全 文 ：文章编号:1000-5404(2003)08-0657-03　 论著
β-内啡肽对大鼠创伤失血性休克后刀豆素 A诱导的脾细胞
IL-2R表达及 IL-2分泌的调节作用
王　军1 ,文爱清2 ,刘良明2　　(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所:1 消化内科;2 第二研究室 , 重庆 400042)
　　提　要:目的　探讨血浆 β-内啡肽(β-endorphin ,β-EP)在创伤失血性休克后以脾细胞 IL-2R表达及 IL-2分泌为代表的
细胞免疫调节中的作用。方法　①采用大鼠创伤失血性休克模型 , 收集休克前 、休克后 0、1、3、6、12 、24 h休克血浆(SP), 并
检测SP中 β-EP水平;②采用体外实验 ,分离并混合 4 只正常大鼠脾细胞 ,分别与 SP、SP+β-EP抗血清体外培养 , 观察 conA
诱导的脾细胞 IL-2 分泌及 IL-2R表达的变化。结果　①休克后即刻血浆 β-EP 水平显著升高(P<0.01), 1 h 达高峰 ,之后
呈下降趋势 , 24 h 趋于休克前水平。 ②与对照组相比 , SP 可显著降低 conA诱导的脾细胞功能(P <0.01), SP 中 β-EP含量
与脾细胞 IL-2 分泌及 IL-2R表达呈显著负相关(P<0.01);SP经 β-EP 抗血清处理组较未处理组相比 ,脾细胞功能明显升
高(P<0.05), 但仍低于对照组。结论　创伤失血性休克后血浆中显著升高的 β-EP参与了机体的免疫抑制。
　　关键词:β-内啡肽;创伤;失血性休克;免疫;大鼠
　　中图法分类号:R392.11;R605.971;R641.02　 文献标识码:A
Role of β-endorphin in the regulation of ConA-induced IL-2R expression and IL-2 pro-
duction in rat splenic cells following traumatic hemorrhagic shock
WANG Jun , WEN Ai-qing , LIU Liang-ming (Department of Gastroenterology , Daping Hospital , Third Military Medical Universtiy ,
Chongqing 400042 , China)
　　Abstract:Objective　To investigate the role of plasma β-endorphin(β-EP)in the regulation of cellular immu-
nity , mainly IL-2R expression and IL-2 production in rat splenic cells , following traumatic hemorrhagic shock(T-
HS).Methods　①Wistar rats with T-HS were used and sacrificed at 0 , 1 , 3 , 6 , 12 and 24 h after T-HS.Plasma
specimens were collected and β-EP levels in plasma were detected.Rats with sham-operation were served as the con-
trols.②Models of in vitro experiment were used.Spenic cells were isolated and mixed from four normal rats and
cocultured with shock plasma or shock plasma+β-EP antiserum.ConA-induced splenic cell IL-2 production and IL-
2R expression were observed.Results　①Level of plasma β-EP increased remarkably after T-HS immediately ,
peaked at 1 h , showed decreasing tendency and restored to pre-shock level 24 h after T-HS.②Shock plasma signifi-
cantly suppressed ConA-induced splenic cell function;Levels of plasma β-EP were negatively correlated with IL-2
production and IL-2R expression in spenic cells;Compared with that in SP group , splenic cell function elevated
markedly in SP+β-EP antiserum group , but was still lower than that in controls.Conclusion　The increased plasma
β-EP following T-HS is involved in the suppression of cellular immunity.
