全 文 ：书基金项目:国家自然科学基金(编号:81260512);云南省大理学院应用
开发研究基(编号:Kyyy201102)
作者单位:671000，大理学院药学与化学学院(汪春平 骆婷婷 蓝
海);大理学院基础医学院(吴利先 王涛)
通讯作者:蓝海 E-mail:lanhai8696@ 126． com
紫地榆防龋活性筛选及其防龋机制初步研究
汪春平 骆婷婷 吴利先 王涛 蓝海
【摘要】 目的:研究紫地榆各提取物防龋活性和活性成分对口腔致龋菌的增殖抑制以及产酸、产多糖功能的影响。方法:以
洗必泰和五倍子作为阳性对照，采用试管二倍稀释法研究紫地榆提取物对 2 种主要致龋菌生长和代谢的影响，先测定紫地榆
5种提取物对变形链球菌(S． mutans)、黏性放线菌(A． viscosus)的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)，从中筛选出防
龋活性部位;再测定低于 MIC 的 4 个浓度的紫地榆防龋活性部位对 2 种致龋菌产酸、产多糖的影响。结果:紫地榆正丁醇萃
取部位对 2 种致龋菌抑制效果最好，对细菌产酸、产多糖均有一定的抑制作用，但作用弱于洗必泰和五倍子。结论:紫地榆正
丁醇萃取部位可抑制致龋菌生长代谢，可能是一种天然防龋药物。
【关键词】 紫地榆;致龋菌;生长;产酸;产多糖
Preliminary study of Geranium Strictipes Ｒ． Knuth anticarie activity and anticaries mechanism
WANG Chunping1，LUO Tingting1，WU Lixian2，WANG Tao2，LAN Hai1 ． 1． 671000，College of Pharmaceutical
and chemical，Dali University，China;2． Dali University of Basic Medical，Yunnan
【Abstract】Objective:To screen the different extracts from Geranium strictipes with anticaries activity，and to study the effect of the
active extract on the production of acid and polysaccharides of oral cariogenic bacteria． Methods:Chlorhexidine and Galla Chinensis
were used as the positive controls． Tube double dilution method was used to study the extracts of Geranium strictipes on the growth of
Streptococcus mutans(S． mutans)and Actinomyce viscosus(A． viscosus)． First，the activity of 5 extracts fom Geranium strictipes against
S． mutans，A． viscosus was detected． Their minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)
were obtained． The effects of 4 lower concentrations(＜ MIC)of the active extract on the production of oral bacterial acid polysaccha-
rides were examined． Ｒesults:The effect of n-butanol extraction part of Geranium strictipes was the strongest among all the extracts a-
gainst the two kinds of bacteria in the inhibition of bacteria growth，bacterial acid production and polysaccharides production，but wea-
