全 文 ：上海免疫学杂志 1 9 81年第 l卷第 6期 、 5
刀豆素 A提取的初步研究
郑家驹 *孔祥辛 *棒连生 *林
姜继华 * *皇甫照 * *成苏生 * *
洪家葬 * *杨希衷 * *龚正亮 *
一 内容提要 本文简要报导了从苏州产刀豆子 ( Ca na va lia Gi妞 i a t物理实验 (搪元沉淀反应 ,醋纤薄膜和回盘电泳 , 搪含且与总蛋白测定等 )与生物学实验 (血凝试验与淋转试验等 )
的研究 ,并通过与进口 伪 n 人 对照进行免疫沉淀试验 ,结果表明所知得的 C七n 人 纯度较高 ,具有沉淀糖元 、 凝
集若干种动物的红细饱及较好的促进淋巴细胞转化反应等特性 ,为广泛研究与使用 C o n 人提供了新途径 。
刀豆素A (Oo n c拟玛 v a血 A ,简称C on . A )
系从大刀豆 ( o a an v习坛 e sn 迁 o r也伯 D C ,
俗称 J朗 k b她 ) 中提取出来的一种植物血球凝集素 。 它与 P H A (菜豆植物血球凝集
素 )及 r W M (商陆促有丝分裂素 ) 等一样 ,
均是强力的非特异性有丝分裂促进剂 , 能促
耸淋巴细胞发生转化反应 。 近年来 , 进一步
证明了 C-oD A 能选择性地激活抑制性 T 细胞 ( T 。 ) , 从而对调节体液及细胞免疫反应以
及维护正常的免疫自稳机制具有重 要 作用。
因此 o .on A 被广泛应用于测定淋巴细胞 功
能的研究中 。
由于 C呱 A 还能与某些多糖 (包括细胞膜表面糖蛋白或枷旨受体 )发生特异性结合 ,
因此 O呱 A 作为研究多糖结构的工 具 , 或
作为研究哺乳动物细胞膜结构的灵 敏手段 ,
亦被广泛地应用于各种细胞生物学基本过程
的分析研究中1[ , , 」 ,
我院自 1 9 7 9 年开始从大刀豆的 同属 植
物刀豆子 ( C a D a v a血 g h id a at D C ) 中
提取 C叨 . A ,兹报导实验结果如下 。
量 , 以 T r 岌卜H CI 缓冲液浸出 , 滤液经 皂 土
吸附 , 并经 S eP ha dxe G一10 。 柱层析提纯 , 最
后透析 , 低压冻干备用 。
二 、 P R人 广 州 医 工 所 出 品 , 批 号
7 8 0 72 1
。
三 、 商 陆 提 取 物 : 参 照 助 rj eso “ 方
法〔 , , , 取新鲜曳国商 陆 (p h y ot 坛 c` “ c~F泊叉 b 秋季收获今去皮 , 捣细 , 磷酸缓冲液浸
出。 取滤液加很 , 离心 , 脱水及低压冻干备
用。
材 料
一 、 C呱 A
(一 ) 植物来源 : 苏州产刀豆精 选后 剥
壳 , 研粉备用 。
(二 ) 提取方法 : 参 照 刃d m u刀 dso n 及
N ak
a 刃n u魏 方法 , 略加修改 a[, 们 , 取刀豆粉适
化 学 实 验
一 、 免疫沉淀试验 : 取上述提取的 CO几
A 与兔抗 C o] 工 人 抗血清 (由上海二军大 微
生物教研组提供 ) 进行琼脂双相免疫扩散试
验 , 结果显示一条清晰的沉淀线。 并以进口
Cb .n A (日jg功a Che 刀五c aJ C6m孙叮 扰号
1 5 1 9 ) 作为标准对照及生理盐水作为阴性对
照 。其结果如图 1 所示 :
