全 文 ：华西药学杂志
W C J·P S 2013，28(2)∶175 ～ 177
基金项目:安徽省高等学校省级自然科学研究项目(编号:KJ2012B109) ;蚌埠医学院优秀人才基金项目(编号:2006BR068)
作者简介:王春景(1972—) ，男，硕士，讲师，从事天然植物资源的开发利用研究。Email:wchjrosa@ 163． com
长萼鸡眼草的抗氧化性及其总酚和总黄酮的测定
王春景，乔继彪，邵丹丹，姚文武，李建华
(蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233030)
摘要:目的 筛选长萼鸡眼草的高抗氧化活性萃取部，测定其总酚和总黄酮的含量。方法 长萼鸡眼草乙醇提取物分别用石
油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，利用清除 OH·、O －2·和 DPPH·实验以及还原能力等方法评价其不同极性萃取部的抗氧化
能力。采用 Folin － Ciocalteu法测其总酚含量，NaNO2 － Al(NO3)3 － NaOH 显色法测总黄酮含量。结果 长萼鸡眼草正丁醇萃
取部和乙酸乙酯萃取部的抗氧化活性最强，对 OH·和 O －2·的清除效果显著高于 VitC(P ＜ 0． 05) ，石油醚萃取部和氯仿萃取部
的抗氧化作用较弱。长萼鸡眼草正丁醇萃取部和乙酸乙酯萃取部的总酚含量分别为 105． 81 ± 0． 25、144． 63 ± 0． 54 mg·g －1，总
黄酮含量分别为 199． 15 ± 2． 63、396． 24 ± 5． 13 mg·g －1。结论 长萼鸡眼草的高抗氧化萃取部为正丁醇萃取部和乙酸乙酯萃
取部，其抗氧化活性组分可能为酚酸类和黄酮类化合物，可作为天然抗氧化物质的来源。
关键词:长萼鸡眼草;自由基清除;活性部位;酚酸;黄酮
中图分类号:R96，R917 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2013)02 － 0175 － 03
Antioxidant activity and total phenolic and flavonoid contents of Kummerowia stipulacea
WANG Chun － jing，QIAO Ji － biao，SHAO Dan － dan，YAO Wen － wu，LI Jian － hua
(Department of Bioscience，Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui，233030 P． R． China)
Abstract:OBJECTIVE To screen the fractions with high antioxidant activity from the extracts of Kummerowia stipulacea and deter-
mine the total phenolic and flavonoid amouts of the fractions． METHODS The ethanol extracts of K． stipulacea were fractioned by
extration using petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n － butyl alcohol． Hydroxyl radical(OH·) ，superoxide anion(O －2·) ，1
1 － Diphenyl － 2 － picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging assays and reducing activity test were used to evaluate their antioxidant
activity of the four fractions． Total phenolic contents were determined by Folin － Ciocalteu method，and total flavonoid contents were
determined by NaNO2 － Al(NO3)3 － NaOH method． RESULTS Ethyl acetate fraction and n － butyl alcohol fraction exhibited the
highest antioxidant activity． Their hydroxyl radical and superoxide anion scavenging activity were significantly higher than the control
