全 文 ：第 32 卷 第 3 期
2013 年 6 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 32 No． 3
Jun． 2013
刀豆、黑豆脲酶的分离与基本性质研究
张宽朝，阮 飞，金 青，文 汉
(安徽农业大学 生命科学学院，安徽 合肥 230036)
摘 要:为加深对豆科植物脲酶的了解，对刀豆、黑豆脲酶进行了分离纯化和基本性质的比较研究。结果表明:刀豆、
黑豆脲酶粗酶液经石油醚脱脂、冷丙酮沉淀、饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DE-52 阴离子交换层析后，纯化倍数分
别为 3． 851 和 3． 36，回收率分别为 5． 35%和 11． 27%。反应进程曲线表明，在 15 min以内，反应产物与反应时间基本
成线性关系。刀豆、黑豆脲酶的 Km分别为 1． 3 × 10
－2和 2． 4 × 10 －3 mol·L －1，最适 pH分别为 7． 0 和 6． 0，酸碱稳定范
围分别为 pH6． 0 ～ 7． 0 和 pH5． 0 ～ 8． 0。
关键词:刀豆;黑豆;脲酶;分离纯化;基本性质
中图分类号:S565． 1 文献标识码:A 文章编号:1000-9841(2013)03-0361-04
收稿日期:2013-01-31
第一作者简介:张宽朝(1981-) ，男，硕士，实验师，主要从事生物化学研究。E-mail:zhangkch1980@ 126． com。
通讯作者:文汉(1963-) ，男，副教授，硕士生导师，主要从事天然产物与次生代谢研究。E-mail:swhx12@ ahau． edu． cn。
Separation and Properties of Urease in Sword Bean and Black Soybean
ZHANG Kuan-chao，RUAN Fei，JIN Qing，WEN Han
(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract:In order to explore the urease in leguminaceous plant，the purification and properties of urease in sword bean
(Canavalina sp．)and black soybean(Glyeine soja Sieb． et Zucc)were studied． Urease were isolated and purified by mineral
ether-degrease，cold acetone deposition，sulfate grade deposition，dialyseion and exchange chromatography． Purification multiple
of ureases from sword bean and black soybea was 3． 851 and 3． 36，recovery was 5． 35% and 11． 27% ． The chart of ureases
reaction showed that the output and reaction time was linear in 15 min． The Km values of sword bean and black soybea were
1． 3 × 10 －2 and 2． 4 × 10 －3 mol·L －1，while the optimum pH were 7． 0 and 6． 0，and the pH stability were 6． 0-7． 0 and
5． 0-8． 0．
Key words:Sword bean;Black soybean;Urease;Separation;Property
刀豆，又名大刀豆、挟剑豆、刀鞘豆等，为豆科
一年生缠绕草质藤本植物刀豆的成熟种子。在我
国江苏、安徽、浙江、江西、台湾、湖北、湖南、广东、
广西、陕西、四川等省区均有分布。黑豆，也称马
