全 文 ：油楠基因组 DNA提取·ISSＲ反应体系优化及引物筛选
吴忠锋1，杨锦昌2* ，尹光天2，李荣生2，邹文涛2，袁 洁2
(1．广州市林业和园林科学研究院，广东广州 510405;2．中国林业科学研究院热带林业研究所，广东广州 510520)
摘要 ［目的］对油楠基因组 DNA提取、ISSＲ反应体系优化及引物筛选进行探讨。［方法］运用改良 CTAB法对油楠树皮进行基因组
DNA提取，利用单因素试验，对油楠 ISSＲ-PCＲ反应各因素水平进行优化。［结果］运用改良 CTAB法对油楠树皮进行基因组 DNA提取
效果最佳; 最优体系: 20 μl反应体系中，模板用量 20 ng，引物浓度 0． 6 μmol /L，dNTPs浓度 0． 2 mmol /L，Mg2 +浓度 2． 0 mmol /L，Taq酶用
量 1． 5 U，10倍反应缓冲液 2 μl，ddH2O补至 20 μl;以该体系为基础进行引物筛选，在 100条 ISSＲ随机引物中筛选出 13条多态性较高、
扩增条带清晰、重复性好的引物。［结论］该研究丰富了油楠遗传学基本资料，为油楠遗传多样性研究奠定基础。
关键词 油楠; DNA提取; ISSＲ-PCＲ;优化
中图分类号 S166 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2015) 26 －013 －04
DNA Extraction，Optimization of ISSＲ-PCＲ System and Primers Screening of Sindora glabra
WU Zhong-feng1，YANG Jin-chang2* ，YIN Guang-tian2 et al ( 1． Guangzhou Academy of Forestry and Landscape Gardening，Guangzhou，
Guangdong 510405; 2． Ｒesearch Institute of Tropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Guangzhou，Guangdong 510520)
Abstract ［Objective］DNA extraction，optimization of ISSＲ-PCＲ system and primers screening of Sindora glabra were investigated．［Method］
Using the modified CTAB method for genonmic DNA extraction of Sindora glabra leather，using the method of single factor experiment，ISSＲ -
PCＲ reaction factors level was optimized． ［Ｒesult］The results showed that: the extraction effect for genomic DNA of Sindora glabra bark was the
best． The optimal reaction system in 20 μl reaction system was 20 ng DNA，0． 6 μmol /L ISSＲ primer，0． 2 mmol /L dNTPs，2． 0 mmol /L Mg2 +，
1． 5 U Taq DNA polymerase and 2 μl tenfold reaction buffer solution with ddH2O added to 20 μl of total solution; According to this reaction sys-
tem，13 primers in 100 primers were chosen for high polymorphism，their charity and repetition．［Conclusion］The study enriched genetics basic
information of Sindora glabra ，laid the foundation for the research of genetic diversity．
Key words Sindora glabra; DNA extraction; ISSＲ-PCＲ; Optimization
基金项目 热带林业研究所基本科研业务费专项( ＲITFYWZX201206) ;
