeds by Response Surface Methodology
Meng Peng
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality/
China National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food, Fuzhou 350002)
Abstract: Technical parameter for supercritical carbon dioxide extraction of limonin from kumquat seeds were
optimized, it could provide theoretical basis for the development of limonin. The single-factor experiments
were used to investigate the effects of different co-solvent, co-solvent concentration, temperature, time,
pressure and CO2 flow rate on limonin extraction rate. Based on the single-factor experiment, a
quadratic-multinomial-mathematical model was established by Response Surface Methodology (RSM). The
applicability of the model and interaction involved factors on extraction of limonin was verified. The results
indicated that when the pressure of 33 MPa, temperature of 50℃, exaction time of 2.5 h, the highest exaction
rate of limonin was 3.98 g/kg. Under the optimum condition, the results showed the model fitted well the
experimental data and the model was feasible. The utilization of supercritical carbon dioxide extraction
technology was beneficial to the industrialization promotion and application of limonin extraction.
Key words: kumquat seeds; limonin; supercritical CO2; response surface methodology (RSM)
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物在植物中的含量不高，要实现其工业化应用存在植
物资源原料供应不足的问题，需要不断开发研究新的
资源原料。同时，虽然对柠檬苦素类化合物需求增加，
但缺乏经济的提取方法阻碍了该种物质的市场化进
程[7]。
金柑(Kumquat)原产中国，已有1600多年的栽培
历史[8]。福建省尤溪县是目前中国唯一的“中国金柑
之乡”。由于金柑中柠檬苦素等苦味物质的存在，限制
了金柑的深加工和消费者的需求。目前，大部分金柑
仍然以鲜食为主，粗加工产品也仅见果脯、果酱等产
品，由于收获期集中，销售有限，部分金柑果实腐烂，造
成了巨大的经济损失，制约了产业的发展。粗加工中
丢弃的金柑籽不仅造成了环境污染，而且残留在其中
的许多活性成分如柠檬苦素未能得到充分利用。
目前，文献报道关于柠檬苦素的提取分离研究方
法有：丙酮提取—结晶分离法[9]、热水提取—树脂吸附
法（提取配糖体）[10]、丙酮提取—甲醇分离—树脂吸附
法[11]、超声波循环提取法[12-13]等。由于以上提取方法多
采用有机溶剂提取，对环境造成一定污染，不利于安全
生产。
本研究拟采用响应面法研究影响超临界CO2萃