ascorbic acid(Vit C) (P ＜ 0． 05)． The antioxidant activity of petroleum ether fraction and chloroform fraction was lower than that of
ethyl acetate fraction and n － butyl alcohol fraction． Total phenolic contents of n － butyl alcohol and ethyl acetate fraction were 105． 81 ±
0． 25 mg·g －1 and 144． 63 ± 0． 54 mg·g －1，respectively． Total flavonoid contents of n － butyl alcohol and ethyl acetate fraction were
199. 15 ± 2． 63 mg·g －1 and 396． 24 ± 5． 13 mg·g －1，respectively． CONCLUSION The strong antioxidant activity fractions of
K． stipulacea were n － butyl alcohol and ethyl acetate fractions． The most possible antioxidant phytochemicals were phenolics and
flavonoids． K． stipulacea could be a source of natural antioxidants．
Key words:Kummerowia stipulacea;Free radical scavenging;Active fraction;Phenolics;Flavonoids
CLC number:R96，R917 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2013)02 － 0175 － 03
长萼鸡眼草 Kummerowia stipulacea(Maxim．)
Makino是豆科鸡眼草属的一年生草本植物，具有清
热利湿、解毒消肿等功效［1］。鸡眼草属植物全球仅
2 种，另一种为鸡眼草 K． striata(Thunb．)Schindl．，
民间统称鸡眼草或掐不齐等。鸡眼草提取物具有一
定的抗氧化性［2］，但长萼鸡眼草抗氧化生物活性的
研究未见报道。现研究了长萼鸡眼草不同极性萃取
部的自由基清除作用及还原能力，并测定其总酚和
总黄酮含量，以探究其高抗氧化活性萃取部，为天然
抗氧化剂及功能性保健食品或生物制品的研究开发
提供实验依据。
1 实验部分
1． 1 仪器与试药
UV －1800 紫外 /可见分光光度计(北京瑞利分
析仪器公司)。没食子酸对照品(中国药品生物制
品检定所，批号:110831 － 200803) ;芦丁(北京恒元
启天化工研究所，批号:MUST －11040302) ;1，1 －二
苯基 － 2 －苦基肼(DPPH)、邻菲啰啉、硫酸亚铁铵、
氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、L －蛋氨酸、核黄素、铁
氰化钾、三氯乙酸、抗坏血酸等为分析纯;长萼鸡眼
草采自蚌埠市郊，经安徽师范大学周守标教授鉴定
DOI:10.13375/j.cnki.wcjps.2013.02.017
为 豆 科 植 物 Kummerowia stipulacea (Maxim．)
Makino。
1． 2 方法与结果
1． 2． 1 长萼鸡眼草萃取部的制备 将采集的长萼
鸡眼草地上部分室温阴干、粉碎，称取 500 g 粉末，
用 8 倍量的 70%乙醇回流提取(6 h × 3) ，过滤，合
并滤液，减压旋转蒸至无醇味，浸膏得率为
16. 05%，将所得浸膏用 500 mL温蒸馏水混悬，依次
用 500 mL的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，
每种萃取 3 次，合并 3 次萃取液，蒸干，得长萼鸡眼
草醇提物的石油醚萃取部(得率 0． 74%)、氯仿萃取
部(得率 1. 01%)、乙酸乙酯萃取部(得率 0. 82%)、
正丁醇萃取部(得率 3． 51%) ，冷藏备用。
1． 2． 2 OH·清除能力的测定［3］ 向试管中依次加
入 0． 2 mL 10 mmol·L －1邻菲啰啉、2 mL pH7． 4 HCl
缓冲溶液、1 mL溶度分别为 0． 2、0． 4、0． 6、0. 8、1. 0、
1． 2、1． 4 mg·mL －1的样品液、0． 2 mL 10 mmol·L －1硫
酸亚铁铵、0． 5 mL 1% H2O2，用超纯水定容至 10