　　Key words:β-endorphin;trauma;hemorrhagic shock;immunity;rats
　　创伤失血性休克后免疫抑制机制的研究深受人们
的关注。研究已证实创伤后免疫功能低下以 T细胞免
疫功能紊乱为主 ,表现为 Th1细胞增殖功能降低 ,表达
IL-2R下降及分泌 IL-2等细胞因子分泌减少。另一方
面研究发现休克等应激时中枢释放及外周合成 β-内
　　基金项目:全军“九五”指令性课题(96L041)
　　作者简介:王　军(1973-),男 ,河南省信阳市人 ,硕士研究生 ,医师 ,主要从
事神经免疫方面的研究。电话:(023)68757342
　　收稿日期:2002-09-25;修回日期:2003-01-08
啡肽(β-endorphin ,β-EP)增加 ,使外周血中 β-EP 含量明
显升高 。β-EP 具有广泛的双向免疫调节作用[ 1 , 2] ,然
而创伤后升高的 β-EP 是否参与其免疫抑制 ,以及参与
免疫抑制中的地位如何 ,目前仍缺乏其直接证据。本
研究采用体外实验的方法 ,以脾细胞为靶细胞 ,并对此
进行了初步探讨 。
1　材料与方法
1.1　主要试剂
　　β-EP放免试剂盒 、β-EP抗血清(1∶30 000)(第二军医大学基
657
第 25 卷第 8期
2003 年4 月 　　　　
第　三　军　医　大　学　学　报
ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAE　　　　
Vol.25 , No.8
Apr.2003
DOI :10.16016/j.1000-5404.2003.08.003
础医学部神经生物学教研室), 抑肽酶 aprotinin(Sagon , 上海),
RPMI-1640培养液(Hyclon , 美国), 小牛血清(Hyclon , 美国), co-
nA(Boehringer Mannheim , 德国), MTT(Sigma , 美国), 小鼠抗大鼠
CD25 抗体和 FITC-多克隆抗小鼠 IgG(进口分装 , 深圳晶美公
司), IL-2标准品(第三军医大学免疫学教研室)。
1.2　创伤失血性休克模型的建立
　　健康Wistar 大鼠84 只 ,体质量(245±28)g ,雌雄不拘(由第
三军医大学野战外科研究所提供),随机分为休克前及休克后
0 、1、3 、6、12、24 h 共 7 组 , 每组 12 只。戊巴比妥钠 30 mg kg 腹
腔麻醉 ,股动脉放血至血压 40 mmHg维持 1 h 后复苏 , 回输失血
及2 倍林格液 ,加右股骨中段粉碎性骨折制成创伤失血性休克
模型 , 实验动物按 500 U kg 全身血肝素化。对照组为假手术
组 ,即动物仅插管不放血且无创伤骨折。
1.3　血浆标本的收集
　　于创伤失血性休克模型完成后不同时相点分别股动脉放
血处死 , 取 3 ml 血置于含抑肽酶(Aprotinin)50 U ml的管内 ,
4 ℃、4 000 r min 离心 10 min ,分离血浆 500 μl立即置于-20 ℃
保存 ,用于测定血浆 β-EP含量。剩余血浆-20 ℃保存 ,用于细
胞培养。
1.4　体外实验
　　无菌分离 4 只Wistar 大鼠脾细胞 , 混合后 , 用含 10%小牛
血清 1640培养基中培养。 在此基础上加各种处理因素。检测
指标:脾细胞增殖 、IL-2及 IL-2R。
1.5　指标测定方法
　　血浆 β-EP含量测定:按试剂盒说明进行 , 结果以三复管平
均值表示;IL-2 活性测定:采用 CTLL2 细胞株依赖法;IL-2R 测
定:间接免疫荧光法 , 上流式细胞仪测定 5 000 个细胞 , 计算阳
性细胞率(%)。
1.6　实验分组及方法
　　实验分为:休克血浆组(SP)和 β-内啡肽抗血清治疗组(SP
+β-EP anti-serum , SPAS), 并同时设基础对照组(BL)、SP +IgG
对照组(SPIG)、β-EP 抗血清自身对照组(AS)。方法:SP组:取不
同时相点的 SP(终浓度为 10%)分别加入到正常脾细胞培养
中;SPAS组:SP与 β-EP抗血清(1∶300)按 2∶1 比例 4 ℃冰浴 2 h
后加入到正常脾细胞培养中。 以不加任何处理因素的正常脾
细胞培养为 BL组 , SPIG组及 AS组的加样方式同SPAS 组 , 每组
6 孔。
1.7　统计学处理
　　实验数据以 x ±s表示 , 采用 SPSS 10.0 软件 , 分别用单因
素方差分析 、多因素方差分析 、相关分析等方法进行统计学处
理。
2　结果
2.1　大鼠创伤失血性SP 中 β-EP 含量变化
　　创伤失血性休克后即刻(0 h)血浆β-内啡肽较休克前显著
升高(P<0.05), 伤后 1 h 达到最高水平(P <0.01), 随后呈下
降趋势 ,但在休克后 6 h 仍非常显著高于对照组(P <0.01), 这
