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油楠基因组DNA提取·ISSR反应体系优化及引物筛选



全 文 :油楠基因组 DNA提取·ISSR反应体系优化及引物筛选
吴忠锋1,杨锦昌2* ,尹光天2,李荣生2,邹文涛2,袁 洁2
(1.广州市林业和园林科学研究院,广东广州 510405;2.中国林业科学研究院热带林业研究所,广东广州 510520)
摘要 [目的]对油楠基因组 DNA提取、ISSR反应体系优化及引物筛选进行探讨。[方法]运用改良 CTAB法对油楠树皮进行基因组
DNA提取,利用单因素试验,对油楠 ISSR-PCR反应各因素水平进行优化。[结果]运用改良 CTAB法对油楠树皮进行基因组 DNA提取
效果最佳; 最优体系: 20 μl反应体系中,模板用量 20 ng,引物浓度 0. 6 μmol /L,dNTPs浓度 0. 2 mmol /L,Mg2 +浓度 2. 0 mmol /L,Taq酶用
量 1. 5 U,10倍反应缓冲液 2 μl,ddH2O补至 20 μl;以该体系为基础进行引物筛选,在 100条 ISSR随机引物中筛选出 13条多态性较高、
扩增条带清晰、重复性好的引物。[结论]该研究丰富了油楠遗传学基本资料,为油楠遗传多样性研究奠定基础。
关键词 油楠; DNA提取; ISSR-PCR;优化
中图分类号 S166 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611( 2015) 26 -013 -04
DNA Extraction,Optimization of ISSR-PCR System and Primers Screening of Sindora glabra
WU Zhong-feng1,YANG Jin-chang2* ,YIN Guang-tian2 et al ( 1. Guangzhou Academy of Forestry and Landscape Gardening,Guangzhou,
Guangdong 510405; 2. Research Institute of Tropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Guangzhou,Guangdong 510520)
Abstract [Objective]DNA extraction,optimization of ISSR-PCR system and primers screening of Sindora glabra were investigated.[Method]
Using the modified CTAB method for genonmic DNA extraction of Sindora glabra leather,using the method of single factor experiment,ISSR -
PCR reaction factors level was optimized. [Result]The results showed that: the extraction effect for genomic DNA of Sindora glabra bark was the
best. The optimal reaction system in 20 μl reaction system was 20 ng DNA,0. 6 μmol /L ISSR primer,0. 2 mmol /L dNTPs,2. 0 mmol /L Mg2 +,
1. 5 U Taq DNA polymerase and 2 μl tenfold reaction buffer solution with ddH2O added to 20 μl of total solution; According to this reaction sys-
tem,13 primers in 100 primers were chosen for high polymorphism,their charity and repetition.[Conclusion]The study enriched genetics basic
information of Sindora glabra ,laid the foundation for the research of genetic diversity.
Key words Sindora glabra; DNA extraction; ISSR-PCR; Optimization