mL，于 37 ℃水浴 1 h，在 510 nm处测各吸光度 A样，
同法测定不加 H2O2 和提取液反应体系的吸光度
A未损，加 H2O2 但不加提取液反应体系的吸光度 A损。
清除率 = (A样 － A损)/(A未损 － A损)× 100%。由图
1A可知:长萼鸡眼草 4 个萃取部对 OH·均有一定的
清除能力，清除率随浓度的增加而增加。石油醚萃
取部和氯仿萃取部清除 OH·的效果较差，弱于阳性
对照 Vit C，正丁醇萃取部和乙酸乙酯萃取部对 OH·
的清除效果最好，且强于 Vit C，其 IC50差异显著
(P ＜ 0． 05) (表 1)。
1． 2． 3 O －2 ·清除能力的测定
［4］ 反应体系依次加
入 3 mL磷酸缓冲液(pH7． 8)、130 mmol·L －1 L －蛋
氨酸、0． 75 mmol·L －1 NBT、0． 1 mmol·L －1 EDTA、0． 2
mmol·L －1核黄素各 0． 6 mL、1 mL待测样品液，用 40
W荧光灯光照 20 min，在 560 nm处测吸光度 A样，同
法以1 mL磷酸缓冲液(pH7． 8)代替样品液测吸光度
A0。清除率 =(1 － A样 /A0)× 100%。图 1B 显示长
萼鸡眼草 4 个萃取部对 O －2·清除率和样品浓度间也
表现出一定的量效关系，随着浓度的升高，清除率不
断增加。由表 1 可知:正丁醇萃取部和乙酸乙酯萃
取部清除 O －2·能力强于 Vit C，二者的 IC50均显著低
于 Vit C(P ＜ 0． 05) ，石油醚萃取部和氯仿萃取部的
清除效果均显著弱于 Vit C(P ＜ 0． 05) ，但氯仿萃取
部又显著强于石油醚萃取部。
1． 2． 4 DPPH·清除能力的测定［5］ 将 2 mL 0． 2
mmol·L －1 DPPH甲醇溶液与 2 mL 各浓度样品液混
匀，于室温暗处反应 30 min，在 517 nm 处测吸光度
A样，同法以2 mL甲醇代替样品液测空白吸光度 A0，2
mL甲醇代替 DPPH溶液测样品本底吸光度 A底。清
除率 =［1 －(A样 － A底)/A0］× 100%。长萼鸡眼草
各萃取部对 DPPH·的清除率也随着其浓度的增加
而逐渐升高，但 4 个萃取部的清除效果均较 Vit C
差，最高浓度时，正丁醇部的清除率最高(图 1C)。
正丁醇部和乙酸乙酯部的 IC50差异不显著(P ＞
0. 05) ，但均显著低于石油醚部和氯仿部的 IC50
(P ＜ 0． 05) (表 1)。
Sc
av
en
gi
ng
ra
te
/%
100
80
60
40
20
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
100
80
60
40
20
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
100
80
60
40
20
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Vit C
石油醚萃取部
氯仿萃萃取部
乙酸乙酯萃取部
正丁醇萃取部
C/mg·mL-1
A B C
0 0
图 1 长萼鸡眼草不同萃取部对羟自由基(A)、超氧阴离子自由基(B)和 DPPH自由基(C)的清除效果(n =3)
Fig 1 Scavenging activity of hydroxyl radical(A)，superoxide anion(B)and DPPH radical(C)of different fractions of K． stipulacea(n =3)
1． 2． 5 还原能力的测定［5］ 各管中分别加入 3 mL
磷酸缓冲液(pH6． 6)、2． 5 mL 1%铁氰化钾和各样
品液，摇匀，于 50 ℃水浴 20 min，快速冷却后加 2． 5
mL 10%三氯乙酸，于 3 × 103 r·min －1离心 10 min，
取 5 mL各上清液，加 1 mL 0． 1%三氯化铁，用超纯
水定容至 10 mL，静置 10 min，在 700 nm 处测吸光
度。由图 2 可知:Vit C的还原能力均高于长萼鸡眼
草 4 个萃取部。实验最高浓度时，其还原能力的大
小顺序为:乙酸乙酯萃取部 ＞正丁醇萃取部 ＞石油
醚萃取部 ＞氯仿萃取部。
1． 2． 6 总酚的含量测定 将没食子酸标准品配成
系列浓度梯度，分别加 0． 5 mL Folin － Ciocalteu 试
剂，5 min后加 1． 5 mL 20% Na2CO3 溶液，定容至 10
mL，于 75 ℃水浴 10 min，通过波长扫描选择 760 nm
671 华 西 药 学 杂 志 第 28 卷
表 1 长萼鸡眼草不同萃取部对自由基的半清除浓度(mg·mL －1，
珔x ± s，n =3)
Table 1 Free radical scavenging IC50 values of different fractions of