二 、 糖元反应 : 按 s u址 n e r 等方 法.1L ,
取 C沁n . A 蒸馏水溶液 ( p R .6 5) 1毫升 (3 . 2毫
克 )加 0 . 1拓肝搪元 (南京药学院实验药厂出
品 , 批号 64 0 621 )溶液 5毫升 , 摇匀 , 立即出现
明显的混浊 , 室温静置 2 小时后渐形成沉淀 。
苏州市第三人民医院内科
苏州市第三人民医院药理实验室
苏州市第三人民医院免疫室
江苏省原子医学研究所
. 6
图 i本室提取 Go n人 与 O o n人 抗血清
免疫沉淀试验
( C
=
Co n人 .口 8二 o o nA抗血清
C
` 二 进 口 Co n人 . N .吕 =生理盐水 )
另取 Co n. A溶 液 , 以 1 / 10 0 , l / 2 0 0 , 1 /
4 0 0
, 1 / 8 0 0, 1 /16 0 等不同稀释度于糖元一
琼脂凝胶上进行扩散 , 结果出现不 同直径 的
沉淀圈 ,如图 2 所示 ,
图 8 ( B )圆盘凝胶电泳
图 2 不同浓度的糖元沉淀反应
( 2一 5二 依次为 121 0 0 ,1/ 仑O0 , 1 /4( 冲 , 18/ o ,
1/ 16 0
,不同浓度 ,万 . 5 二生理盐水 )
三 、 醋纤菠膜及阿盘撅胶电泳 . 僻纤薄
膜电泳显示一条清晰的沉淀带 , 圆盘凝胶电
泳上显示一条主要的及一条次要的沉淀线 ,
如 、图 3 所示 :
四 、 糖含 t 测定 : 按葡萄糖计算糖含量
为 _。 · Qo 3吕% 。
五 、 总蛋白锄 定 ; 取 C沁n . 连配 成 2%
浓度 , 以双缩脉法测定总蛋白含量 , 结果为
图 3 · ( O )圆盘凝胶电泳扫措图 ,波长 60 0 n 坦 .
(日本 刀 . 娜i t rD n 光密度扫描仪 ,M od el 一 P a n )
2
·
05 。克 /分升 。
生 物 学实 验
图 3 (人 )醋纤薄膜电泳
一 血凝试 验 : 参 照 s u~ 方 法 1j[
,
取 1终 C o n . A 液以 1 : 2 , 1 : 4 , 1 : 8 , 1 : 1 6 , 1 : 3 2
直至 1 : 1 3 1 0 7 2 倍比稀释 · ,然后与羊 、 马 、 狗 、
牛 、兔 、猪 、 大白鼠 、小白鼠 、 豚鼠及人 A , B ,
` 人B , 0 型血红细胞作直接凝集试验 , 并以生
理盐水作阴性对照 , 其结果如表 1 所示 : .
: 根据上图结果证明本院所制 、O .on A 与
牛红细抱不发生凝集 , 与 S u m en r 报导柑同。
了表 1 0她右 与不同动拍红细胞的凝集反应 (皿 c B二红细胞 ,
.N s 二 生理盐水 , 叹+ 刀 ” 阳性 , “ 一 刀 二阴性 , t’/ 刀 = 未测 )
甘` .价匡巴!兰 1 28 5招 16 2 4 12 0 4 8 14〔哈6 18 1 92 1 6 3 8 4 1 3 2 7 6 8 6 5 5 3 6 !1 3 1盯2 N . S
羊
卜 马
狗
牛
津
猪
大白鼠
小白鼠
琢鼠
人:
A 型
·
B 型
么丑 型
O 型
斗 + + l + + + L + + + l + + 十 l+ + + + + + + +
2 5 6
叫叫` 一
呼今 + + + + + + + 十 + ,