豆、黑大豆等，因其种皮呈黑色而得名。由于具有
耐旱、耐瘠、适应性广、营养价值高等特点，黑豆在
中国的大部分地区都有种植。
脲酶，也称尿素酶，一种氨基水解酶，能将尿素
(脲)分解为氨和二氧化碳或碳酸铵，其催化反应速
率比无脲酶非催化反应速率大 1014倍［1］。自然界中
脲酶广泛存在，主要分布于植物的种子中，但以大
豆、刀豆中含量丰富，也存在于动物血液和尿中，某
些微生物也能分泌脲酶。作为重要的生物制剂，脲
酶在医学、畜牧业、环保等方面都有很广泛的应用，
其不仅可用于医疗诊断(如测定尿和血液中的尿
素) ，还可用以检测牛乳粉中大豆粉含量、处理尿素
废水等［2-4］。而目前我国所需商品化脲酶产品主要
依赖进口［4-5］。本试验对刀豆、黑豆脲酶进行了提
取、分离及部分纯化，并对刀豆、黑豆脲酶的部分酶
学性质进行了比较研究，以便进一步加深对豆科植
物刀豆、黑豆中脲酶的了解，同时为解决脲酶的国
产化问题提供一定的技术参考。
1 材料与方法
1． 1 材料与药品
1． 1． 1 材料 试验材料为市售黑豆、刀豆。
1． 1． 2 主要仪器 722S 分光光度计，上海精密科
学仪器有限公司;自动部分收集器，上海青浦沪西
仪器厂;核酸蛋白检测仪，南京新校园生物技术研
究所;梯度混合器，上海沪西分析仪器厂;数显恒温
水浴锅，国华电器有限公司。
1． 1． 3 试剂 DE-52 为 Whatman 分装产品，透析
袋为 Usa分装产品;硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢
钠、EDTA-Na、Tris、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、考马斯
亮蓝 G-250 等，均为国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 脲酶活性测定 酶活测定采用苯酚钠法。
将 1 mL底物与 1 mL酶液分别于 35℃预热 5 min后
混合，摇匀，35℃ 反应 15 min 后，加 0． 1 mol·L －1
HCl 0． 5 mL 终止反应，加入 2 mL 苯酚钠，1． 5 mL
NaOCl 35℃ 发色 30 min，于 630 nm 处测定 OD 值
362 大 豆 科 学 3 期
(空白以磷酸盐缓冲液代替酶液)。以反应时间内
OD630 nm变化 1． 0 为 1 个酶活单位(U)。
1． 2． 2 蛋白质浓度测定 采用考马斯亮蓝染色
法［6］，略有修改。以 100 μg·mL －1牛血清白蛋白为标
准蛋白液，用 0． 9%生理盐水补充体积。以不同浓度
牛血清白蛋白(BSA)相对应的 595 nm的吸光值为纵
坐标，蛋白质含量为横坐标，作标准浓度蛋白质曲线，
其回归方程为 y =0． 006x +0． 005 8，R2 =0． 967 1。
1． 2． 3 脲酶的分离纯化 黑豆或刀豆种子去皮，捣
碎成细粉状。取粉末 10 g，加 40 mL 60 ～90℃沸程的
石油醚浸泡 30 min，循环水真空泵抽滤，去滤液。加
40 mL 60 ～ 90℃沸程的石油醚浸泡 30 min，抽滤，得
脱脂粗豆粉。
将经过粗提的脱脂豆粉加 50 mL 纯水，4℃冰
箱放置过夜，纱布过滤，滤液 4 000 r·min －1离心
15 min，去沉淀。上清液缓慢加 4 倍体积冷丙酮，
4 000 r·min －1离心 15 min，去上清，沉淀以 100 mL
纯水复溶。
复溶液加入固体硫酸铵粉末至 30%饱和度，
4 000 r·min －1离心 15 min，去沉淀。上清液中加固
体硫酸铵粉末至 60%饱和度，4 000 r·min －1离心
15 min，倾去上清液，沉淀溶于 30 mL 0． 006 7 mol·L －1
pH7． 0 磷酸盐缓冲液。
用 0． 006 7 mol·L －1 pH7． 0 磷酸盐缓冲液透析，
4℃冰箱过夜后，将透析液上 DE-52 层析柱。以 0 ～
1． 0 mol·L －1NaCl，0． 006 7 mol·L －1 pH7． 0 的磷酸盐
缓冲液梯度洗脱，自动部分收集器每 5 min 收集 1
管，测定酶活性。
1． 2． 4 进程曲线的制作 各试管分别加入 1 mL