取金柑籽中柠檬苦素提取率的主要因素及其相互关
系，优化最佳提取工艺，并拟合回归方程，为柠檬苦素
的工业化生产开发提供理论依据和实践指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料
金柑籽：金柑采于福建尤溪，取核，45℃热风烘干，
粉碎过40目筛，备用。
试剂：柠檬苦素标准品 (Limonin)，购自 SIGMA
公司；CO2由福建省东南电化有限公司提供，纯度
99.5%以上；乙腈（色谱纯），水为超纯水，无水乙醇、
丙酮、苯、二氯甲烷、乙醚、正丁醇等均为国产分析纯
试剂。
1.2 仪器
HA120-50-01(02)型超临界CO2萃取装置：萃取温
度常温至 75℃，CO2流量 0~50 L/h，最高萃取压力
50 MPa，江苏南通华安超临界萃取有限公司生产。
ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公
司）；高速组织捣碎机（天津市台斯特仪器有限公司，
FW135）；超声波振荡器(上海生析超声仪器有限公司，
DS-8510 DTH)；分析天平（德国赛多利斯）；高速冷冻
离心机（美国贝克曼公司，AvantiJ-E）；旋转蒸发仪（上
海亚荣仪器生化厂，RE-52AA）；Milli-Q超纯水纯化系
统（美国Millipore公司）；涡旋混合器。
1.3 柠檬苦素的超临界提取工艺
准确称取2 g金柑籽粉放入萃取罐中，对萃取罐、
分离罐Ⅰ、分离罐Ⅱ、贮罐分别进行加热或冷却，当达
到选定的温度时开启CO2瓶阀门，通过高压泵对系统
进行加压。当系统压力达到所选定的压力时，开始循
环萃取，保持恒温恒压，按照设定的取样时间从分离罐
Ⅱ进行取样。流程如下：CO2瓶→制冷系统→高压泵
→萃取罐→分离罐Ⅰ→分离罐Ⅱ→（循环）。
1.4 柠檬苦素含量的测定
采用超高效液相色谱法测定柠檬苦素的含量。色
谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱
(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司，USA)；流动相：
乙腈：水（45：55）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样
体积：2 μL；检测波长：215 nm；流动相梯度程序：等度
洗脱。取超临界CO2萃提取液过滤后，滤液在 50℃真
空旋转蒸发至干，用乙腈溶解残渣并定容，混匀，用
0.22 μm滤膜过滤后备测。在上述色谱条件下进行标
准曲线绘制和样品测定。
1.5 单因素实验
取2 g金柑籽粉，以柠檬苦素提取率为指标，研究
夹带剂种类、夹带剂浓度、萃取压力、萃取时间、CO2流
量、萃取温度对柠檬苦素提取率的影响。
采用无水乙醇、丙酮、苯、二氯甲烷、乙醚、正丁醇
考查适宜金柑籽柠檬苦素的夹带剂种类；夹带剂浓度
采用 50%、60%、70%、80%、90%、100% 6个水平；萃取
压力采用 15、20、25、30、35、40 MPa 6个水平；萃取时
间采用 30、60、90、120、150、180 min 6个水平；CO2流
量采用 10、15、20、25、30、35 kg/h 6个水平；萃取温度
采用30、35、40、45、50、55、60℃ 7个水平。
1.6 响应面法优化柠檬苦素提取工艺
在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken
试验设计方案，以萃取压力、萃取温度、萃取时间为考
察变量，分别以A、B和C表示，以金柑籽柠檬苦素Y
为响应值，以-1、0、1分别代表变量的水平。实验设计
与数据处理由Design Expert软件完成。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 不同夹带剂对金柑籽柠檬苦素提取率的影响 选
择6种不同极性的有机溶剂作为夹带剂进行试验比较。
在萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，CO2流量20 kg/h，夹
带剂添加量 50 mL，萃取 2 h条件下，以不加夹带剂为
对照，柠檬苦素提取率见表 1。由表 1结果得出，柠檬
苦素提取率的效果是：无水乙醇>二氯甲烷>丙酮>苯>