巨,
.产了口诊了产J万了矛了J户了.夕户尹/了声才` 尹J产矛矛矛.了口出` }{ 1:+工+++++
+++ + + I
·斗咔 + , + + 利 + + + l + + + + + + 斗+ + 1 4 . + +
+ + +
+ +
+ + + + +
+ + 十 l + + + 口 + 十 + 1 + + 十 I 十 + 十 + + + 十 + + 1 + + + + + + +
+ + 十十 + + + 千 . + + + + + + + + + + + + 十
+ +
+十+十
+ +
+
十
峨科+十+
+++十+十
+ 平
斗
子斗
+ + +
+ + + I + + + . 十 十 十十 + 十
今
+ +
料+
+甲+ + + l + + + I 十 + + I 十 + 十 + + + 十 + + + + + 1 + + + + + 铸 + + + +
++
:
+.+ + + . 件 + + 1 冲 + +J + 十于 + + + + + + + + 十
+ + +
+ +
. 诗+
+ 十 + I 千 + + . 掩+
全 + +
+ 十+ + 冷+ + + + + 币于 . + + +
+ +
咋 +
+ + + I + + + + + + + + + + + + . + + + : + +
二 、 _ 淋转试验 ( a妇-[ T d R 堆入法及形态一
计教法 ) : 以不同浓 度 COn . A 进 行淋转 试
骏 , 结果表明 4 0一 10 。微克 /毫升的浓度刺激
港转率最佳 , 所得最高淋转率分别 为 2 8 0 1 1
c p功 及 37 终 。 为了了解 C呱 A 刺激淋转的
最适高峰时间 ,进行了不同时间的培养 , 给果
表明以 3一5天为高峰 , 一 7 天后淋转率明显 下
降 。 部分实验以进口 C缸血 .-人 , 尸R A 及商陆
粗提物进行了对照 , 结果见表 2十 4 `及图 `4 。
表 2
4 0
不同浓度下 伪对. 压 的淋转结果 ( H S T城R 掺入法 )
浓度微克 /管番
e p m (例次 )
X 土 S D
2的
2 4 7 3 0 ( 5 )
士 86 邪
- 竺一一阵粤-昭 0 1 1` 5 ) } 1542 3仁1 5 )
士 7肠 ! 土 49
16 0
,
9 7阳侈 )
士 590 4
6浙 6 (功 )
士 4 14 9
番 每管含 2 毫升培养液。
表 3 不同浓度下 伪 . . 五 的淋转结果 (形态计教法 )
浓度微克 /管 , 4O 8 O 1 2 0 180 2 o 空白
转化率 (男 ) 19 。石 24 毖 留 19 5
番 每管含 2 毫升培养液。
表 4 伪血. A , r H A . 商陆提取物的淋转结果 (形态计数法 )
oC n A
(助微克 /毫升 ) I
’
: 进 口 碗 n *
}` 里进奎二查竺-
} 4 1
·
6
P H人
( 1即 微克 /毫升 ) 商陆提取物( 20 微克 /毫升 )
转化率 (男 ) 3 7 份 24
弓们 110 1
ùó魂
/
一 “ 、 ’ 、 “ 一“ 、 、 、
ù n U臼品臼 32 .t
. 1天
图 4 o Cn人 刺滋淋转的高峰时间
讨 论
一 、 早在本世纪初 , 国外 即 已开始对
C o n
.