ker than that of Chlorhexidine and Galla Chinensis． Conclusion:N-butanol extraction part of Geranium strictipes may be a natural and
effective anti-caries agent．
【Key words】 Geranium strictipes;Caries bacteria;Growth;Production of acid;Polysaccharide production
中图分类号:Ｒ780． 1 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 3733． 2016． 05． 005
龋病是牙齿在以细菌为主的多种因素影响下，发
生的慢性进行性破坏性的疾病。它发病率高，分布范
围广，是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其
与癌肿和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
从上世纪 80 年代开始，许多国内外学者对龋病预防与
治疗方面进行研究，发现天然药物对龋病具有较好的
作用，副作用少。紫地榆(赤地榆，Geranium strictipes)
是牻牛儿苗科老鹳草属植物(Geranium strictipes Ｒ．
Knuth)的根，民间称为隔山消［1］，常用于治疗厌食、肠
炎、红白痢疾、消化不良等病症［2］。紫地榆在抑制脱
矿和促进再矿化方面效果明显，且紫地榆中的鞣酸可
抑制牙本质胶原的分解，阻碍牙本质龋的进程［3 － 4］。
已知紫地榆粗提取物对口腔致龋菌具有抑制作用［5］，
但具体哪一溶剂提取物的抑菌效果还不确切，本文对
紫地榆 5 个提取部位的防龋作用进行研究，以期找到
其防龋活性部位并对其可能的防龋机制进行探讨。
1 材料与方法
1． 1 实验仪器
隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，
SSY-4 电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司) ，LC-
4012 低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公
司)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医
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疗设备厂) ，G254 硅胶板(青岛海洋化工有限公司) ，
中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司) ，药筛(80
目)，旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ，精密酸度计
PHS-3C(上海精密仪器仪表有限公司) ，超净台(苏州
市金净净化设备科技有限公司) ，厌氧产气袋(生物梅
里埃，批号 1003385890) ，多功能酶标仪(Gene Compa-
ny Limited)，移液器(Eppendorf)。
1． 2 主要试剂
TPY液体培养基(广东环凯微生物有限公司) ，琼
脂(广东环凯微生物有限公司);葡萄糖，蔗糖，95%乙
醇，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，无水乙醇，硫酸，以上试剂
均为分析纯。葡萄糖标准品(成都曼斯特生物科技有
限公司，批号:14072601)。
1． 3 紫地榆各提取物的制备
紫地榆药材于 2014-05 购买于大理市药材市场，
经大理学院药学与化学学院杨月娥老师鉴定为牻牛儿
苗科老鹳草属植物的根。取紫地榆药材适量粉碎，加
95%乙醇冷浸提取 7 次，合并各次提取液，旋蒸回收溶
剂，得到醇提物总浸膏。
取总浸膏适量，加蒸馏水溶解，依次用石油醚，氯
仿，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，分别旋蒸回收各溶剂，
得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相浸膏。