基金项目 热带林业研究所基本科研业务费专项( RITFYWZX201206) ;
林业行业专项 ( 201304604 ) ; 广州市林业和园林局科研
项目。
作者简介 吴忠锋( 1988 - ) ,男,山东菏泽人,硕士研究生,研究方向:
种质资源评价与利用。* 通讯作者,副研究员,从事热带森
林培育与经营方面的研究。
收稿日期 2015-07-14
油楠(Sindora glabra Merr. ex de Wit)隶属于苏木科
(Caesalpiniaceae)油楠属(Sindora Miq.) ,是国家二级重点保
护野生植物,也是国内目前报道的树体内直接产生树脂油的
“柴油树”,具有油用、药用、观赏和材用等用途[1 -3]。因此,
加强油楠基础研究和促进油楠资源开发利用势在必行[4]。
目前,研究多集中于植被分类、资源分布、生物学特性、产油
特性和树脂油理化特性分析等方面[1,5 -11],而对油楠遗传多
样性等方面的研究鲜有涉及,在一定程度上限制了油楠的开
发利用。由于长期过度利用,油楠野生资源已十分稀少,仅
零星分布于海南,因此亟待开展油楠遗传学基本资料的
研究。
ISSR标记是由 Zietkiewicz 等[12]提出的一种标记技术,
采用 17 ~ 22 碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片
段。ISSR综合了RAPD和 SSR的优点,又克服了RAPD标记
稳定性和重复性差等缺点,具有操作简单、重复性好、多态性
丰富的特点,已被广泛应用于品种鉴定[13 -17]、指纹图谱的构
建[18 -19]。由于取样距离和样品保存方式的影响,加之油楠
组织内酚类及多糖物质较多,影响油楠 DNA的提取、ISSR反
应体系优化及引物筛选,笔者旨在解决以上问题,丰富油楠
遗传学基本资料,为今后油楠后续研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料 试验材料包括油楠单株的幼叶或树干基部树皮
韧皮部样品,采集于海南乐东、昌江、陵水和五指山四大油楠
主要分布区,采样单株相隔 100 m以上。样品采集后立即装
入密封袋并用硅胶速干法处理,带回室内贮藏于 - 20 ℃的
冰箱中备用。
1. 2 主要仪器及试剂 PCR仪(Bio-Rad PTC-0200)、球磨仪
(Retsch MOL. L-1400)、真空离心浓缩仪(Eppendorf 5301)、电
泳仪(Bio-Rad PowerPac HV)、超低温冰箱(Revco ULT-
1786)、超纯水系统(MILLIPORE Milli-Q)、制冰机(Scotman
AF100)、超速冷冻离心机(Eppendorf 5801R)和其他相关仪
器设备,以及 DNA提取和 ISSR-PCR相关反应试剂等。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 油楠总 DNA 的提取及 DNA 纯度、浓度检测。在参
照多种 DNA 提取和优化方法[20 -21]的基础上,采用改良
CTAB法[22]提取油楠叶和树皮的 DNA,其具体操作步骤:取
50 mg树皮干样,加入2 ml离心管中,再放入3 ~5粒钢珠,液
氮冷冻后置于球磨仪上(注意两边平衡) ,频率设置 25,振荡
3 min;向样品管中加入 1 ml CTAB提取液,65 ℃恒温水浴 45
min左右,期间每隔 10 min 摇动一次;取出样品管,4 ℃、
8 000 r /min离心 10 min,取上清液;加入等体积氯仿 /异戊醇
(体积比 24∶ 1) ,摇匀,12 000 r /min离心 10 min,取上清液,若
上清液较黏稠,重复该步骤;向上清液中加入 1 /2 体积 5
mol /L NaCl,混匀;加入 1 /2体积预冷异丙醇,4 ℃保存,隔夜
处理;12 000 r /min离心 10 min,弃上清液,加入 75%乙醇和
无水乙醇各洗一次,洗后用纸巾吸干,置于真空干燥仪干燥;
加入 1 × TE溶解后,置于 -20 ℃冰箱备用。
基因组 DNA纯度检测:1 × TAE电泳缓冲液、1. 2%琼脂
糖凝胶电泳(0. 1% Goldview 染色) ,电压 120 V,时间 45 min
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2015,43(26) :13 - 16,35 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.26.140
左右;电泳后,使用数码相机在凝胶成像仪上拍照记录,检测
基因组 DNA的质量。
DNA样品浓度检测:使用紫外分光光度计,测定样品 230、
