全 文 ：浙江中西医结合杂志2014年第24卷第10期 ZhejiangJITCWM（Vol.24No.102014）
刀豆素 A诱导人乳腺癌细胞自噬性死亡及其机制
陈弘磊 姜 凯 浙江省立同德医院检验科 杭州 310012
摘 要 目的 探讨刀豆素 A对人乳腺癌细胞 MCF-7的杀伤作用及其机制。方法 采用 MTT法
检测不同浓度 ConA（concanavalin A）处理 MCF-7细胞后，MCF-7细胞的增殖情况，并检测自噬标
记蛋白 LC-3Ⅱ，加入自噬特异性抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）后再检测 MCF-7细胞对 ConA的敏
感性。利用基因沉默技术，抑制 BNIP3的表达，再检测 ConA处理后 MCF-7细胞的增殖和自体吞
噬。结果 ConA可显著抑制 MCF-7细胞的增殖（P<0.01），并诱导其发生自噬性死亡。ConA处理后
MCF-7细胞的 BNIP3显著增高（P<0.05，P<0.01），利用小 RNA抑制 BNIP3的表达后，ConA对MCF-
7的增殖抑制作用降低（P<0.01），并抑制了 ConA诱导的自体吞噬效应。结论 刀豆素 A通过上调
BNIP3的表达诱导人乳腺癌细胞发生自噬性死亡。
关键词 刀豆素 A；MCF-7；自体吞噬；BNIP3
Effect of Concanavalin A Induced Autophagic Cell Death in Breast Cancer Cells and the Mechanism CHEN
Honglei，JIANG Kai. Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou(310012), China
ABSTRACT Objective To investigate the effect of concanavalin A on proliferation of MCF-7 cells and the un－
derlying mechanism. Methods MCF-7 cells were treated with different concentrations of concanavalin A and then
the proliferation of MCF-7 was detected by MTT method and LC-3II was labeled. 3-MA was added to detect the
sensitivity of MCF-7 cells to concanavalin A. After silencing the expression of BNIP3 with small RNA，the prolifer－
ation and autophagy of MCF-7 cells treated with concanavalin A were detected. Results Concanavalin A signifi
cantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells（P<0.01） and induced autophagic cell death. The expression of
BNIP3 significantly increased in MCF-7 cells when treated with ConA（P<0.05，P<0.01）. After silencing BNIP3 with
small RNA，the effect of inhibition and autophagy of concanavalin A decreased in MCF-7 cells. Conclusion Con－
canavalin A can induce autophagic cell death of MCF-7 cells via upregulating the expression of BNIP3.
KEY WORDS concanavalin A；MCF-7；autophagy；BNIP3
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，其发
生率和死亡率仅次于肺癌。手术、化疗、放疗等手段
虽然可以使患者获得较高的生存率，但长期化疗副
反应多，且易产生耐药性。刀豆素 A（concanavalin A，