10%尿素，并与酶液在 35℃恒温水浴中同时预热。
精确计时 5 min 后，取 1 mL 酶液加入各管内，剧烈
摇匀，然后按 5，10，15，20，25，30，40，60 min 的时间
间隔加 0． 1 mol·L －1 HCl 0． 5 mL 终止反应，分别加
入 2 mL苯酚钠溶液和 1． 5 mL NaOCl 溶液，充分摇
匀，空白以 1 mL缓冲液代替酶液，35℃反应 20 min。
以空白作对照，630 nm比色测定。以反应时间为横
坐标，OD630为纵坐标作进程曲线。
1． 2． 5 米氏常数 Km的测定 分别取 10，20，30，
40 mmol·L －1尿素各 1 mL 加入试管中，与酶液管一
同在 35℃恒温水浴中预热，逐管计时 5 min，各管加
酶液 1 mL。35℃恒温水浴反应 15 min，加入 0． 1 mol·
L －1HCl 0． 5 mL 终止反应，加 2 mL 苯酚钠溶液和
1． 5 mL NaOCl溶液，35℃反应 20 min。630 nm处比
色测定 OD值。以 1 /V为纵坐标，1 /［S］为横坐标，
由直线在横轴上的交点为 － 1 /Km，计算得 Km。
1． 2． 6 pH 对酶活的影响 取 pH5． 0，6． 0，7． 0，
8． 0，9． 0 缓冲液各 1． 8 mL分别加入试管中，并各加
入尿素 0． 2 mL、酶液 0． 2 mL，35℃恒温水浴反应
15 min，加 0． 1 mol·L －1 HCl 0． 5 mL终止反应后，加
2 mL苯酚钠溶液和 1． 5 mL NaOCl 溶液，35℃反应
30 min。630 nm 处比色测定 OD 值。以反应 pH 为
横坐标，OD630为纵坐标，作 pH对酶活影响曲线。
1． 2． 7 脲酶酸碱稳定性的研究 取 pH5． 0，6． 0，
7． 0，8． 0，9． 0 缓冲液各 0． 2 mL分别加入试管中，并
加入酶液 0． 2 mL，35℃恒温水浴反应 60 min，分别
于各管加入 pH7． 0，0． 067 mol·L －1磷酸盐缓冲液
1． 6 mL及 50%尿素 0． 2 mL，35℃反应 15 min，加
0． 1 mol·L －1 HCl 0． 5 mL终止反应后，加 2 mL苯酚
钠溶液和 1． 5 mL NaOCl 溶液，35℃反应 30 min。
630 nm 处比色测定 OD 值。以处理 pH 为横坐标，
OD630为纵坐标，绘制 pH稳定曲线。
2 结果与分析
2． 1 脲酶的分离纯化
刀豆、黑豆脲酶粗酶液经过石油醚脱脂、冷丙
酮沉淀、饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐过夜、DE-
52 阴离子交换层析等步骤的分离纯化，收集获得纯
化后酶活峰。从图 1、图 2 中可以看出，相较刀豆脲
酶的纯化而言，黑豆的 DE-52 纯化存在出峰早、杂
峰较大的情况，这可能与二者的蛋白质含量与种类
存在差异有关。
图 1 刀豆脲酶在 DE-52 纤维素柱上层析图谱
Fig． 1 Chromatography of sword
bean urease on DE-52
图 2 黑豆脲酶在 DE-52 纤维素柱上层析图谱
Fig． 2 Chromatography of black
soybea urease on DE-52
3 期 张宽朝等:刀豆、黑豆脲酶的分离与基本性质研究 363
将每一步纯化得到的蛋白质样品进行蛋白质
含量与酶活的测定，计算每一步的比活力、回收率
和纯化倍数(表 1)。
经各步骤纯化后，刀豆脲酶的回收率为 5． 35%，
纯化倍数为 3． 851;黑豆脲酶的回收率为 11． 27%，
纯化倍数为 3． 36。在整个纯化过程中，刀豆脲酶比
活力高于黑豆，但最终回收率低于黑豆。
表 1 刀豆与黑豆脲酶的纯化
Table 1 Purification of ureases from sword bean and black soybean
试验步骤
Experimental steps
刀豆 Sword bean 黑豆 Black soybean
总活力
Total
activity
/U
总蛋白
Total
protein
