全 文 ： 收稿日期：2008-08-28
基金项目：福建省自然科学基金项目(2008J0271)资助
作者简介：张宏梓（1970-），男，福建尤溪人，高级工程师，从事森林培育研究.。
注：黄儒珠为通讯作者。

金弹总 DNA 提取及 RAPD 体系优化
张宏梓1，黄儒珠2，吴擢溪1，黄丽峰2
(1.尤溪县林业科技推广中心, 福建 尤溪 365114；2.福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350108)

摘 要：以金弹叶片为材料, 研究其总 DNA 提取方法及 RAPD-PCR 条件。结果表明，用改良 CTAB 法Ⅱ提
取的 DNA 适于 RAPD 分析；优化的金弹 RAPD-PCR 体系为：反应体积 20 µl，Mg2+ 2.5 mmol/L、dNTP 0.25
mmol/L、引物 0.20 µmol/L、模板 DNA 1.0 ng/µl 和 1 U Taq DNA 聚合酶。相应的扩增程序为：94 ℃预变性 3 min；
94 ℃变性 45 s，37 ℃复性 60 s，72 ℃延伸 120 s，循环 45 次；72 ℃延伸 10 min，4 ℃结束。
关键词：金弹；DNA 提取；RAPD
中图分类号：S666.9; Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2009)01-0007-05

Total DNA Extraction and RAPD System Optimization of Fortunella crassifolia
ZHANG Hong-zi1, HUANG Ru-zhu2, WU Zhuo-xi1, HUANG Li-feng2
(1.Forestry Science and Technology Extension Center, Youxi 365114, Fujian China; 2.College of Life Sciences, Fujian Normal
University, Fuzhou 350108, Fujian China)

Abstract: Three different methods were used for total DNA extraction from fresh leaves of
Fortunella crassifolia, respectively. The results showed that the most effective method for RAPD
analysis was improved CTAB Ⅱ protocol. Four influencing factors on RAPD-PCR, including Mg2+,
dNTP, primer and DNA template concentration were tested using single factor design and uniform
design. A suitable RAPD-PCR system for F. crassifolia was established as follows: 20 µl PCR
solution, 2.5 mmol/L Mg2+, 0.25 mmol/L dNTP, 0.20 µmol/L primer, 1.0 ng/µl DNA template, 1 U
Taq DNA polymerase and 10×buffer. The RAPD-PCR was programmed by a cycle for 3 min at
94 ℃, followed by 45 cycles for 45 s at 94 ℃, 60 s at 37 ℃ and 120 s at 72 ℃, and finally by a
cycle for 10 min at 72 ℃, storing at 4 ℃.
Key words: Fortunella crassifolia; DNA extraction; RAPD

金弹（Fortunella crassifolia）又称金柑，系芸香科（Rutaceae）金柑属植物，其果实色泽艳丽，营
养丰富，风味怡人，并有和胃、理气、镇咳、化痰、润肺、醒酒等功能，是我国传统的名优佳果之一。
金弹树姿优美浓绿，且常年花果同生，花洁白芳香，果形美色艳，极具观赏价值，在我国南方各省区
作食用兼观赏树种广为栽植。享有“中国金柑之乡”美誉的福建省尤溪县，有300多年的金弹栽培历史，
栽植规模、产量和经济效益居全国前列。据统计，2006年尤溪县金弹种植面积达2 453.3 hm2，投产面
积1 833.3 hm2，产量1.9万t，在全国五大金柑产区中位列第三[1]。
随着金弹产业规模的发展和壮大，加快优良品种的选育和改良，提高良种化水平，已成为其产业
化的关键。为此，本课题组于 1999 年开始进行金弹品种优选工作，经过品种收集、筛选、试点栽培、
综合评定等，已筛选出 20 个优良单株。鉴于传统育种方法要求育种者具备一定的生产实践经验，且投
入大、耗时长等，笔者尝试应用 RAPD 技术对已筛选的金弹优良单株进行分子标记，以期从分子水平
进行分类鉴定，揭示其亲缘关系和遗传多样性，并结合不同优良单株的特性，筛选高品质品种，从而
提高育种效率，扩展育种目标。

2009,38(1):7-11.