Con A）是从刀豆（Jack bean）中提取出来的凝集素。
它是四聚体球蛋白，分子量 102，000。每个亚基含
237个氨基酸残基，分子量 25，500，结合一个 Ca2+和
一个 Mn2+，含一个糖结合部位。能与 α-甘露糖、α-葡
萄糖（细胞膜糖蛋白上）专一地结合[1]。它是一种经典
的 T细胞丝裂原，能激活淋巴细胞并浸润至肿瘤组
织，杀死肿瘤细胞，且能直接诱导肿瘤细胞死亡[2-3]。
自噬性死亡是近年来发现的不同于凋亡的Ⅱ型程序
性死亡，以出现过量的自噬小体为主要特征，当自噬
形成时，胞浆型 LC3（LC3-I）会酶解掉一小段多肽，
转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），因此，LC3-II的蛋
白表达量可估计自噬水平的高低。自体吞噬可以被
3-甲基腺嘌呤所抑制[4]。Bcl2/腺病毒 E1B相互作用蛋
白 3（Bcl-2/adenocar -cinoma E1B19KD interacting
protein 3，BNIP3）是包含单 BH3区的促凋亡成员，
属于 BH3-only亚家族，研究表明 BNIP3在细胞死亡
的传导途径中有十分重要的作用，当 BNIP3表达显
著增加时，细胞将发生过度的自体吞噬并进入自噬
性死亡 [5-6]。本实验研究刀豆素 A 对人乳腺肿瘤细
胞MCF-7的杀伤作用，并探讨其杀伤肿瘤细胞的机
制是否通过表达 BNIP3，引起肿瘤细胞发生自噬性
死亡。
注：本文第一作者系浙江中医药大学在职研究生
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浙江中西医结合杂志2014年第24卷第10期 ZhejiangJITCWM（Vol.24No.102014）
1 材料与方法
1.1 细胞来源 乳腺癌细胞株 MCF-7 来自于
ATCC，由浙江大学医学院提供。细胞培养于含有
10%胎牛血清的 RPIM-1640培养基。
1.2 实验试剂 RPIM-1640 培养基购于 Gibco 公
司；胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程有限公
司；刀豆素 A（concanavalin A，ConA）、噻唑蓝（MTT）、
3-甲基腺嘌呤、LC3-Ⅱ多克隆抗体购于美国 Sigma
公司；细胞裂解液、β-actin单抗和 BNIP3多克隆抗
体购自美国 Cell signal公司；PVDF膜购于 Millipore
（USA）；转染试剂 Lipofectamine 2000 购自美国 In－
vitrogen公司；BNIP3 siRNA及无关对照 siRNA定制
于上海吉玛公司；BNIP3的 siRNA序列为：正向：5’-
CACGAGCGUCAUGAAGAAAUU-3’，反向：5’-UU－
UCUUCAUGACGCUCGUGUU-3’。
1.3 MTT法检测 ConA对MCF-7细胞抑制作用 将
MCF-7 细胞按 1×104/孔接种于 96 孔板， 加入
200μL含 10%FBS的 RPIM-1640培养，设置 3个复
孔，并分别加入 0（用磷酸缓冲液 PBS代替）、10、20、
40μg/mL的 ConA培养 24h。另设一组加入 3mM的
3-MA培养 1h，然后再加入 40μg/mL的 ConA培养
24h。24h后加 5mg/mL MTT 20μL，继续培养 4h。弃上
清，往孔中加 150μL DMSO，震荡使紫色絮状物完全
溶解，570nm波长下用酶标仪检测 OD值，细胞生长
的抑制率以以下公式计算：抑制率=（ODPBS-OD－
ConA）/ODPBS×100%。
1.4 Western blot检测不同浓度 ConA对 MCF-7细
胞自噬相关蛋白的表达 在 MCF-7细胞培养瓶中
分别加入 0（用 PBS代替）、10、20、40μg/mL的 ConA
培养 24h，同时另设一组在培养瓶中先加入 3mM的
3-MA培养 1h，然后再加入 40μg/mL的 ConA培养
24h，然后取细胞裂解后做 western blot检测 LC3-II
和 BNIP3的表达，目标蛋白表达量由它们在胶片上
显色后的灰度与相应 β-actin的灰度比表示。
1.5 BNIP3 siRNA 基因沉默检测 ConA 对 MCF-7
细胞的影响 按照 Lipofectamine 2000 操作说明书
在 MCF-7 培养体系中分别加入 100nM 的 BNIP3
siRNA以及无关对照 siRNA培养 16h，之后加 40μg/