260、280 nm处的吸收值,计算其浓度,并稀释成 10 ng /μl。
1. 3. 2 ISSR-PCR反应体系的构建。
1. 3. 2. 1 ISSR-PCR反应体系及反应程序的建立。100 条随
机 ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的 ISSR
引物序列,由北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司合成。反
应体系参照穆立蔷等[23]:在 20 μl的反应体系中,Taq酶 1. 0
U,Mg2 + 2. 0 mmol /L,dNTPs 0. 2 mmol /L,引物 0. 4 μmol /L,10
× Taq buffer 2 μl,模板 DNA 30 ng。
ISSR-PCR反应程序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s、
50 ℃退火、72 ℃延伸 1 min,35 个循环;72 ℃延伸 10 min,
4 ℃至恒温。
1. 3. 2. 2 PCR扩增产物的检测。PCR结束后,取 PCR产物
6 μl加入 2 μl溴酚蓝混匀,1. 8%琼脂糖凝胶,于 1 × TAE电
泳缓冲液(Goldview 浓度 0. 1%)中电压 120 V,电泳 1 h 左
右。Marker 为 D2000 ladder Marker。电泳结束后于 WD-
9403F紫外仪下观察并照相记录。
1. 3. 2. 3 ISSR-PCR 反应体系的优化。为确定油楠基因组
DNA最佳 ISSR扩增条件,根据预试验结果,以 U808为通用引
物,反应体系优化主要采用单因子试验设计,影响 PCR反应的
6个主要因素:DNA 模板、引物浓度、dNTPs 浓度、Mg2 +浓度、
Taq酶浓度、退火温度,逐个在 6个水平上进行优化试验,建立
油楠最佳 ISSR-PCR反应体系。各成分优化设计见表 1。
表 1 ISSR-PCR各反应成分优化设计
水平
因素
模板
ng
引物
μmol /L
dNTPs
mmol /L
Mg2 +
mmol /L
Taq酶
U
退火温
度∥℃
1 10 0. 3 0. 125 1. 25 0. 5 48
2 20 0. 4 0. 150 1. 50 0. 75 50
3 30 0. 5 0. 175 1. 75 1. 0 52
4 40 0. 6 0. 200 2. 00 1. 25 54
5 60 0. 7 0. 225 2. 25 1. 5 56
6 80 0. 8 0. 250 2. 50 1. 75 58
2 结果与分析
2. 1 油楠基因组 DNA提取及质量检测 采用硅胶干燥的
老叶、嫩叶、树皮韧皮部 3 种试验材料。参照改良 CTAB 法
提取 DNA,结果见图 1(均为第一次提取)。由图 1 可知,嫩
叶效果最好,树皮次之,老叶最差。由于天然林中油楠树干
高大通直,枝下高较大,采取叶片难度较大,因此采用树皮提
取 DNA。鉴于树皮第一次提取含较多杂质,通过二次提取以
减少杂质,2次提取效果见图 2。
采用 1. 2%琼脂糖检测 DNA质量,结果表明,DNA条带
清晰,质量较好,二次提取杂质较少。紫外分光光度计检测
DNA纯度,OD260 nm /OD280 nm在 1. 8 ~ 2. 0,麦明 DNA 中蛋白
质、多糖等杂质污染较少,所提取 DNA较纯净。表明用改良
CTAB法二次提取的油楠 DNA质量达到 ISSR-PCR对模板的
要求。
2. 2 模板浓度对 PCR的影响 DNA模板浓度是影响 ISSR-
PCR反应体系的重要因素。DNA模板浓度过低会造成扩增
不完整,而 DNA模板浓度过高会导致非特异性条带增多,条
带边缘出现弥散现象,从而影响条带的判读[24 -25]。通过对
模板6个浓度梯度扩增结果的对比,发现模板浓度10 ~80 ng
均能产生扩增,模板量为 60 ~80 ng时,扩增条带开始变得模
糊,而模板量为 10 ng时,扩增条带较弱,同等扩增效果下,考
虑到节省模板的原则,最终确定 20 ng 为 DNA 模板的最适
用量。
注:M. D2000,1 ~3.老叶,4 ~6.嫩叶,7 ~9.树皮。
图 1 不同提取部位对 DNA质量的影响
2. 3 引物浓度对 PCR的影响 引物浓度对 ISSR-PCR扩增
结果有明显影响,引物浓度过低,易导致模板与引物结合率
低,影响扩增效率;而浓度过高则容易导致错配及引物二聚
体的出现[26]。由图 4可知,随着引物浓度升高,扩增条带逐
渐增多且清晰,引物浓度为 0. 6 μmol /L 时,扩增效果最佳;
引物浓度为0. 7 ~0. 8 μmol /L时,扩增条带有阴影,因此确定
0. 6 μmol /L为最佳引物浓度。