Subtropical Plant Science
第 38 卷 ﹒8﹒
RAPD 标记技术的应用首先要获取高质量的 DNA，并建立稳定可靠的 PCR 条件。已报道的植物
DNA 提取方法中还没有一种方法适于所有植物 DNA 的提取。本研究针对金弹次生代谢物质（特别是
芳香类物质）含量高的特点，并借鉴前人对顽拗植物 DNA 提取以及核分离方法[2-4]，设计 3 种方法用
于金弹 DNA 提取，并对提取结果进行比较，以期获得金弹 DNA 提取的较佳途径。同时，采取固定
RAPD-PCR 扩增程序，对影响 PCR 扩增的 Mg2+、dNTP、引物和模板 DNA 浓度等 4 因素分别进行单
因素 6 水平和均匀 3 水平的筛选，以获得适合金弹 RAPD 分析的优化反应体系，为后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试金弹叶片采自尤溪县林业科技推广中心筛选的金弹优树。其中，供 DNA 提取实验用的金弹嫩
叶采自同一植株。
1.2 DNA 提取
1.2.1 改良 CTAB 法 I 新鲜金弹嫩叶用自来水、蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干水分。称取 200 mg，剪碎
后置于预冷的研钵中，加少量石英砂及 1.5 ml 核分离液 I [100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L
EDTA，2% PVP (w/v)，2% β-巯基乙醇(w/v)]，迅速研磨成浆状。移至 2.0 ml 离心管中，4 ℃ 5 000 r/min
离心 5 min，弃上清。向沉淀物加入 l.0 ml 核分离液 I，混匀，4 ℃ 5 000 r/min 离心 5 min，弃上清，收
集沉淀（细胞核）。沉淀加 1 ml 65 ℃预热的 3.0×CTAB 裂解液[100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25 mmol/L
EDTA，1.5 mol/L NaCl 和 3.0% CTAB (w/v)]，混匀，置于 65 ℃水浴裂解 60 min；取出，冷却至室温，
加 1/10 体积 7.5 mol/L NH4Ac，颠倒混匀，冰浴 30 min；10 000 r/min 离心 10 min，取上清；用等体积
氯仿/异戊醇(v:v=24:1)抽提 3 次，10 000 r/min 离心 10 min，取上清，加 2 倍体积预冷的无水乙醇混匀，
于-20 ℃冰箱放置 2 h；取出，用灭菌牙签挑出 DNA，70%乙醇洗涤 2 次，无水乙醇洗涤 1 次，自然风
干后，溶于 100 µl TE（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）。
1.2.2 改良 CTAB 法 II 用核分离液 II [50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L EDTA，15%蔗糖(w/v)，
2% PVP (w/v)，2%β-巯基乙醇(w/v)]取代核分离液 I，用 1.5×CTAB 裂解液取代 3.0×CTAB 裂解液，其
余试剂及操作同改良 CTAB 法 I。
1.2.3 改良 CTAB 法 III 用核分离液 II 取代核分离液 I，用 0.5×CTAB 裂解液取代 3.0×CTAB 裂解液，
其余试剂及操作同改良 CTAB 法 I。
1.3 DNA 质量检测
1.3.1 紫外检测 提取的 DNA 样品用 GeneQuantTM pro DNA/RNA 紫外分光光度计测定波长 260 nm 和
280 nm 的光吸收值，以 A260 值估算样品得率，A260/A280 值判断样品的大致纯度。
1.3.2 电泳检测 提取的 DNA 样品上样于 0.8%琼脂糖凝胶，电泳，染色，检测所得 DNA 大致分子量。
1.3.3 酶切检测 Hind III 单酶解：反应体积 20 µl，含样品 DNA 1 µl，酶 15 U，buffer 2 µl。Hind III
和 EcoR I 双酶解：反应体积 20 µl，含样品 DNA 1 µl，Hind III 和 EcoR I 各 7.5 U，buffer 2 µl。酶解条
件：37 ℃，4 h。酶解产物于 0.8%琼脂糖凝胶电泳，染色，拍照。
1.3.4 PCR 扩增检测 以提取的 DNA 样品为模板，用 RAPD 引物 S45（TGAGCGGACA）在 T-1 型