K． stipulacea(mg·mL －1，珔x ± s，n =3)
萃取部分 OH· O －2· DPPH·
石油醚 － － 0． 17 ± 0． 01
氯仿 － 0． 90 ± 0． 03* 0． 16 ± 0． 01
乙酸乙酯 0． 61 ± 0． 03* 0． 10 ± 0． 01* 0． 07 ± 0． 01
正丁醇 0． 48 ± 0． 16* 0． 13 ± 0． 01* 0． 06 ± 0． 01
Vit C 0． 79 ± 0． 01 0． 51 ± 0． 01 －
Compared with Vit C:* P ＜ 0． 05
抗坏血酸（Vc）
石油醚萃取
氯仿萃取部
乙酸乙酯萃取
正丁醇萃取
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
C/mg·mL-1
A
图 2 长萼鸡眼草不同萃取部的还原能力(n =3)
Fig 2 Scavenging activity of hydroxyl radical(n =3)
测定吸光度，以没食子酸浓度和吸光度进行线性回
归分析，回归方程为:Y = 0． 1045X + 0． 0293 (r2 =
0. 9965)。取 1 mL 抗氧化活性较高的长萼鸡眼草
乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃取部溶液，按上述方法
测定吸光度，根据标准曲线计算总酚含量。长萼鸡
眼草乙酸乙酯萃取部总酚含量为 144． 63 ± 0. 54
mg·g －1，正丁醇萃取部为 105． 81 ± 0． 25 mg·g －1，二
者差异极显著(P ＜ 0． 01)。
1． 2． 7 总黄酮的含量测定［6］ 吸取芦丁标准液配
成系列浓度，分别加入 0． 3 mL 5% NaNO2，摇匀后
静置 6 min;加 0． 3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀;6 min
后再加入 4 mL 4% NaOH，定容至 10 mL，摇匀后静
置 15 min，通过波长扫描选择 510 nm测吸光度，将芦
丁浓度与吸光度进行线性回归，得回归方程为:Y =
12． 22X +4． 6 × 10 －3(r2 = 0． 9983)。长萼鸡眼草抗氧
化活性较高的乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃取部同法
测定，根据以上标准曲线计算总黄酮含量。长萼鸡眼
草乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃取部总黄酮含量分别
为 396． 24 ±5． 13、199． 15 ± 2. 63 mg·g －1，二者差异极
显著(P ＜0. 01)。
2 讨论
长萼鸡眼草乙醇提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯
和正丁醇萃取部对羟自由基(OH·)和超氧阴离子
自由基(O －2·)均具有一定的清除作用，石油醚萃取
部和氯仿萃取部清除 OH·和 O －2·的能力弱于 Vit C，
正丁醇萃取部和乙酸乙酯萃取部对 OH·和 O －2·的
清除效果均强于 Vit C。长萼鸡眼草 4 个萃取部对
DPPH自由基(DPPH·)也都有一定的清除能力，但
均低于 Vit C。反应后吸光度越大，说明该物质的还
原能力越强［7］。文中各萃取部供应电子的能力较
弱，与清除 DPPH·的实验结果是一致的，提示其对
自由基的清除还有其他机制。石油醚萃取部和氯仿
萃取部对各自由基的清除能力和还原能力均较弱，
显著低于乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃取部，提示长
萼鸡眼草提取物较强抗氧化成分主要存在于正丁醇
萃取部和乙酸乙酯萃取部。很多研究表明黄酮类、
酚酸类等天然产物具有较强的抗氧化活性［8］，实验
证实长萼鸡眼草乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃取部总
黄酮和总酚含量较高，说明其抗氧化活性物质可能
为黄酮类和酚酸类。但乙酸乙酯萃取部和正丁醇萃
取部总黄酮和总酚含量差异均非常显著，而抗氧化
能力却差异不显著，说明还存在其他类抗氧化活性
物质，提示可从这两个萃取部中进一步追踪其强抗
氧化活性单体化合物，可考虑将其作为开发天然抗
氧化剂的资源和将其开发为抗氧化保健食品或生物
制品，从而进一步促进长萼鸡眼草的开发利用。
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收稿日期:2012 － 06 － 18
771第 2 期 王春景，等。长萼鸡眼草的抗氧化性及其总酚和总黄酮的测定