乙醚>正丁醇>无夹带剂。故本实验选择无水乙醇作
·· 290
孟 鹏：响应面法优化超临界CO2萃取金柑籽中柠檬苦素工艺条件的研究
为夹带剂。
2.1.2 不同浓度夹带剂对金柑籽柠檬苦素提取率的影
响 试验在萃取压力 30 MPa，萃取温度 50℃，CO2流量
20 kg/h，夹带剂添加量50 mL，萃取2 h条件下，不同浓
度乙醇对柠檬苦素提取率的影响见图1。随着乙醇浓
度的升高，柠檬苦素提取率增加。通过实验比较发现，
80%~100%之间浓度的乙醇对柠檬苦素提取率影响不
明显。因此，选择 90%乙醇作为夹带剂即能满足试验
要求（图1）。
2.1.3 不同萃取压力对金柑籽柠檬苦素提取率的影响
在萃取温度50℃，CO2流量20 kg/h，夹带剂90%乙醇添
加量 50 mL，萃取 2 h条件下，考察萃取压力对金柑籽
柠檬苦素提取率的影响（图2）。由图2得出，萃取压力
在 15~30 MPa范围内，提取率随着萃取压力的升高而
增加较快；当萃取压力>30 MPa时，提取率增加缓慢。
主要原因是随着萃取压力的增加，超临界CO2的溶解
能力相应增强，但萃取压力超过一定值后，萃取其他物
质的能力也增强，纯度下降，同时减少了传质接触时
间，使得柠檬苦素溶出困难，导致提取率增加缓慢[14]。
因此，本实验选择萃取压力范围25~35 MPa。
2.1.4 不同萃取时间对金柑籽柠檬苦素提取率的影响
在萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，CO2流量20 kg/h，
夹带剂 90%乙醇添加量 50 mL条件下，考察萃取时间
对金柑籽柠檬苦素提取率的影响（图3）。由图3得出，
萃取时间越长，提取率越高，但 120 min后，提取率上
升缓慢。这是因为萃取一定时间后，柠檬苦素在超临
界流体中的溶解接近平衡，从而提取率变化不大，且随
着时间的延长，能耗增加。
2.1.5 不同CO2流量对金柑籽柠檬苦素提取率的影响
在萃取压力 30 MPa，萃取温度 50℃，夹带剂 90%乙醇
添加量 50 mL，萃取 2 h条件下，考察CO2流量对金柑
籽柠檬苦素提取率的影响，结果见图 4。在一定的范
围内，随CO2流量增加，物料有效扩散系数也增加，使
得流体相的传质阻力显著降低；但是，当流量过大时，
将造成 CO2与物料的接触时间缩短，萃取率反而下
降。结果表明，当CO2流量为20 kg/h时萃取所得柠檬
苦素提取率最高。
2.1.6 不同萃取温度对金柑籽柠檬苦素提取率的影响
在萃取压力 30 MPa，CO2流量 20 kg/h，夹带剂 90%乙
夹带剂种类
无夹带剂
苯
二氯甲烷
乙醚
正丁醇
无水乙醇
丙酮
柠檬苦素提取率/(g/kg)
1.92
2.95
3.15
2.57
2.25
3.24
3.05
表1 不同种类夹带剂对柠檬苦素提取率的影响
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
50 60 70 80 90 100
乙醇浓度/%
柠
檬
苦
素
提
取
率
/(g/k
g)
图1 乙醇浓度对柠檬苦素提取率的影响
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
15 20 25 30 35 40 45
萃取压力/MPa
柠
檬
苦
素
提
取
率
/(g/k
g)
图2 萃取压力对柠檬苦素的影响
图3 萃取时间对柠檬苦素提取率的影响
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
30 60 90 120 150 180
萃取时间/min
柠
檬
苦
素
提
取
率
/(g/kg
)
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醇添加量 50 mL，萃取 2 h条件下，考察萃取温度对金
柑籽柠檬苦素提取率的影响，结果见图 5。随着温度
的升高，柠檬苦素提取率也相应增加，萃取温度在50℃
附近时，提取率达到最大值。一方面温度升高有利于
增加超临界CO2的溶解度和提高扩散系数，利于萃取；
另一方面温度过高则减少了超临界CO2的密度，从而
导致溶解能力降低，不利于萃取[15]。
2.2 响应面法优化超临界CO2萃取金柑籽中柠檬苦素
的提取工艺