/mg
比活力
Specific
activity
纯化倍数
Purification
multiple
回收率
Recovery
/%
总活力
Total
activity
/U
总蛋白
Total
protein
/mg
比活力
Specific
activity
纯化倍数
Purification
multiple
回收率
Recovery
/%
脱脂粗提液 5357． 80 378． 34 14． 16 1． 000 100． 00 370． 80 53． 96 6． 87 1． 00 100． 00
Degrease crude extract
冷丙酮沉淀 4640． 00 212． 01 21． 70 1． 532 86． 04 121． 04 14． 73 8． 22 1． 20 32． 64
Precipitation with cold acetone
硫酸铵分级沉淀 1661． 55 43． 40 38． 28 2． 703 31． 01 99． 85 5． 04 19． 81 2． 88 26． 93
Ammonium sulfate precipitation
DE-52 纤维素层析 286． 80 5． 26 54． 54 3． 851 5． 35 41． 8 1． 81 23． 09 3． 36 11． 27
Chromatographyon DE-52
2． 2 反应进程曲线
脲酶催化尿素生成氨和二氧化碳或碳酸铵，黑
豆脲酶在 15 min以内、刀豆脲酶在 20 min 以内时，
反应产物与反应时间基本成线性关系，曲线斜率几
乎不变(图 3)。因此，后续测定脲酶的酶活性时，反
应时间统一选择在 15 min 以内为基准。随着时间
的延长，反应速率逐渐降低。这可能是因为底物尿
素的逐渐减少，或是产物氨、二氧化碳或碳酸铵生
成量的逐渐积累，减缓了酶促反应的进行，也可能
是因为反应时间延长而引起酶本身部分分子的
失活。
图 3 脲酶的反应进程曲线
Fig． 3 The chart of urease reaction
2． 3 米氏常数 Km
根据试验结果，用 Lineweaver-Burk 双倒数法作
图，所得结果见图 4，Km即为直线在 X负轴上截距的
负倒数。根据计算可得，刀豆脲酶 Km为 1． 3 × 10
－2
mol·L －1，黑豆脲酶 Km为 2． 4 × 10
－3 mol·L －1。可以
看出，黑豆脲酶比刀豆脲酶与尿素的亲合力大。
图 4 脲酶双倒数作图
Fig． 4 The kinetics of urease in
Lineweaver-Burk double reciprocal plots
2． 4 pH对酶活的影响
由图 5 可以看出，刀豆和黑豆的脲酶活性均随
pH的增加呈先增加后降低的趋势，并分别在 pH7． 0
和 pH6． 0 时达到活性峰值。刀豆脲酶的最适 pH处
于近中性范围内，而黑豆脲酶的最适 pH 处于酸性
范围。
图 5 脲酶的最适 pH
Fig． 5 The optimum pH of urease
2． 5 脲酶酸碱稳定性
将脲酶在不同 pH缓冲液中于 35℃保温 1 h，再
将 pH调回 7． 0 左右，按照酶活测定体系反应测定
364 大 豆 科 学 3 期
酶活，制作酸碱稳定性曲线，发现刀豆脲酶在 pH
6． 0 ～ 7． 0 有较高的稳定性，而黑豆脲酶在 pH5． 0 ～
8． 0 均有较高的稳定性(图 6)。
图 6 脲酶的酸碱稳定性曲线
Fig． 6 The pH stability of urease
3 结论与讨论
酶的分离纯化是酶学性质研究的基础，而酶的
分离纯化常以总活力的回收或比活力提高的倍数
两个指标来判断分离提纯方法的优劣。本试验采
用石油醚脱脂、冷丙酮沉淀、饱和硫酸铵分级沉淀、
透析脱盐过夜、DE-52 阴离子交换层析等步骤分别
对刀豆和黑豆中的脲酶进行了分离纯化，结果表
明，经以上步骤纯化后，刀豆脲酶的回收率为
5． 35%，纯化倍数为 3． 851;黑豆脲酶的回收率为
11． 27%，纯化倍数为 3． 36。在整个纯化过程中，刀
豆脲酶比活力高于黑豆，但最终的回收率低于黑
豆。因此，应进一步研究刀豆与黑豆脲酶提取纯化