Thermocycler PCR 仪（Biometer 公司）上进行 PCR 扩增。20 µl 反应体系中含模板 DNA 30 ng、MgCl2
2.5 mmol/L、引物 0.4 µmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶 1U、10×PCR 缓冲液 2 µl。扩增程
序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 45 s，37 ℃复性 60 s，72 ℃延伸 120 s，循环 45 次；72 ℃延伸 10
min，4 ℃结束。扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶电泳、染色，并观察拍照。
1.4 RAPD 体系优化
随机抽取 2 个由改良 CTAB 法 II 提取的金弹总 DNA 样品为模板，用引物 S147（AGATGCAGCC）
和引物 S159（ACGGCGTATG）进行 PCR 扩增。
RAPD 体系筛选时，固定扩增程序（同 1.3），以基本扩增体系（同 1.3）为基础，采用单因素试
第 1 期 张宏梓,等：金弹总 DNA 提取及 RAPD 体系优化 ﹒9﹒
验设计结合均匀设计进行筛
选。
单因素设计优化：按表 1
设 6 个梯度的 Mg2+、dNTP、
引物和模板 DNA 浓度，每次
改变 RAPD 体系中的 1 个因
素，以确定该因素对 RAPD
结果的影响。
均匀设计优化：以单因
素设计初选的优化扩增体系
为依据，进一步对 Mg2+、
dNTP、引物和模板 DNA 浓
度 4 个因素进行复筛，每个
因素 3 水平（表 2），按均匀
设计 U15(34)安排实验[5]。
RAPD 扩增产物于 1.5%
琼脂糖凝胶电泳、染色，并
观察拍照。
2 结果与分析
2.1 DNA 提取
表 3 为 3 种方法提取的金弹总 DNA A260/A280 及提
取得率。3 种方法提取的金弹总 DNA 的 A260/A280 为
1.75～1.92，得率 98.2～241.7 µg/g fw。从纯度来看，改
良 CTAB 法 II 提取的总 DNA 纯度最高，其次是改良
CTAB 法 I，再次是改良 CTAB 法 III。就 DNA 提取得
率而言，改良 CTAB 法 III＞改良 CTAB 法 II＞改良
CTAB 法 I。
由图 1 可知，3 种方法提取的 DNA 约 48 kb，图谱
拖尾不明显，说明 DNA 降解少，片段较完整；泳道 1、
2、3 和 4 点样孔几乎没有残留，说明改良 CTAB 法 I
和改良 CTAB 法 II 的杂质去除较彻底。相对而言，改
良 CTAB 法 III （泳道 5、6 点样孔有少许残留）提取
的 DNA 含有少许杂质。
从图 2 可见，3 种方法提取的金弹总 DNA 均能被
Hind III 和 EcoR I 酶解，且单酶解与双酶解的效果差异
不大。比较而言，在实验条件下，改良 CTAB 法 I、II
提取的金弹总 DNA 酶解较完全（泳道 1、4 和 2、5），
改良 CTAB 法 III 提取的金弹总 DNA 酶解效果较差（泳
道 3、6，点样孔近处残留较多的质量较大的 DNA 分子），
表明改良 CTAB 法 III 提取的总 DNA 可能含有干扰酶
作用的杂质。图 3 表明，改良 CTAB 法 I、III 提取的金
弹总 DNA 能扩增出 RAPD 条带，但扩增不完全（大于
表 1 RAPD 体系单因素设计筛选
水平 MgCl2(mmol/L) dNTP(mmol/L) 引物(µmol/L) 模板 DNA(ng/µl)
1 1.0 0.10 0.05 0.5
2 1.5 0.15 0.10 1.0
3 2.0 0.20 0.20 1.5
4 2.5 0.25 0.30 2.0
5 3.0 0.30 0.40 2.5
6 3.5 0.35 0.50 3.0
表 2 RAPD 体系均匀设计筛选
实验号 MgCl2(mmol/L) dNTP(mmol/L) 引物(µmol/L) 模板 DNA(ng/µl)
1 2.0 0.30 0.15 1.5
2 2.5 0.25 0.10 1.5
3 2.0 0.30 0.20 1.0
4 2.0 0.20 0.15 1.0
5 2.5 0.20 0.15 2.0
6 2.5 0.20 0.20 1.5
7 1.5 0.25 0.10 1.0
8 1.5 0.20 0.10 1.5
9 1.5 0.25 0.15 1.5
10 2.5 0.25 0.20 1.0
11 1.5 0.30 0.20 2.0
12 2.0 0.20 0.10 2.0