mL ConA再培养 24h，检测细胞的增殖和自噬程度。
1.6 统计学方法 所有实验重复 3次，实验数据使
用 SPSS11.0统计软件进行处理，P值计算采用非配
对双边 t检验以及单因素方差分析，P<0.05 为差异
有统计学意义。
2 结 果
2.1 刀豆素 A对乳腺肿瘤细胞 MCF-7的抑制作用
与未加 ConA的 PBS组比较，MCF-7细胞在不同
浓度 ConA的作用下均呈现出抑制效应，且呈剂量依
赖性（P<0.01）。而 MCF-7细胞用自噬抑制剂 3-MA
预处理后再加 ConA培养，ConA对 MCF-7细胞的抑
制作用相比于未用 3-MA 预处理组明显减弱（P<
0.01），提示刀豆素 A通过诱导肿瘤细胞过度的自体
吞噬效应杀伤肿瘤细胞，见表 1。
2.2 刀豆素 A对乳腺肿瘤细胞 MCF-7自体吞噬的
诱导效应 与未加 ConA的 PBS组比较，MCF-7细
胞在不同浓度 ConA 的作用下 LC3-Ⅱ和 BNIP3 的
表达均明显升高。而 MCF-7细胞用 3-MA预处理后
再加 ConA 培养，LC3-Ⅱ的表达相比于未加 3-MA
组显著减少（P<0.05），而 BNIP3的表达则不受影响
（P>0.05）。进一步说明刀豆素 A能诱导乳腺癌肿瘤
细胞发生自体吞噬，见表 2。
2.3 BNIP3 表达对刀豆素 A 发挥抗肿瘤效应的影
响 用 BNIP3 siRNA沉默 BNIP3的表达后，与加无
关 siRNA 的对照组相比，ConA对 MCF-7细胞的抑
3-MA
浓度/mM
0
0
0
0
3
组 别
PBS组
10μg/mL ConA组
20μg/mL ConA组
40μg/mL ConA组
40μg/mL ConA+3mM 3-MA组
表 1 不同浓度刀豆素 A对MCF-7肿瘤细胞的抑制作用（x±s）
注：与 PBS组比较，**P<0.01；与不加 3-MA的 40μg/mL ConA组比
较，△△P<0.01
n/孔
3
3
3
3
3
ConA浓度/
（μg/mL）
0
10
20
40
40
抑制率/%
0
32.5±5.4**
67.1±4.7**
84.5±5.1**
38.3±6.1**△△
组 别
PBS组
10μg/mL ConA组
20μg/mL ConA组
40μg/mL ConA组
40μg/mL ConA+3mM 3-MA组
表 2 不同浓度刀豆素 A对 MCF-7肿瘤细胞蛋白表达的影响（x±s）
注：与 PBS组比较，*P<0.05，**P<0.01；与 40μg/mL ConA组比较，△△P<0.01
n/孔
3
3
3
3
3
ConA浓度/（μg/mL）
0
10
20
40
40
3-MA浓度/mM
0
0
0
0
3
灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）
0.01±0.01
0.24±0.05**
0.52±0.14**
0.73±0.12**
0.38±0.13**△△
灰度比（BNIP3/β-actin）
0.20±0.07
0.29±0.10*
0.61±0.18**
0.84±0.14**
0.80±0.15**
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浙江中西医结合杂志2014年第24卷第10期 ZhejiangJITCWM（Vol.24No.102014）
制作用明显降低（P<0.01），同时 ConA诱导的自体吞
噬效应也明显降低（P<0.01）。说明刀豆素 A通过上
调 BNIP3的表达诱导 MCF-7细胞发生自体吞噬而
导致肿瘤细胞死亡，见表 3。
3 讨 论
近年研究发现，ConA能引起一种新型的程序性
死亡方式-自体吞噬。自体吞噬过程是一个吞噬自身
细胞质蛋白并使其包被进入囊泡的过程，受一系列
自噬相关基因的调控，研究发现很多促自噬因子都
能抑制癌症发生，相对的，一些自噬负调节因子促进
肿瘤的发生。这些分子是直接通过调节自噬来影响
肿瘤发生还是通过另外的信号通路影响肿瘤目前仍
不清楚。高度自噬能诱发肿瘤细胞死亡，自噬缺失会
使某些组织器官（如乳腺、前列腺等）对代谢性应激
敏感性增加，易于使 DNA受到损伤，诱发肿瘤的发
生[7]，自体吞噬与肿瘤细胞的生存和增殖密切相关。
本研究通过 3-MA抑制了刀豆素 A 引起的 MCF-7
细胞的自噬及杀伤活性，证实了 ConA通过诱导人乳
腺癌细胞发生高度自噬，并诱导肿瘤细胞发生自噬
性死亡。
Bcl-2家族成员在凋亡过程中扮演重要角色，所
有的 Bcl -2 成员都至少具有四个同源结构域
（BH1-BH4）中的一个，这些结构域的不同组合决定
其是诱导还是抑制凋亡。BNIP3是包含单 BH3区的
促凋亡成员，属于 BH3-only 亚家族，研究表明
BNIP3 在细胞死亡的传导途径中有十分重要的作
用，它的高度表达能诱导非凋亡性的程序性死亡即
自噬性死亡[8]。因此提高肿瘤细胞 BNIP3的表达有可
能起到治疗肿瘤的作用，探索并开发具有提高
BNIP3表达的天然药物，在肿瘤治疗方面具有广阔
的前景，刀豆素 A正是一种天然药物，它不但能增强
机体的免疫功能对抗肿瘤，而且还能直接杀伤肿瘤
细胞，本文的研究为刀豆素 A抗肿瘤治疗的应用提
供了实验和理论依据。
参 考 文 献
［1］Wang HX，Liu M，Weng SY，et al.Immune mechanisms of
Concana-valin A model of autoimmune hepatitis［J］.World
J Gastroentrol，2012，18（2）：119-125.
［2］Liu B，Min MW，Bao JK.Induction of apoptosis by Con－
canavalin A and its molecular mechanisms in cancer cells
［J］.Autophagy，2009，5（3）：432-433.
［3］Liu Z1，Luo Y，Zhou TT，et al.Could plant lectins become
promising anti -tumour drugs for causing autophagic cell
death［J］.Cell Prolif，2013，46（5）：509-515.
［4］Parganlija D，Klinkenberg M，Jendrach M，et al.Loss of PINK1
Impairs stress -Induced Autophagy and Cell Survival［J］.
PLoS One，2014，9（4）：e95288.
［5］Ishihara M，Urushido M，Hamada K，et al.Sestrin -2 and
BNIP3 regulate autophagy and mitophagy in renal tubular
cells in acute kidney injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，
2013，305（4）：F495-509.
［6］Wang EY，Gang H，Kirshenbaum LA，et al.p53 mediates
autophagy and cell death by a mechanism contingent on
Bnip3［J］.Hypertension，2013，62（1）：70-77.
［7］Green DR，Levine B.To Be or Not to Be How Selective Au－
tophagy and Cell Death Govern Cell Fate［J］.Cell，2014，
Mar 27，157（1）：65-67.
［8］Gustafsson AB.Bnip3 as a dual regulator of mitochondrial
turnover and cell death in the myocardium［J］.Pediatr Car－
diol，2011，32（3）：267-274.
收稿日期：2014-04-30
修回日期：2014-06-15
组 别
ConA+无关 siRNA组
ConA+BNIP3 siRNA组
表 3 BNIP3 siRNA对刀豆素 A发挥抗肿瘤效应的影响（x±s）
注：与 ConA+无关 siRNA组比较，**P<0.01
n/孔
3
3
ConA浓度/（μg/mL）
40
40
BNIP3 siRNA/nM
0
100
无关 siRNA/nM
100
0
灰度比（BNIP3/β-actin）
0.89±0.17
0.38±0.12**
灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）
0.65±0.14
0.33±0.13**
抑制率/%
81.5±7.2
42.3±4.3**
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