另取适量醇提物总浸膏，加蒸馏水溶解，用石油
醚、氯仿进行萃取，旋蒸回收各溶剂，得石油醚、氯仿和
混合物浸膏。因石油醚、氯仿萃取所得浸膏量太少，本
次实验对其不做考虑。
五倍子药材于 2015-01 在大理市药材市场购买，
粉碎，95%乙醇冷浸提取 2 次，合并提取液，旋蒸回收
溶剂，得五倍子醇提浸膏。
取醇提物总浸膏、五倍子醇提浸膏、混合物浸膏、
正丁醇浸膏适量，精密称定，加 10%甘油溶液制备成
32． 0 mg /ml的母液;另取乙酸乙酯浸膏、水相浸膏适
量，精密称定，加 10%甘油溶液制备成 128． 0 mg /ml
的母液，分别用 0． 45 mm滤器滤过消毒，4 ℃冰箱放
置。
1． 4 实验菌株及菌液的制备
变形链球菌(Streptococcus mutans． S． mutans)
ATCC25175;黏性放线菌(Actinomyces viscosus，A． vis-
cosus)ATCC27044，购买于广东省微生物菌种保藏中
心。
将复苏的菌种接种于 TPY 固体培养基中，80%
N2、20% CO2 和 37 ℃下厌氧培养 48 h，涂片检查为纯
培养后，分别挑取单个菌落于 TPY液体培养基在相同
条件下培养 18 h增菌，使用麦氏比浊管调整菌悬液浓
度至 0． 5 McFarland(108 CFU /ml)备用。
1． 5 方法
1． 5． 1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)
的测定 将 1． 3 中紫地榆各提取物母液用含 1%葡萄
糖的 TPY液体培养基进行 2 倍稀释，取不同浓度的紫
地榆提取物各 2 ml于试管中，每管分别加入 1． 4 所预
备好的菌液 20 μl，摇匀，37 ℃厌氧培养 48 h后，观察
结果，以肉眼观察无细菌生长为其 MIC值［6］。
观察培养 48 h后各管的液体是否澄清(与阴性组
相比较)，用接种环取肉眼观察可能无细菌生长的各
试管液体一环，分区划线接种于含 1%葡萄糖的 TPY
固体培养基上，37 ℃厌氧培养 48 h，观察菌落数少于
5 ～ 6 个的最低浓度为最低杀菌浓度［7］(MBC)。以上
实验重复 3 次。
实验分组:阳性对照组①:含 0． 05%洗必泰的
TPY菌悬液培养基，每组平行 3 份;阳性对照组②:含
不同浓度五倍子的 TPY 菌悬液培养基，每组平行 3
份;阴性对照组不含药物的 TPY 菌悬液培养基，每组
平行 3 份;溶剂对照组:含 10%甘油的 TPY菌悬液培
养基，每组平行 3 份;药液自身对照:含不同浓度的紫
地榆各提取物的 TPY培养基，每组平行 3 份。实验组:
含紫地榆各提取物的 TPY菌悬液培养基。
1． 5． 2 紫地榆提取物对口腔致龋菌的产酸能力的影
响 根据紫地榆各提取物对上述 2 种致龋菌的 MIC
和 MBC 测定结果，选取正丁醇部位的 MIC 值以下 4
个浓度梯度配制成含 1%葡萄糖的 TPY 液体培养基，
调定初始 pH值为 7． 4，并按菌液与 TPY 液体培养基
比例为 1∶10(V /V)比例分别接种 1． 4 所预备好的 2 种
致龋菌，在 37 ℃和 80% N2、20% CO2 条件下厌氧培
养 48 h，离心，用 pH计测定培养物上清液的 pH值并
计算变化值△pH(初始 pH值 －终末 pH 值)。以不含
药物的培养基中各菌的产酸量作为对照，每组设 6 个
平行管［8 － 9］。
实验分组:阳性对照组①:含 0． 05% 洗必泰的
TPY菌悬液培养基;阳性对照组②:含 1 /2 MIC 五倍
子的 TPY菌悬液培养基;阴性对照组:不含药物的
TPY菌悬液培养基;实验组:含 4 个不同浓度的紫地
榆提取物的 TPY菌悬液培养基。
1． 5． 3 紫地榆提物对口腔致龋菌产胞外多糖能力的
影响 根据紫地榆各提取物对上述 2 种致龋菌的 MIC
和 MBC 测定结果，选取正丁醇部位的 MIC 值以下 4
个浓度梯度配制成含 1% 蔗糖的 TPY 培养基。按菌
液与 TPY液体培养基比例为 1∶10(V /V)比例分别接
种该种细菌，而后 37 ℃厌氧培养 48 h。取培养液按
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3 000 r /min离心 20 min，细菌沉淀物用 5 ml蒸馏水洗
涤、离心 2 次，合并 3 次上清液，作为水溶性多糖