与国内外报道基本一致[ 3 , 4] 。休克后 12 h 虽高于休克前 , 但无
统计学意义(P>0.05), 见表 1。
表 1　大鼠创伤失血性休克后血浆 β-EP含量的变化( x±s , n=10)
Tab 1　Changes of plasma β-EP following traumatic hemorrhagic
shock in rats( x±s , n=10)
Group β-EP(pg ml)
Contro l 96.7±28.6
Post T-HS
0 h 152.7±26.4＊
1 h 418.2±113.9＊＊
3 h 252.2±82.4＊＊
6 h 181.5±65.9＊＊
12 h 136.9±34.7
24 h 109.4±23.8
T-HS:Trauma hemorrhagic-shock ＊:P<0.05;＊＊:P<0.01 vs control
2.2　SP 对正常大鼠脾细胞免疫功能的影响
　　由于休克即刻(0 h)至休克后 6 h 血浆 β-EP水平显著高于
休克前 , 所以取休克 0、1、3、6 h SP(10%)分别与正常大鼠脾细
胞培养。结果发现 SP 非常显著地抑制 ConA诱导的 IL-2 分泌
及 IL-2R表达(P<0.01);休克 1 h 血浆抑制效果最明显(P <
0.01),见表2。 SP中 β-EP含量与 IL-2分泌及 IL-2R表达呈负相
关(P<0.01), 相关系数 r分别为-0.57、-0.62;可决系数 R2
分别为 0.32 , 0.4 ,均小于 0.5。
表 2　休克血浆对正常大鼠脾细胞 IL-2分泌、IL-2R表达的影响( x±s , n=6)
Tab 2　Effects of plasma from shocked rats on conA-induced IL-2
production and IL-2R expression in normal splenic cells
( x±s , n=6)
Group IL-2(U ml) IL-2R(Positive rate , %)
BL 9.56±0.81 78.16±9.42
Contro l 9.71±1.45 81.65±9.46
SP0 5.78±0.54＊＊ 53.95±5.78＊＊
SP1 4.63±0.61＊＊ 36.03±5.61＊＊
SP3 4.71±0.61＊＊ 37.54±2.68＊＊
SP6 6.40±0.79＊＊ 49.49±5.16＊＊
SP0, SP1, SP3 , SP6:Plasma from shock 0 , 1, 3, 6 h group respectively;
Control:Normal plasma group;BL:Baseline group;＊＊:P<0.01 vs control
2.3　体外 β-EP 抗血清对 SP 处理脾细胞免疫功能的
影响
　　由于休克1 h血浆抑制效果最明显 , 以下实验均采用休克
1 h 血浆。结果发现 ,与 SP组相比 , SPAS 组 , 脾细胞 IL-2 的分泌
及 IL-2R的表达显著升高(P <0.05),但仍然非常显著低于 BL
组(P<0.01)。AS 组与 BL组 、SPIG 组与 SP 组间相比 , 脾细胞
IL-2的分泌及 IL-2R的表达无显著差异。见表 3。
表 3　β-EP抗血清对休克血清处理的正常大鼠脾细胞 IL-2分泌 、
IL-2R 表达的影响( x±s , n=6)
Tab 3　Effects of β-EP anti-serum on conA-induced IL-2 production
and IL-2R expression in cultured normal splenic cell treated
with plasma from shocked rat( x±s , n=6)
Group IL-2(U ml) IL-2R(Positive rate , %)
BL 9.56±0.89 78.16±9.42
SP 4.63±0.61 36.03±5.61
SPAS 5.80±0.59＊■ 48.25±6.35＊■
AS 9.71±0.10 79.16±9.42
SPIG 4.65±0.51 37.13±5.06
SP:Shock 1 h plasma group;SPAS:SP1+β-EP antiserum group;AS:β-
EP antiserum self-control group;SPIG:SP1+IgG group;＊:P<0.01
vs SP group;■:P<0.01 vs BL
658　　　　　　　　　　　　　　　　　第　三　军　医　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 25卷
3　讨论
　　自 β-EP 被发现以来的 20多年中 ,人们发现 β-EP