2. 4 dNTPs浓度对 PCR的影响 dNTPs是 ISSR-PCR反应
的原料,浓度过低,易造成 PCR产率较低,条带模糊;浓度过
高,则会导致 PCR 错配产生非特异性条带[23 -24,27]。由图 5
可知,dNTPs为 0. 125 ~0. 250 mmol /L时扩增条带基本一致,
dNTPs浓度为 0. 200 mmol /L 时,条带最为清晰;浓度大于
0. 200 mmol /L时,条带出现模糊或减少的现象。因此,dNTPs
最佳浓度选择 0. 200 mmol /L。
2. 5 Mg2 + 浓度对 PCR 的影响 Mg2 + 浓度是影响 ISSR-
PCR的重要因素,它对整个 PCR过程中 Taq酶活性、退火温
度及特异性条带的产生都有一定影响[28 -29]。研究表明,
Mg2 +的最佳浓度在 1. 5 ~ 2. 5 mmol /L[30 -32]。由图 6 可知,
Mg2 +浓度为 1. 25 ~2. 50 mmol /L时均有扩增产物,浓度较低
或较高时,扩增条带缺失或模糊;Mg2 +浓度为 2. 00 mmol /L
时,扩增效果最好,带型及亮度较好。因此,油楠 ISSR 反应
体系中最佳 Mg2 +浓度为 2. 00 mmol /L。
2. 6 Taq酶浓度对 PCR 的影响 Taq 酶是影响 ISSR-PCR
的重要因素,浓度过低导致扩增产物较少,浓度过高则会造
成假阳性扩增,即非特异性扩增[33 -34]。由图 7 可知,不同浓
度扩增结果不尽相同,Taq酶用量为 0. 5 ~ 1. 0 U 时,条带少
且模糊,当 Taq酶用量为 1. 5 U 时,条带清晰且扩增效率较
41 安徽农业科学 2015 年
注:1 ~12为第二次提取,13 ~24为第 1次提取。
图 2 油楠基因组 DNA
注:1 ~6分别为横板浓度 10、20、30、40、60、80 ng。
图 3 模板浓度对 PCR的影响
注:1 ~6分别为引物浓度 0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 μmol /L。
图 4 引物浓度对 PCR的影响
注:1 ~6 分别为 dNTPs 0. 125、0. 150、0. 175、0. 200、0. 225、0. 250
mmol /L。
图 5 dNTPs浓度对 PCR的影响
高。因此,选择 Taq 酶 1. 5 U 为油楠 ISSR-PCR 反应体系的
最适用量。
2. 7 退火温度对 PCR的影响 引物退火温度是影响 PCR
扩增的重要因素,退火温度直接关系到引物与模板特异性结
合程度以及扩增条带的样式,退火温度过低会导致引物的非
特异性结合,温度过高则会影响引物与模板结合的稳定
性[29]。由图 8可知,退火温度过低时,非特异性条带扩增明
注:1 ~ 6 分别为 Mg2 + 浓度 1. 25、1. 50、1. 75、2. 00、2. 25、2. 50
mmol /L。
图 6 Mg2 +浓度对 PCR的影响
注:1 ~6分别为 Taq酶 0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50、1. 75 U。
图 7 Taq酶对 PCR的影响
注:1 ~6分别为退火温度 48、50、52、54、56、58 ℃。
图 8 退火温度对 PCR的影响
显,而温度过高时,特异性强,但会造成一些目的条带的缺
失。综合考虑,选择 54 ℃为最佳退火温度。
2. 8 ISSR引物的筛选 对 100 条随机引物进行单模板初
筛,选出能扩增出条带的引物,在此基础上,采用多模板复
筛,选出多态性高、重复率好、特异性强的引物共 13 条,分别
为 U807、U808、U814、U825、U827、U841、U842、U860、U864、
U880、U886、U888、U889。引物 U808 对部分油楠 DNA 的 IS-
5143卷 26期 吴忠锋等 油楠基因组 DNA提取·ISSR反应体系优化及引物筛选
SR扩增图谱见图 9,引物具体信息见表 2。
注:1 ~48为样本 1 ~48号。
图 9 引物 U808对部分油楠 DNA的 ISSR扩增图谱
表 2 ISSR引物序列及退火温度
引物 引物序列(5 -3) 退火温度∥℃
U807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 50. 0
U808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 53. 0
U814 CTC TCT CTC TCT CTC TA 49. 0
U825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 49. 5