(WSG)样品［10］;水洗后的细菌加入 5 ml 0． 5 mol /L
NaOH 洗涤、离心 3 次，合并上清液，作为水不溶性多
糖(WIG)样品。最后各取 2 部分适量上清液加入 3 倍
体积无水 乙醇，4 ℃冰箱放置过夜，离心，弃水相［11］。
沉淀分别加入 3 ml蒸馏水及 2 ml 0． 1 mol /L NaOH溶
液溶解，用蒽酮法测定水溶性多糖水及不溶性多糖含
量。实验共分 7 组，分组同 2． 2，每组设 6 个平行管。
2 结 果
2． 1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的
测定
紫地榆各提取物对口腔细菌 MIC 和 MBC 测定结
果见表 1。
表 1 紫地榆各提取物对口腔细菌的 MIC和 MBC值(mg /ml)
Tab 1 MIC(mg /ml)and MBC(mg /ml)of each extract of Gerni-
um strictipes against oral bacteria
S． mutans A． viscosus
MIC MBC MIC MBC
醇提物 4 16 2 16
混合物 4 16 2 8
乙酸乙酯部位 4 32 2 16
正丁醇部位 4 16 1 4
水部位 8 ＞ 64 1 16
五倍子醇提物 2 16 1 4
0． 05%洗必泰阳性对照组液体澄清，无细菌生长，
溶剂对照组与阴性对照组结果一致，对细菌生长无抑
制作用。
由表 1 可知，紫地榆的乙酸乙酯和水部位抑菌效
果较差，醇提物、混合物及正丁醇的抑菌效果较好。阳
性对照药五倍子的醇提物在 2 mg /ml浓度下即可抑制
变异链球菌的生长，在 1 mg /ml 浓度下可抑制黏性放
线菌的生长，其抑菌效果强于紫地榆各溶剂提取部位。
经薄层层析发现醇提物及混合物中所含成分较多，正
丁醇部位中物质易于分离纯化，故选择正丁醇部位进
行更深入的防龋研究。
2． 2 紫地榆提取物对口腔致龋菌产酸能力的影响
紫地榆正丁醇部位抑制细菌产酸能力的结果见表 2。
由表可知，随着紫地榆提取物的浓度升高，抑制致
龋菌产酸的作用也随之增强。采用统计学软件 SPSS
17． 0 对各组数据进行分析，发现各浓度组与对照组相
比，高浓度组抑制变异链球菌产酸的作用较明显(P ＜
0． 05)，而最低浓度组(1 /16 MIC)无抑制作用;与对照
组相比，4 个浓度组抑制黏性放线菌产酸且有显著性
差异(P ＜ 0． 05) ;洗必泰、五倍子抑制细菌产酸作用均
强于各浓度实验组。
表 2 紫地榆正丁醇部位对细菌产酸的影响
Tab 2 Inhibitory effect of n-butanol extraction part of Geranium
strictipes on the acid production of cariogenic bacteria
△pH(珋x ± s)
S． mutans A． viscosus
对照组 3． 527 ± 0． 036 2． 730 ± 0． 042
洗必泰组 0． 797 ± 0． 048①③ 0． 728 ± 0． 031①③
五倍子 2． 533 ± 0． 031①② 2． 308 ± 0． 072①②
1 /16MIC 3． 493 ± 0． 029②③ 2． 602 ± 0． 063①②③
1 /8MIC 3． 463 ± 0． 038①②③ 2． 533 ± 0． 061①②③
1 /4MIC 3． 400 ± 0． 083①②③ 2． 468 ± 0． 043①②③
1 /2MIC 2． 911 ± 0． 036①②③ 2． 388 ± 0． 087①②③
注:①:与对照相比较，P ＜ 0． 05;②:与阳性对照洗必泰相比，
P ＜ 0． 05;③:与阳性对照五倍子相比，P ＜ 0． 05
2． 3 紫地榆提物对口腔致龋菌产胞外多糖能力的影响
紫地榆正丁醇部位抑制细菌产胞外多糖能力的结
果见表 3。
由表 3 可以看出，紫地榆正醇部位在各浓度组下
对 2 种口腔致龋菌产胞外多糖均有抑制作用，且与对
照组相比有统计学差异(P ＜ 0． 05);与阳性对照洗必
泰、五倍子相比，抑制变异链球菌产糖作用弱于这 2 种
药物，高浓度组抑制黏性放线菌产多糖与五倍子相比，
无统计学差异(P ＞ 0． 05)。
3 讨 论
五倍子为倍蚜科昆虫蛋倍蚜或角倍蚜等其寄生在
漆树科植物盐肤木，青麸杨或红麸杨等树上形成的虫
瘿［12］，具有抗菌、解毒、收敛、抗氧化等作用，其在口腔