13 1.5 0.30 0.15 1.0
14 2.0 0.25 0.20 2.0
15 2.5 0.30 0.10 2.0
表3 不同方法提取的金弹总DNA的
A260/A280及提取得率
提取方法 A260/A280 提取得率(µg/g fw)
改良CTAB法I 1.75 98.2
改良CTAB法II 1.81 209.1
改良CTAB法III 1.92 241.7
图 1 不同方法提取的金弹
总 DNA 电泳图谱
M: λDNA(48 kb); 1、2: 改良CTAB法I；
3、4：改良CTAB法II；5、6：改良CTAB法III
图 2 不同方法提取的金弹总 DNA 酶切图谱
M: 100 bp ladder DNA；CK: 空白对照；1～3 分别为
改良 CTAB 法 I、II 和 III(单酶解)；4～6 分别为改良
CTAB 法 I、II 和 III(双酶解)
第 38 卷 ﹒10﹒
900 bp 的条带未能扩增），条带少；而改良 CTAB 法 II
提取的金弹总 DNA 扩增充分，条带多且清晰明亮（泳道 3
和 4）。因此，从扩增效果看，改良 CTAB 法 II 明显优于
改良 CTAB 法 I、III。
2.2 RAPD 体系单因素筛选
不同浓度 Mg2+对 RAPD 结果的影响见图 4（泳道 1～
6）。当 Mg2+为 1.0 mmol/L 时（泳道 1），小于 800 bp 的
条带较模糊，难以辩识；当 Mg2+为 1.5～2.5 mmol/L 时（泳
道 2～4），条带明亮清晰；当 Mg2+升高到 3.0、3.5 mmol/L
时（泳道 5 和 6），条带数增加，且主带变淡。由此可见，
Mg2+浓度过高或过低对金弹 RAPD 扩增都不利，较适宜的
Mg2+浓度为 1.5～2.5 mmol/L。
图 4 中泳道 7～12 为不同浓度 dNTP 对 RAPD 结果的影响。dNTP 为 0.10、0.15 mmol/L 时（泳道
7 和 8），条带清晰但较淡；当 dNTP 为 0.20～0.30 mmol/L 时（泳道 9～11），条带清晰明亮，浓淡适
宜；而当 dNTP 升至 0.35 mmol/L 时，只扩增出一条大小约 900 bp 的条带。由此说明 dNTP 浓度过高不
利于 RAPD 扩增，较适宜的 dNTP 浓度应为 0.20～0.30 mmol/L。
不同浓度引物对 RAPD 结果的影响见图 5（泳道 1～6）。引物浓度为 0.05 µmol/L 时（泳道 1），
条带清晰，但大于 800 bp 的条带没有得到充分扩增，条带弱，难以分辨；当引物浓度为 0.10、0.20 µmol/L
时（泳道 2 和 3），条带扩增充分，且清晰明亮；当引物浓度为 0.30、0.40 µmol/L 时（泳道 4 和 5），
扩增条带减少，且 500 bp 以下的条带得不到扩增；当引物浓度达 0.50 µmol/L 时（泳道 6），只有一条
大小约 670 bp 的条带得到扩增。说明引物浓度过高或过低都会造成扩增不完全。分析表明，对于金弹
RAPD 扩增，0.10～0.20 µmol/L 的引物浓度较适宜。
图 5 泳道 7～12 为不同浓度模板 DNA 对金弹 RAPD 的影响。0.5～3.0 ng/µl 模板 DNA 对 RAPD
扩增带型的影响不大，但对扩增条带的强弱有影响。当模板 DNA 为 0.5 ng/µl（泳道 7）时，大于 800 bp
的条带扩增极弱，难以分辨；模板 DNA 为 1.0～2.5 ng/µl（泳道 8～11）的扩增效果稍好，浓度为 3.0 ng/µl
（泳道 12）的扩增条带较强。考虑到模板 DNA 可能带有杂质而影响扩增结果，因此选取 1.0～2.0 ng/µl
浓度作为后续筛选的基础。
2.3 RAPD 体系均匀设计筛选
在单因素初筛优化扩增体系（Mg2+：1.5～2.5 mmol/L；dNTP：0.20～0.30 mmol/L；引物：0.10～
0.20 µmol/L；模板 DNA：1.0～2.0 ng/µl）的基础上，采用均匀设计对影响 RAPD 扩增的 Mg2+、dNTP、
引物和模板 DNA 等 4 个因素进行复筛。从图 6 可看出，泳道 9、11 和 13 没有条带出现，说明相应的
扩增体系无法进行扩增；泳道 1、3、7、8、14 和 15 扩增条带清晰，但扩增不充分，条带少（特别是
泳道 14 和 15 只扩增出 2 条带），不适于 RAPD 分析；泳道 2 和 12 条带清晰明亮，但泳道 2 大小约
380 bp 的条带没有扩增，泳道 12 大小约 2 000 bp 的条带也没能扩增；而泳道 4、5、6 和 10 扩增充分，