过程中的酶活差异和回收率差异适应性，探讨黑豆
取代或部分取代刀豆作为商品化脲酶产品来源的
可能性，减少对进口脲酶的依赖度。
Km是酶的一个特性常数，受底物浓度、反应温
度、pH及离子强度的影响。试验用 Lineweaver-Burk
双倒数法作图，得出黑豆脲酶的 Km为 2． 4 × 10
－3
mol·L －1，与周东凯等［4］和崔有宏等［5］研究黄豆脲
酶 Km的结果基本接近。
最适 pH是酶的特性之一，但酶的最适 pH不是
一个常数，受底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等
许多因素的影响［1］。周东凯等研究表明，大豆脲酶
的最适合 pH为 7． 0［4］;崔有宏等研究大豆脲酶最适
pH时发现，在 EDTA-Na2-K2 HPO4缓冲液中大豆脲
酶最适 pH为 6． 00，在磷酸盐缓冲液中为 7． 00，在
Tris-琥珀酸缓冲液中为 6． 50［5］。本试验结果表明，
在 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系中，刀豆与黑豆脲酶
的最适 pH与大豆较为接近，刀豆脲酶的最适 pH为
7． 0，处于近中性范围内;而黑豆脲酶的最适 pH 为
6． 0，略偏酸性。但刀豆与黑豆酸碱稳定性差异较
大，刀豆脲酶在 pH6． 0 ～ 7． 0 有较高的稳定性，而黑
豆脲酶在 pH5． 0 ～ 8． 0 均有较高的稳定性，这可能
与其起源和环境适应性有关。
参考文献
［1］ 王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学［M］． 3 版． 北京:高等教育
出版社，2002:321． (Wang J Y，Zhu S G，Xu C F． Biochemistry
［M］． Third ed． Beijing:Higher Education Press，2002:321．)
［2］ 罗侃，崔有宏，王绪民，等．黄豆脲酶波氏法尿素测定试剂盒的
研制与开发［J］．甘肃科学学报，2000，12(3) :56-60． (Luo K，
Cui Y H，Wang X M，et al． Development and application of kit for
determination of urea by using soy bean urease-berthelot method
［J］． Journal of Gansu Science，2000，12(3) :56-60．)
［3］ 彭虹旎，刘晨光，刘成圣，等．脲酶固定化的研究及应用［J］．海
洋科学，2003，27(6) :38-41．(Peng H N，Liu C G，Liu C S，et al．
Studies on the immobilized urease［J］． Marine Science，2003，27
(6) :38-41．)
［4］ 周东凯，刘莹，马学良，等．大豆脲酶的提取及其影响因素研究
［J］．大豆科学，2008，27(4) :704-707．(Zhou D K，Liu Y，Ma X
L，et al． Extracting of urease from soybean and its influencing fac-
tors［J］． Soybean Science，2008，27(4) :704-707．)
［5］ 崔有宏，罗侃，吴育凌，等．黄豆脲酶的提取与性质研究［J］．甘
肃科学学报，2000，1(1) :62-66． (Cui Y H，Luo K，Wu Y L，et
al． Purification and properties of urease from Glycine max［J］． Jour-
nal of Gansu Science，2000，1(1) :62-66．)
［6］ 杨建雄．生物化学与分子生物学实验技术教程［M］． 北京:科
学出版社，2002．(Yang J X． A Course in biochemistry and molec-
ular biology experimental technique ［M］． Beijing:Science
Press，2002．)