领域的应用中主要可用于抑制口腔内菌斑生物膜的形
成、对致龋菌的抑制作用，对牙周膜细胞的保护作用
以及防止釉质的脱矿和促进其再矿化等作用［13］。
本实验采用五倍子作为阳性对照药之一，其分别
在 2 mg /ml及 1 mg /ml浓度下可明显抑制口腔 2 种主
要致龋菌变异链球菌、黏性放线菌的生长，且在其
1 /2 MIC浓度时抑制细菌产酸能力强于高浓度的紫地
榆正丁醇活性部位，而弱于洗必泰;在产胞外多糖方
面，五倍子抑制变异链球菌产多糖的能力与紫地榆正
丁醇提取物相比，效果较好，其抑制黏性放线菌产多糖
的能力与高浓度紫地榆相比，无统计学差异(P ＞0． 05)。
·226· 实用口腔医学杂志(J Pract Stomatol)2016 Sep，32(5)
表 3 紫地榆正丁醇部位对口腔细菌产胞外多糖能力的影响
Tab 3 The effect of n-butanol extraction part of Geranium strictipes on the water soluble glucanm (WSG)and water insoluble glucan
(WIG)generation of oral bacteria
S． mutans A． viscosus
WSG(μg /ml) WIG (μg /ml) WSG(μg /ml) WIG(μg /ml)
对照组 82． 85 ± 2． 34 22． 59 ± 0． 70 74． 03 ± 2． 14 13． 92 ± 0． 79
洗必泰 20． 69 ± 0． 90① 4． 09 ± 0． 57①③ 21． 39 ± 1． 50①③ 2． 65 ± 0． 38①
五倍子 22． 13 ± 1． 99① 5． 65 ± 0． 72①② 24． 78 ± 2． 00①② 3． 45 ± 0． 35①
1 /16MIC 47． 40 ± 3． 29①②③ 12． 87 ± 0． 38①②③ 68． 41 ± 1． 64①②③ 12． 02 ± 0． 82①②③
1 /8MIC 41． 48 ± 2． 04①②③ 10． 04 ± 0． 68①②③ 54． 05 ± 2． 15①②③ 9． 04 ± 0． 74①②③
1 /4MIC 35． 14 ± 2． 87①②③ 7． 83 ± 0． 83①②③ 39． 31 ± 1． 02①②③ 7． 48 ± 0． 96①②③
1 /2MIC 28． 05 ± 1． 35①②③ 5． 85 ± 0． 32①②③ 25． 60 ± 1． 25①② 3． 88 ± 0． 54①②
注:①:与对照相比较，P ＜ 0． 05;②:与阳性对照洗必泰相比，P ＜ 0． 05;③:与阳性对照五倍子相比，P ＜ 0． 05
另一阳性对照药洗必泰，又叫双氯苯双胍己烷，是一种
较好的抗龋化学药物，能与唾液糖蛋白结合，使牙面吸
附蛋白减少，干扰菌斑形成;其还可与细菌细胞外多糖
结合，使细菌不易吸附到获得膜上，达到预防和减少牙
周病和龋病的目的。但长期使用洗必泰会有牙齿变
色、味觉障碍等副作用。
现代龋病病因学说认为细菌是龋病发生的主要原
因，其中细菌以变异链球菌为主要的致龋菌。细菌可
利用环境中的蔗糖产酸，导致环境中 pH局部下降，使牙
釉质脱矿;同时也可利用蔗糖合成本身所需要的能源物
质 －胞外水溶性多糖和致龋的重要毒力因子水不溶性
多糖，水不溶性葡聚糖可促进细菌对牙面的黏附，并参
与菌斑基质的组成，是构成牙菌斑的主体物质［14］。
由实验结果可知紫地榆正丁醇提取物具有较好的
抑制致龋菌的生长，降低细菌产酸及胞外多糖的能力，
这可能与其中含有的鞣质类成分有关。鞣质可通过抑
制葡糖基转移酶(GTTFs)的活性和糖苷的合成从而减
少龋齿形成［15］。现已从紫地榆中分离出 β-1，4，6-三-
O-没食子酰基-葡萄糖(I)、β-1，6-二-O-没食子酰基-
葡萄糖(Ⅱ)、鞣花酸(Ⅲ)、五倍子酸甲酯(Ⅳ)、没食子酸
(Ⅴ)、(+)-儿茶素(Ⅵ)等鞣质成分［16］。紫地榆中具体
是哪一类鞣质成分通过抑制致龋菌的产酸和生成胞外
多糖来达到防龋作用还有待进行更加深入的研究。
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(收稿:2015-11-08 修回:2015-12-19)
·326·实用口腔医学杂志(J Pract Stomatol)2016 Sep，32(5)