均有 9 条扩增条带，且带型清晰明亮，符合 RAPD 分析的要求；比较而言，泳道 10 的扩增效果更理想。
图 3 不同方法提取的金弹
总 DNA 的 RAPD 带型
M: 100 bp ladder DNA；CK: 空白对照；1、2: 改
良CTAB法I；3、4: 改良CTAB法II；5、6: 改良
CTAB法III
图 4 Mg2+和 dNTP 浓度对金弹
RAPD 结果的影响
M: 100 bp ladder DNA；1～6: Mg2+；7～12: dNTP
图 5 引物和模板 DNA 浓度对金弹
RAPD 结果的影响
M：100 bp ladder DNA；1～6: 引物；7～12: 模板 DNA
第 1 期 张宏梓,等：金弹总 DNA 提取及 RAPD 体系优化 ﹒11﹒
因此选择泳道 10 对应的扩增体系（Mg2+：2.5 mmol/L；dNTP：0.25 mmol/L；引物：0.20 µmol/L；模
板 DNA：1.0 ng/µl），以及 1 U/20 µl Taq DNA 聚合酶作为筛选优化的结果。
图 7 是引物 S45 对金弹 24 个样本模板 DNA 用优化的反应体系进行 PCR 扩增的结果。图 7 显示，
经单因素和均匀设计两轮优化的反应体系完全适合金弹 RAPD 分析。
3 讨 论
金弹叶片富含芳香类次生代谢物，预实验时用常规 SDS 法和 CTAB 法提取 DNA，不仅提取得率
低，而且获得的 DNA 质量较差，PCR 扩增效果不理想。为此，本实验设计 3 种改良的 CTAB 法，采
用先破碎细胞，离心去杂，收集细胞核，再破核释放 DNA，经分离纯化，获得 DNA。同时，在核分
离缓冲液中添加 2% PVP 和 2%β-巯基乙醇，以防止芳香类物质的污染（PVP 能与酚类形成络合物，
β-巯基乙醇可抑制酚类物质氧化）。改良 CTAB 法避免了常规方法中同步裂解细胞与细胞核导致的
DNA 受次生代谢物污染。3 种改良 CTAB 法提取的 DNA，通过紫外、电泳、酶切及 PCR 扩增检测，
结果表明 DNA 质量及提取得率均明显高于常规 SDS 法和 CTAB 法。综合分析表明，改良 CTAB 法 II
优于改良 CTAB 法 I、III。因此确定改良 CTAB 法 II 为金弹总 DNA 提取的最佳方案。
RAPD 体系优化是牵涉多因素多水平的试验。本研究采用单因素初筛结合均匀设计复筛，获得较
满意的实验结果。单因素设计筛选由于是建立在基本扩增体系的基础上，每次考察单个因子对 RAPD
结果的影响，难以反映各因素、水平间的交互作用，优化的结果仅仅是局部最优，未必是最佳结果。
多因素多水平试验较理想、常用的方法是正交试验设计或均匀试验设计。正交试验设计既考虑到试验
点在试验范围内的均匀分散，同时也考虑到试验点的整齐对比；而均匀试验设计只考虑试验点的均匀
分散，而忽略整齐对比，因而均匀试验设计试验次数比正交试验设计少。另外，应用正交或均匀试验
设计，在实验结果缺乏定量评价指标时，无法用数学手段对结果进行计算分析。因此，一定次数的重
复试验是必要的，而重复试验次数增加，实验工作量也将成倍增长。故对水平数多的试验，应用均匀
试验设计可大大减少试验次数，获得事半功倍的效果。
除试验设计方法外，试验因素与水平的选择也非常重要。因素与水平的选择往往带有经验性，本
研究的基本扩增体系以及单因素设计中的 4 因素 6 水平，便是参考大量文献而确定的。此外，Taq DNA
聚合酶浓度以及 PCR 扩增程序也是影响 RAPD 结果的因素，但在筛选实验中，未将两者列为考察因素，
一是基于已有的文献报道，在 20 µl 反应体系中用 1U 的 Taq DNA 聚合酶是普适的，且通过体系其他因
素的优化组合可以使 Taq DNA 聚合酶发挥最大功效。本研究 RAPD 体系的初筛、复筛以及验证实验也
表明，20 µl 反应体系中含 1U Taq DNA 聚合酶完全适宜金弹 RAPD-PCR 扩增。二是基于初选的扩增程
序基本能得到满意的实验结果（图 3），故筛选时将 PCR 扩增程序固定，以减少实验次数。RAPD 体
系的初筛、复筛以及验证实验证明，初选的扩增程序对金弹 RAPD-PCR 是适用的。
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图 6 RAPD 体系均匀设计筛选结果
M：100 bp ladder DNA；1～15 对应表 2 实验号
图 7 引物 S45 对 24 个金弹样本 RAPD 扩增的带谱
M: 100 bp ladder DNA；CK: 空白对照；1～24 为金弹样本