及其受体不仅在神经系统中起镇痛作用 ,还对免疫系
统内发挥重要的双向免疫调理功能[ 1 , 2] 。许多研究者
利用其免疫调节功能为许多疾病 ,如自身免疫疾病等
提供了新的治疗靶点[ 5] 。创伤失血性休克后免疫抑制
机制的研究深受人们的关注。动物研究及人体观察表
明 ,创伤 、休克等应激使机体免疫受抑 ,尤其以细胞免
疫抑制明显。而免疫系统的自稳除免疫细胞和体液因
子的相互作用和调节外 ,还依赖于神经内分泌免疫网
络的平衡 。内阿片肽(主要是 β-EP)作为“神经调质” ,
对机体神经内分泌免疫网络有重要的调节功能。创
伤 、外科手术 、休克 、情绪改变等应激条件下 ,内阿片系
统被激活 ,导致垂体及免疫细胞合成和释放 β-EP 增
加 ,从而血浆 β-EP 明显增加[ 1, 4] 。关于血浆中显著升
高的 β-EP在创伤失血性休克后免疫抑制中发挥怎样
的作用 ,以往的研究仅证明创伤失血性休克后血浆 β-
EP 显著升高 ,同时免疫功能降低 ,二者呈负相关[ 3, 6] ,
从而推出 β-EP可能参与创伤失血性休克后免疫抑制 ,
但目前仍缺乏直接证据。
　　本研究利用大鼠创伤失血性休克为模型 ,观察到
创伤失血性休克后 0 ～ 6 h血浆 β-EP 明显增加 ,1 h达
最高峰 ,24 h趋于休克前水平 , 与 Levy 等[ 3] 和 Nerlich
等[ 4] 报道基本一致。休克后 0 ～ 6 h 血浆非常显著地
抑制正常大鼠脾细胞对丝裂原刺激后 IL-2的分泌及
IL-2R的表达 ,其中休克后 1 h血浆抑制效果最明显 ,
且SP 中 β-EP 含量与脾细胞 IL-2分泌及 IL-2R表达呈
显著负相关(P<0.01),表明血浆中 β-EP 可能参与抑
制大鼠脾细胞对 conA 的反应性 。但是这还不能排除
血浆中其它免疫抑制因子如 PGE2 、儿茶酚胺 、糖皮质
激素 、血清免疫抑制因子等的影响[ 4, 7] 。为此 ,本实验
设计了 SP+β-EP 抗血清组 ,即 SP 预先经抗血清处理
(4 ℃冰育 2 h)后 ,与大鼠正常脾细胞共同培养 ,与未
经 β-EP 抗血清处理的 SP 组的脾细胞功能相比较 ,发
现脾细胞 IL-2的分泌及 IL-2R的表达明显回升。β-EP
抗血清自身对照组与基础对照组 、SPIG组与 SP 组相
比 ,结果相差不显著 ,表明 β-EP 抗血清对脾细胞功能
并无任何作用 ,是由于 β-EP 抗血清特异地中和了 SP
中的 β-EP ,导致 SPAS组脾细胞功能升高 ,结果直接说
明了 β-EP参与创伤失血性休克的免疫抑制。
　　另一方面 , SP 中 β-EP 水平与脾细胞 IL-2的分泌
及 IL-2R表达的相关系数 r 均小于 0.65 ,可决系数 R 2
均小于0.5 ,以及经 β-EP 抗血清处理后的SP 组的脾细
胞功能仍然低于对照组 ,这些结果说明了参与创伤失
血性休克后免疫抑制的因素是复杂和多方面的。除了
β-EP 外可能还有其他内阿片肽 、神经体液因子 、炎症
介质和细胞因子等参与了其过程和环节 。
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(编辑　郭建秀)
　　(上接 656页)
发展于 20世纪 50年代 ,其方法是将体温降至 20 ℃以下 , 停止血
液供应 ,进行心脏血管手术。 1960 年Wood Hall首先报道将此项
技术成功应用于神经外科手术当中。深低温停循环方法采用体
表降温合并体外循环法处理血管性疾病[ 2] 。当体温降至 20 ～
18 ℃时循环停止 , 从而停止全身血液供应。采用停止循环可以
使动脉瘤缩小乃至塌陷 , 从而清楚地辨别动脉瘤与载瘤动脉以
及周围结构关系 , 在无动脉瘤破裂的情况下进行动脉瘤分离和
夹闭 , 从而减少术中出血 , 降低了手术风险 , 同时低温也有脑保
护作用 ,能提高脑组织对局部缺血的耐受程度。有报道深低温
脑循环停止 60 min ,脑组织无明显损害 ,如果停循环超过 90 min ,
则会造成明显不可逆性脑损害[ 3] 。并且深低温也有一些并发
症, 如延迟苏醒 、体温不稳、增加血液粘稠度、血栓形成或全身肝
素化后的脑表面广泛渗血等。因而并发症的预防和处理以及体
外循环下的脑保护等仍是术中及术后重点关注的问题。
　　总之 ,深低温停循环是处理复杂动脉瘤非常有用的措施之
一 ,尤其适宜于青壮年其它脏器功能良好的巨大动脉瘤患者。
随着对深低温和循环停顿病理生理改变认识的提高 , 必将提高
复杂动脉瘤的疗效。
　　关键词:深低温;体外循环;动脉瘤
　　中图法分类号:R730.56;R732.21　　　文献标识码:B
参考文献:
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(编辑　张大春)
659第 8 期　　王　军 ,等.β-内啡肽对大鼠创伤失血性休克后刀豆素 A诱导的脾细胞 IL-2R表达及 IL-2 分泌的调节作用