A 进行了提取研究 。 有关它 的分子 大
小 , 分子 t 及等电点等均有 较多报导 。 据
A g ar w al 氏用自由界面电泳法侧得的等电点
为 7 . 1 土 。 · l .t h S u 刃n n旧 r 氏报告 C沁几 A 的
沉降系数为 6 · 0 8 , 分子 t 为 , 6 , o o o c , 〕。 又
据 X 线衍射研究证明 , C沁.n A 结晶是由四个
分子 t 各为 25 , 0 0 的相同亚单位组成 , 每一
个完整 的 C .on A 亚单位 含 237 个 氮 基酸
(缺乏胧氛酸 ) 。 粗提 的 O。压 A 中可 含 4%
碳水化合物 , 画盘凝胶电泳证明含有一个主
要的活性成分及一个次要的杂蛋白成分 , 但
经芍聚精凝胶提 纯 的 Cb n . A 分 子 中不 含
糖 。 此外 , C沁众 A 分子最值得注意的一个 特
性是能与某些多褚分子 (搪元 、 甘璐聚搪 、 右
旋糖醉 N R R L卜1 3 35 -5 5 , 吠喃果聚糖等 ) 发
生特异性结合 。 我们就本院实验条件 , 进行
了有关理化性质的测定 , 所得资料与国外报
导情况相符。 经 C泊乙 A 抗血清免疫扩散 试
验与进口 oC 几 A 标准品对照完全符合 , 表明
从苏州产刀豆中可 以提取出纯度较高的 C o n
A
, 这为广泛研究与使用 伪 n . A 提供了新的
途径 。
二 、 C O .n A 是一种球状的植物血凝素 ,
S u m n er 报导它在较高的稀释度下 , 即能凝
集边涤过的马 (甚至 1 : 1 0’ 倍稀释 ) 、 狗 、 猫 、
兔 、 豚鼠及大鼠的红细胞 。 但与山羊 , 绵羊及
猪的红细胞很少或不发生凝集 , 与人及牛的
红细胞亦不发生凝集 。 由于各实验室所用的
C沁n . A 制剂不一致 (有的用 C O几 A 四聚体 ,
有的则用二聚体或单体 ) , 以及实验条件不同
均可影响 伪乙 A 凝集红细胞的能力 , 因此 ,
各组报导的血凝结果常不一致 .[ 门 。 本 室侧
得的血凝结果表明不与牛红细胞发生凝 集 。
血凝结果的不一致 , 除了与物种有关外是否
也与动物的不同属类有关 , 有待进一步证实 。
三 、 已经知道 , oC n . A 对机体免疫反应
的影响往往与它本身的剂 t 及 使用 时间有
关 。 多数资料指出 , C呱 A 祠激淋转的最适
浓度为 5 0 徽克 /毫升 .c] 。我们提取的 C勿几 A ,
其淋转最适浓度为 40 一 10 徽克 /毫升与一般
报导情况相似 。 此外 , 刃陌u g城 等实脸证 明
C on
.
A 仅作用于寿命较短的淋 巴 细胞 , 因
此 ,淋转刘徽高峰在 3一 S 天 , 7 天后刺徽作用
已不明显 , P H A 及 P WM 等在 7 天后 ,仍有
较明显的祠激作用 。 利用这些植物血凝素的
不同时间过程 , 可作为列断一些免疫性疾病
时淋巴细胞功能的手段 1r o’ 皿月 。 我们实脸的结
果表明从苏州刀豆中提取出的 oC n . A 刺 徽
高峰为 3一 5 天与上述资料相符 。
, 考 文 献
[ 1 ]
[ 2 ]
[ 3 ]
[ 4 ]
[ 6 ]
[ 6 ]
[ 7 ]
[ 8 ]
[口 ]
[ 1 0 ]
[ 1 1 ]
C h
e w d h u r y
,
T K
: A d y E x P M
e d B i o l
, 岛 : 1 ,
1盯 5
eR
e k G N
e 七 a l : A d 7 E x P M e d B i o l , S : 1 3
.
1盯 5
E d m u n d so n 人B e t a l : B i co h e m i s t r y , 1 0
( 1 9 )
: 决泌 4 , 1价 1
N a k
a m u r a 5 e t 一 l : 人 r e h B i ac h e m B i o P ·
h y .
,
1 11 : 4叩 , 1 96 5
助 j e s o n E : J E x P M e d , 1翻 (5 ) : 助9 , 1 0日6
S u m n e r J 刀 e七目 : J B i o l C h e m , 1 1 5 : 朋 3 , 1 938
S u m n e r J B
e七 a l : J B a e t , 32 ( 2 ) : 2 2 7 , 1 936
A g r ` w 吕1 B B L e t a l : B i co h i m B i o P h y 日 A e t ` ,
147
: 2业 , 1朋7
倪斌 : 压抑性细胞 ,江苏医药 , 1一 2 : 留 , 1盯 ,
章谷生主编 : 细脸免疫研究和临床应用 , P .1 3 , 1盯9
D o u g a l as 5 e t a l
: I m功 u n o l , 1璐 ( 6 ) : ] ! 8 5 ,
19 6 9