U827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 53. 0
U841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 53. 5
U842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG 50. 0
U860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 50. 5
U864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG 49. 5
U880 GGA GAG GAG AGG AGA 49. 0
U886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 54. 5
U888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 53. 0
U889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 52. 5
3 讨论
DNA的提取质量是 PCR 成功与否的关键。目前,DNA
提取材料一般选择嫩叶[35 -36],野外采集叶样时,由于林分中
植株的枝下高较高,叶片采集难度大、成本高,将树皮韧皮部
作为试验材料能很好地解决该问题。树皮取样一般多用于
树皮内含物测定[37],以树皮为试验材料研究遗传多样性报
道较少[38],天然林取样中尚未见报道。油楠类似于玩拗植
物,植物组织内富含多糖及次生物质,DNA提取与纯化难度
较大。结合多种 DNA提取方法,在提取液中加入 β-巯基乙
醇、PVP以及高浓度 NaCl 提供的高盐环境能有效减少酚类
及多糖[39],对试验材料进行二次提取,可有效降低杂质含
量,但会造成 DNA的损耗,考虑到油楠组织内多糖及次生物
质较多以及天然林中高大乔木采取嫩叶样品较为困难,用树
皮作为 DNA提取的试验材料可为其他树种天然居群遗传多
样性研究提供新思路。
ISSR标记可有效揭示物种种群内和种群间遗传多样性
差异,在分析其系统分化规律、遗传结构、基因流动以及种源
区划上具有重要意义[40]。目前有关 ISSR-PCR 反应体系优
化方法的报道较多,包括单因素法[41 -42]、正交试验法[43]以及
正交试验设计与单因素分析相结合的方法[44],单因素法能
直观快速得到最佳反应体系。此外,为保持该试验结果的一
致性,PCR基因扩增在同一台 PCR仪上进行。该研究对 IS-
SR-PCR各反应因子进行研究和筛选,建立了最佳反应体系,
并筛选出 13条 ISSR引物,为进一步研究油楠遗传多样性及
种质资源评价利用等方面提供重要参考依据。
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( 下转第 35页)
61 安徽农业科学 2015 年
2. 4 稻米品质 从表 4可知,水管较旱管各品种食味值、直
链淀粉含量均有不同程度的增加,而蛋白质含量却减少,说
明灌水管较旱管对改善稻米品质方面有良好作用。
表 4 不同灌溉方式下不同品种的品质测定结果
品种
灌溉
方式
食味值
%
直链淀粉
%
蛋白质
%
水分
%
徐稻 3号 旱管 64 20. 1 7. 9 10. 8
水管 68 19. 7 7. 4 10. 7
徐优 502 旱管 58 20. 8 8. 9 12. 1
水管 61 20. 4 8. 4 12. 5
郑旱 277(CK) 旱管 51 22. 2 10. 2 11. 0
水管 53 21. 6 9. 4 10. 0
3 结论
2012、2013年 2年试验结果表明,不论是早熟品种,还是
中熟的常规稻和杂交粳稻,旱种水管较旱种旱管灌溉方式均
促进了水稻品种营养器官的生长,加快了生育进程,相应缩
短了生育期;水管促进分蘖生长,增加了群体数量,但减少了
群体成穗率;水管促进了穗部的发育,使单穗颖花数、结实率
和千粒重均有不同程度的增加。同时,水管由于促进了子粒
的充实,亦改善了稻谷品质。试验还表明,如基本苗数多,生
长过旺盛,群体过大,则出现分蘖率高,群体成穗率低,单穗
颖花量减少的现象。所以,直播稻选用品种时要合理安排播
种量,大群体田块够苗即断水适当烤田,控旺促成穗,促大
穗、促灌浆、促成熟。
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( 上接第 16页)
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