2.2.1 响应面(RSM)实验设计 依据Box-Behnken中心
设计原理[16]，综合单因素试验结果，选取萃取温度(A)、
萃取时间(B)和萃取压力(C)为试验因素（自变量），以
柠檬苦素提取率为评价指标（响应值），设计3因素3水
平试验，试验设计因素编码及水平见表2。
2.2.2 响应面法优化超临界CO2萃取柠檬苦素的工艺 试
验设计17个试验点，其中12个析因点，5个零点。所有
试验重复3次，取平均值，响应面分析方案及结果见表3。
0.00.5
1.01.5
2.02.5
3.03.5
4.0
30 35 40 45 50 55 60
萃取温度/℃
柠
檬
苦
素
提
取
率
/(g/k
g)
图5 萃取温度对柠檬苦素提取率的影响
试验序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
A.萃取压力/MPa
1
-1
0
0
0
1
0
-1
0
1
-1
-1
0
0
0
0
1
B.萃取温度/℃
1
1
0
-1
1
-1
0
-1
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
C.萃取时间/h
0
0
0
1
1
0
0
0
0
1
1
-1
-1
-1
0
0
-1
Y.柠檬苦素提取率/(g/kg)
3.26
2.96
3.88
3.53
3.69
2.84
3.80
2.73
3.81
3.68
3.42
2.97
3.46
2.72
3.82
3.87
3.34
表3 响应面法设计及试验结果
因素
A.萃取压力/MPa
B.萃取温度/℃
C.萃取时间/h
水平
-1
25
45
1.5
0
30
50
2.0
1
35
55
2.5
表2 试验设计因素和水平
0.00.5
1.01.5
2.02.5
3.03.5
10 15 20 25 30 35CO2流量/(kg/h)
柠
檬
苦
素
提
取
率
/(g/k
g)
图4 CO2流量对柠檬苦素提取率的影响
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孟 鹏：响应面法优化超临界CO2萃取金柑籽中柠檬苦素工艺条件的研究
2.3 模型的建立及显著性检验
利用Design-Expert软件对表3数据进行二次回归
拟合，得到金柑籽柠檬苦素提取率(Y)对萃取压力(A)、
萃取温度(B)和萃取时间(C)的回归模型：
采用ANOVA分析响应面的回归参数，验证回归
模型及各参数的显著度，结果见表4。
由表4方差分析可知，此模型的P<0.0001，响应面
回归模型达到高度显著水平。模型失拟项表示模型预
测值与实际值不拟合的概率 [17]。模拟失拟项 P=
0.0678>0.05，模拟失拟项不显著，说明所选模型适
宜。该方程的相关系数R2为0.990，说明模型相关度很
好。变异系数(CV)反应模型的置信度，CV值越低，模
型的置信度越高。本实验的CV值为1.83%，说明模型
方程能够很好的反映真实的试验值，可用此模型对柠
檬苦素提取率进行分析和预测。
对上述回归模型系数的逐项显著性检验结果表
方差来源
模型
A
B
C
AB
AC
BC
A2
B2
C2
残差
失拟检验
纯误差
总误差
平方和SS
2.74
0.14
0.30
0.42
9.025×10-3
3.025×10-3
0.084
0.83
0.84
6.906×10-3
0.027
0.022
5.320×10-3
2.77
自由度DF
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
均方MS
0.30
0.14
0.30
0.42
9.025×10-3
3.025×10-3
0.084
0.83
0.84
6.906×10-3
3.856×10-3
7.225×10-3
1.330×10-3
—
F值
78.91
35.06
77.87
108.55
2.34
0.78
21.81
214.27
216.69
1.79
—
5.43
—
—
P
<0.0001
0.0006
<0.0001
<0.0001
0.1699
0.4052
0.0023
<0.0001
<0.0001
0.2227
—
0.0678
—
—
显著性
**
**
**
**
—
—
**
**
**
—
—
—
—
—
表4 响应面二次回归方程方差分析