林业行业专项 ( 201304604 ) ; 广州市林业和园林局科研
项目。
作者简介 吴忠锋( 1988 － ) ，男，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向:
种质资源评价与利用。* 通讯作者，副研究员，从事热带森
林培育与经营方面的研究。
收稿日期 2015-07-14
油楠(Sindora glabra Merr． ex de Wit)隶属于苏木科
(Caesalpiniaceae)油楠属(Sindora Miq．) ，是国家二级重点保
护野生植物，也是国内目前报道的树体内直接产生树脂油的
“柴油树”，具有油用、药用、观赏和材用等用途［1 －3］。因此，
加强油楠基础研究和促进油楠资源开发利用势在必行［4］。
目前，研究多集中于植被分类、资源分布、生物学特性、产油
特性和树脂油理化特性分析等方面［1，5 －11］，而对油楠遗传多
样性等方面的研究鲜有涉及，在一定程度上限制了油楠的开
发利用。由于长期过度利用，油楠野生资源已十分稀少，仅
零星分布于海南，因此亟待开展油楠遗传学基本资料的
研究。
ISSＲ标记是由 Zietkiewicz 等［12］提出的一种标记技术，
采用 17 ～ 22 碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片
段。ISSＲ综合了ＲAPD和 SSＲ的优点，又克服了ＲAPD标记
稳定性和重复性差等缺点，具有操作简单、重复性好、多态性
丰富的特点，已被广泛应用于品种鉴定［13 －17］、指纹图谱的构
建［18 －19］。由于取样距离和样品保存方式的影响，加之油楠
组织内酚类及多糖物质较多，影响油楠 DNA的提取、ISSＲ反
应体系优化及引物筛选，笔者旨在解决以上问题，丰富油楠
遗传学基本资料，为今后油楠后续研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 试验材料包括油楠单株的幼叶或树干基部树皮
韧皮部样品，采集于海南乐东、昌江、陵水和五指山四大油楠
主要分布区，采样单株相隔 100 m以上。样品采集后立即装
入密封袋并用硅胶速干法处理，带回室内贮藏于 － 20 ℃的
冰箱中备用。
1． 2 主要仪器及试剂 PCＲ仪(Bio-Ｒad PTC-0200)、球磨仪
(Ｒetsch MOL． L-1400)、真空离心浓缩仪(Eppendorf 5301)、电
泳仪(Bio-Ｒad PowerPac HV)、超低温冰箱(Ｒevco ULT-
1786)、超纯水系统(MILLIPOＲE Milli-Q)、制冰机(Scotman
AF100)、超速冷冻离心机(Eppendorf 5801Ｒ)和其他相关仪
器设备，以及 DNA提取和 ISSＲ-PCＲ相关反应试剂等。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 油楠总 DNA 的提取及 DNA 纯度、浓度检测。在参
照多种 DNA 提取和优化方法［20 －21］的基础上，采用改良
CTAB法［22］提取油楠叶和树皮的 DNA，其具体操作步骤:取
50 mg树皮干样，加入2 ml离心管中，再放入3 ～5粒钢珠，液
氮冷冻后置于球磨仪上(注意两边平衡) ，频率设置 25，振荡
3 min;向样品管中加入 1 ml CTAB提取液，65 ℃恒温水浴 45
min左右，期间每隔 10 min 摇动一次;取出样品管，4 ℃、
8 000 r /min离心 10 min，取上清液;加入等体积氯仿 /异戊醇
(体积比 24∶ 1) ，摇匀，12 000 r /min离心 10 min，取上清液，若
上清液较黏稠，重复该步骤;向上清液中加入 1 /2 体积 5
mol /L NaCl，混匀;加入 1 /2体积预冷异丙醇，4 ℃保存，隔夜
处理;12 000 r /min离心 10 min，弃上清液，加入 75%乙醇和
无水乙醇各洗一次，洗后用纸巾吸干，置于真空干燥仪干燥;
加入 1 × TE溶解后，置于 －20 ℃冰箱备用。
基因组 DNA纯度检测:1 × TAE电泳缓冲液、1． 2%琼脂
糖凝胶电泳(0． 1% Goldview 染色) ，电压 120 V，时间 45 min
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(26) :13 － 16，35 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.26.140
左右;电泳后，使用数码相机在凝胶成像仪上拍照记录，检测
基因组 DNA的质量。
DNA样品浓度检测:使用紫外分光光度计，测定样品 230、
260、280 nm处的吸收值，计算其浓度，并稀释成 10 ng /μl。
1． 3． 2 ISSＲ-PCＲ反应体系的构建。
1． 3． 2． 1 ISSＲ-PCＲ反应体系及反应程序的建立。100 条随
机 ISSＲ引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的 ISSＲ
引物序列，由北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司合成。反
应体系参照穆立蔷等［23］:在 20 μl的反应体系中，Taq酶 1． 0
U，Mg2 + 2． 0 mmol /L，dNTPs 0． 2 mmol /L，引物 0． 4 μmol /L，10
× Taq buffer 2 μl，模板 DNA 30 ng。
ISSＲ-PCＲ反应程序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s、
50 ℃退火、72 ℃延伸 1 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min，
4 ℃至恒温。
1． 3． 2． 2 PCＲ扩增产物的检测。PCＲ结束后，取 PCＲ产物
6 μl加入 2 μl溴酚蓝混匀，1． 8%琼脂糖凝胶，于 1 × TAE电
泳缓冲液(Goldview 浓度 0． 1%)中电压 120 V，电泳 1 h 左
右。Marker 为 D2000 ladder Marker。电泳结束后于 WD-
9403F紫外仪下观察并照相记录。
1． 3． 2． 3 ISSＲ-PCＲ 反应体系的优化。为确定油楠基因组
DNA最佳 ISSＲ扩增条件，根据预试验结果，以 U808为通用引
物，反应体系优化主要采用单因子试验设计，影响 PCＲ反应的
6个主要因素:DNA 模板、引物浓度、dNTPs 浓度、Mg2 +浓度、
Taq酶浓度、退火温度，逐个在 6个水平上进行优化试验，建立
油楠最佳 ISSＲ-PCＲ反应体系。各成分优化设计见表 1。
表 1 ISSＲ-PCＲ各反应成分优化设计
水平
因素
模板
ng
引物
μmol /L
dNTPs
mmol /L
Mg2 +
mmol /L
Taq酶
U
退火温
度∥℃
1 10 0． 3 0． 125 1． 25 0． 5 48
2 20 0． 4 0． 150 1． 50 0． 75 50
3 30 0． 5 0． 175 1． 75 1． 0 52
4 40 0． 6 0． 200 2． 00 1． 25 54
5 60 0． 7 0． 225 2． 25 1． 5 56
6 80 0． 8 0． 250 2． 50 1． 75 58
2 结果与分析
2． 1 油楠基因组 DNA提取及质量检测 采用硅胶干燥的
老叶、嫩叶、树皮韧皮部 3 种试验材料。参照改良 CTAB 法
提取 DNA，结果见图 1(均为第一次提取)。由图 1 可知，嫩
叶效果最好，树皮次之，老叶最差。由于天然林中油楠树干
高大通直，枝下高较大，采取叶片难度较大，因此采用树皮提
取 DNA。鉴于树皮第一次提取含较多杂质，通过二次提取以
减少杂质，2次提取效果见图 2。
采用 1． 2%琼脂糖检测 DNA质量，结果表明，DNA条带
清晰，质量较好，二次提取杂质较少。紫外分光光度计检测
DNA纯度，OD260 nm /OD280 nm在 1． 8 ～ 2． 0，麦明 DNA 中蛋白
质、多糖等杂质污染较少，所提取 DNA较纯净。表明用改良
CTAB法二次提取的油楠 DNA质量达到 ISSＲ-PCＲ对模板的
要求。
2． 2 模板浓度对 PCＲ的影响 DNA模板浓度是影响 ISSＲ-
PCＲ反应体系的重要因素。DNA模板浓度过低会造成扩增
不完整，而 DNA模板浓度过高会导致非特异性条带增多，条
带边缘出现弥散现象，从而影响条带的判读［24 －25］。通过对
模板6个浓度梯度扩增结果的对比，发现模板浓度10 ～80 ng
均能产生扩增，模板量为 60 ～80 ng时，扩增条带开始变得模
糊，而模板量为 10 ng时，扩增条带较弱，同等扩增效果下，考
虑到节省模板的原则，最终确定 20 ng 为 DNA 模板的最适
用量。
注:M． D2000，1 ～3．老叶，4 ～6．嫩叶，7 ～9．树皮。
图 1 不同提取部位对 DNA质量的影响
2． 3 引物浓度对 PCＲ的影响 引物浓度对 ISSