全 文 ：理化检验-化学分册 PTCA(PART B:CHEM .ANA L.) 2009年　第 45卷 6
工作简报
超声提取-高效液相色谱法测定农吉利中
农吉利甲素
樊轻亚1 , 范华均1＊ , 黄晓文1 , 黄　勇2 , 邱佩丽1
(1.广东药学院 药科学院 , 广州 510006;　2.广州多谱科学仪器有限公司 , 广州 510080)
摘　要:采用甲醇超声提取法提取农吉利中农吉利甲素 ,用高效液相色谱法(HPLC)测定农吉
利甲素的含量。用 L 9(34)正交试验设计优化了提取溶剂 、提取温度 、提取时间 、料液比等试验条
件;以甲醇-三乙胺(0.5+99.5)混合溶液(pH 7.0)为流动相 ,对生物碱提取液进行了色谱分离 ,农
吉利甲素质量浓度在 1.0 ～ 800 mg · L-1范围内呈线性关系 ,方法的检出限(3S/N)为0.1 mg ·
L
-1 ,加标回收率试验的结果在 97.8%～ 102.3%之间。
关键词:高效液相色谱法;超声提取;农吉利;农吉利甲素
中图分类号:O657　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-4020(2009)06-0666-03
HPLCDetermination of Monocrotaline in Crotalaria Sessilif lora
by Ultrasonic Extraction Separation
FAN Qing-ya1 , FAN Hua-jun1＊ , HUANG Xiao-wen1 , HUANGYong2 , QIU Pei-li1
(1.Dept.of Pharmaceutics , Guangdong Col lege o f Pharmacology , Guangzhou 510006 , China;
2.Guangzhou Top S cienti f ic Instrument Co.L td., Guangz hou 510080 , China)
Abstract:Monocrotaline was separated fr om sample of crotalaria sessili f lora by ultrasonic ex traction with
me thanol.Influential factor s o f ext raction , including the ex traction so lv ents , time and tempera ture of ex traction as
well as the ratio of mass of sample to vo lume o f ex traction solvent , we re studied and optimized by the method o f
or thogonal design with L9(34)o rthogonal layout.In the HPLC determination , Ultima te TM C18(4.6 mm×250 mm ,
5 μm)co lumn w as used a s stationary phase and a mix ture o f methanol and triethy lamine-w ater (0.5+99.5 , pH
7.0)so lution , mixed in the r atio o f 30 to 70 , was used as mobile phase.L inear relationship betw een value s of peak
area and concentration o f monocro taline w as obtained in the range o f 1.0-800 mg · L-1 .Detection limit(3S/ N)
found for the me thod w as 0.1 mg · L-1 .Recover y w as tested by standard addition method and values of recovery
found we re ranged from 97.8% to 102.3%.
Keywords:HPLC;Ultr asonic so lv ent ex traction;Monocro taline;Crotalaria sessili f lora
　　农吉利系豆科植物野百合的全草 ,其味甘 、淡 、
平 ,滋阴益肾 ,清热解毒 ,抗癌。主治痢疾 、疮疖 、耳
鸣耳聋 、头晕目眩等以及多种癌症。农吉利中含有
生物碱 、黄酮及氨基酸等化学成分[ 1-3] ,农吉利甲素
是农吉利生物碱中主要成分(又称野百合碱 、农吉利
收稿日期:2008-08-04
基金项目:广东省社会发展领域科技计划项目(73060)
作者简介:樊轻亚(1979-),女 ,河南南阳人 ,硕士研究生 ,研究
　方向为现代仪器分析在药物分析中的应用。
＊联系人
碱),具有抗癌活性 ,对多种试验性肿瘤有抑制作用 ,
同时可引起肺动脉高压和右心室肥大等毒副作用 ,在
医学研究中用于建立肺动脉高压模型的诱导剂 ,主要
来源于农吉利药材提取 ,有关农吉利生物碱的分析尚
未见有报道。本试验采用超声提取-高效液相色谱法
测定农吉利生物碱提取液中农吉利甲素的含量。
1　试验部分
1.1　仪器与试剂
LC-10A型液相色谱仪;UV-1101 型紫外分光
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理化检验-化学分册 樊轻亚等:超声提取-高效液相色谱法测定农吉利中农吉利甲素
光度计。
农吉利甲素标准品溶液:称取农吉利甲素标准
品10.0 mg ,用甲醇定容至10 mL ,配成 1.000 0 g ·
L-1标准储备液 ,置于冰箱内保存 。
三乙胺溶液:取三乙胺 2.5 mL 于 500 mL 水
中 ,用磷酸调节至 pH 为 7.0。
甲醇为色谱纯 ,其余试剂为分析纯 。
1.2　色谱测定条件
固定相为 UltimateTM C18色谱柱(4.6 mm ×
250 mm , 5 μm), 流动相为甲醇与三乙胺(0.5 +
99.5)溶液以体积比 30比 70的混合溶液 ,检测波长
216 nm ,柱温为室温 ,流速 0.8 mL ·min-1 ,进样量
10 μL。
1.3　试验方法
农吉利干药材经粉碎后 ,储于干燥器中 ,备用 。
称取农吉利粗粉 5.000 0 g ,置于具塞锥形瓶
中 ,加入 20 倍量甲醇 , 在 40 ℃下超声(频率为
35 kHz)提取 20 m in ,得提取液。
将提取液减压蒸干 ,残渣用 0.1 mo l·L-1盐酸
溶液 50 mL 溶解 ,然后用氯仿 20 mL 萃取 3次除去
杂质 ,弃去氯仿溶液 ,水相用氨水调至 pH 为10 ～
11 ,再用氯仿萃取 3次 ,每次 20 mL ,合并氯仿液 ,减
压蒸干 ,用色谱纯甲醇定容至 2 mL 得生物碱提取
液 ,生物碱提取液通过 0.45 μm 滤膜 ,进样 10 μL ,
按色谱测定条件进行分析 。
2　结果与讨论
2.1　提取方法的选择
按优化试验条件分别采用超声和溶剂回流提取
法 ,在相同色谱条件下进行对比试验 ,结果见表 1。
表 1　农吉利甲素的提取方法对比结果
Tab.1　Comparison of analyt.results of monocrotaline
by ultrasonic extraction and by solvent reflux extraction
提取方法 温度/ ℃
时间
/min
测定值
ρ/(mg· L-1)
提取率
/ %
超声提取法 40 20 84.8 0.34
20 67.1 0.27
溶剂回流法 40 60 79.4 0.32
80 180 98.2 0.39
由表 1可知:在相同温度下 ,采用超声提取法提
取率明显高于溶剂回流法 ,且提取时间可缩短 2/3
以上 ,溶剂回流法在 80 ℃时 ,提取 3 h才能达到较
高提取率 。试验还发现:超声提取效率与频率有关 ,
频率为 35 kHz时 ,其提取率明显高于 100 kHz。
2.2　色谱条件的选择
以甲醇为参比溶液对农吉利甲素标准溶液进行
了紫外扫描 ,发现农吉利甲素在 216 nm 波长处吸
收最大 ,选择 216 nm 作为检测波长;以三乙胺作为
抑制剂 ,选择甲醇-三乙胺溶液为流动相 ,试验了不
同配比及 pH 值对分离的影响[ 10] ,结果见图 1。
(a)　标准溶液
(b)　样品的提取液
图 1　农吉利甲素标准溶液和生物碱提取液的色谱图
Fig.1　Chromatograph s of monocrotaline s tandard s olution(a)
and ext ract of the alk aloid f rom sam ples(b)
结果表明:甲醇与 pH 7.0 的三乙胺(0.5 +
99.5)溶液以体积比 30比 70时 ,农吉利甲素能较好
地分离 ,其保留时间为 11.281 min ,可满足分析的
要求 。
2.3　超声提取条件的优化
2.3.1　溶剂的选择
分别以甲醇 、乙醇 、乙酸乙酯 、氯仿 、四氯化碳作
为提取溶剂 ,试验了不同溶剂对农吉利中农吉利甲
素提取率的影响 ,结果表明:以甲醇作为提取溶剂 ,
提取率最高 ,其次是乙醇 ,表明极性溶剂有利于农吉
利甲素的提取 。试验选择甲醇作为提取溶剂。
2.3.2　超声提取条件的正交试验
试验以农吉利甲素为目标物 ,选用 L9(34)正交
试验结合单因素试验对提取温度(A)、提取时间
(B)、料液比(C)(药材质量∶甲醇溶液体积)等因素
进行了试验 ,正交试验设计和试验结果见表 2。
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理化检验-化学分册 樊轻亚等:超声提取-高效液相色谱法测定农吉利中农吉利甲素
表 2　超声提取 L9(34)正交试验设计表
Tab.2　Orthogonal design with L9(34)layout
of ultrasonic extraction
水平 温度 A/ ℃
时间 B
/min
料液比 C
g∶mL
1 25 20 1∶10
2 40 30 1∶15
3 60 40 1∶20
根据极差分析和正交试验效应曲线分析 ,影响
农吉利甲素提取效率程度为:A >C >B ,其提取的
优化条件为 A 2B1C3 ,因此农吉利甲素的提取条件
为:提取温度 40 ℃,提取时间 20 min ,料液比 1∶20
时较为适宜。
2.4　工作曲线和检出限
按色谱条件对系列标准溶液进行测定 ,以色谱
峰面积(A)对质量浓度(ρ)绘制标准工作曲线 ,农吉
利甲素的质量浓度在 1.0 ～ 800 mg ·L-1范围内呈
线性关系 ,其线性回归方程为 A =3 311 699 ρ+
23 712 ,相关系数为 0.999 2 , 检出限(3S/N)为
0.1 mg ·L-1 。
2.5　精密度 、稳定性及回收率试验
称取农吉利药材细粉 5.000 0 g ,按试验方法进
行提取与测定 ,分别于 0 , 4 , 8 , 12 , 24 h 对生物碱提
取液中农吉利甲素进行测定 。结果表明:提取液在
24 h稳定 , 相对标准偏差(n =5)为 1.3%, 加入
0.04 mg农吉利甲素标准溶液进行了加标回收试
验 ,回收率(n=5)在 97.8%～ 102.3%之间。
2.6　样品分析
按色谱条件对两个产地的农吉利药材进行了提
取与测定 , 广西药材中农吉利甲素的测定值为
0.036 1 mg · g-1 ,山东药材中农吉利甲素的测定值
为 0.003 88 mg ·g-1 。
由此表明:不同产地由于地理环境条件差异对
农吉利甲素含量的影响极大 ,本方法的测定结果可
为药材的筛选提供参考依据 。
参考文献:
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(上接第 665页) 可以说明四苯基卟啉与钴已络合完全 。
本工作采用薄层色谱法 ,以二元混合溶剂作展
开剂 ,实现了四苯基卟啉与四苯基钴卟啉的有效分
离;所得斑点清晰 、比移值适中 、无拖尾;该体系可有
效地跟踪四苯基钴卟啉的合成过程。
参考文献:
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色谱中的应用[ J] .河北大学学报:自然科学版 , 1997 ,
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