注：*代表P<0.05，显著；**代表P<0.01，极显著。
明，萃取压力(A)、萃取温度(B)和萃取时间(C)的一次
项影响极显著；A、B因素的二次项影响极显著，C因素
的二次项影响不显著；交互项中BC(P=0.0023)影响极
显著，其他2项不显著。此结果表明萃取压力、萃取温
度和萃取时间对柠檬苦素提取率影响效应明显，且萃
取温度和萃取时间对柠檬苦素提取率有交互作用的影
响。
2.4 响应面交互作用分析与优化
响应面图形是响应值对各输入因子构成的三维空
间的曲面图。响应面分析的等高线图可直观地反映各
因素对响应值的影响及最佳参数和各参数之间的相互
作用，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之
相反[18-19]。图6~8分别显示了萃取温度、萃取时间和萃
取压力3组实验参数以柠檬苦素提取率为响应值的趋
势图。
由图6可知，萃取温度和萃取压力交互作用显著，
柠檬苦素提取率随着萃取压力和萃取温度的升高呈先
上升后下降趋势。柠檬苦素提取率对萃取压力的变化
比对萃取温度的变化敏感。由图 7可知，萃取时间和
萃取温度交互作用显著，当提取时间超过2 h时，柠檬
苦素提取率不再显著增加。由图 8可知，萃取时间和
萃取压力交互作用显著，金柑籽柠檬苦素提取率随着
时间的延长和压力的加大呈先上升后下降趋势。
2.5 回归模型的验证
由图 6a、图 7a和图 8a中响应面立体图可以看出，
响应值存在最大值。通过软件分析、计算，当柠檬苦素
提取率最大预测值为 3.94 g/kg 时，萃取压力为
32.78 MPa，萃取温度为50.45℃，萃取时间为2.50 h。
为检验模型预测的准确性，以萃取压力为
33 MPa，萃取温度为50℃，萃取时间为2.5 h的条件下，
·· 293
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图6 Y=F（压力A，温度B）对柠檬苦素提取率影响的响应面图和响应等高线图
图7 Y=F（温度B，时间C）对柠檬苦素提取率影响的响应面图和响应等高线图
图8 Y=F（压力A，时间C）对柠檬苦素提取率影响的响应面图和响应等高线图
B：温度/℃ A：压力/MPa A：压力/MPa
柠檬苦素含量/(g/kg)b
B
：温
度
/℃
柠
檬
苦
素
含
量
/(
g/
kg
)
a
a
柠
檬
苦
素
含
量
/(
g/
kg
)
b
C：时间/h B：温度/℃
C
：时
间
/h
B：温度/℃
C：时间/h A：压力/MPa
A：压力/MPa
C
：时
间
/h
柠
檬
苦
素
含
量
/(
g/
kg
)
a
b
柠檬苦素含量/(g/kg)
柠檬苦素含量/(g/kg)
·· 294
孟 鹏：响应面法优化超临界CO2萃取金柑籽中柠檬苦素工艺条件的研究
进行验证试验。重复 5次试验，所得柠檬苦素平均提
取率为 3.98 g/kg，与预测结果吻合。由此表明优化的
回归模型与实际情况相符，回归模型可靠。
3 结论与讨论
超临界CO2萃取技术提取金柑籽中的柠檬苦素，
该方法操作步骤简单、选择分离效果好，有利于类柠檬
苦素等热敏性物质的萃取。
利用响应面法对超临界CO2萃取金柑籽中柠檬苦
素的关键因子进行了优化，建立了柠檬苦素提取率与
3个关键因子（萃取压力、萃取温度及萃取时间）的二
次多项式回归模型，经检验证明该模型是合理可靠的，
同时利用模型的响应面及其等高线对柠檬苦素提取率
的关键因子及其相互作用进行了分析，得出了最佳柠
檬苦素提取率的优化条件为：萃取压力为 33 MPa，萃
取温度为 50℃，萃取时间为 2.5 h的条件下，柠檬苦素
最大提取率为3.98 g/kg。响应面优化超临界CO2萃取
工艺，对各因素的考察较为全面、系统，实验结果具有
一定的实际应用价值。
与传统提取方法相比，超临界CO2萃取法提取速
度快且安全性高，但目前国产的超临界萃取设备容积
偏小，无法满足工业化生产的需要，而进口设备价格十
分昂贵，在一定程度上阻碍了工业化生产进程。
金柑籽是废弃物，但其中含有大量的活性物质有
待进一步开发和利用，应合理的综合利用该资源，充分
提高其所含的活性物质和有效成分的利用率，在工业、
农业、医疗等方面做出更大贡献。
参考文献
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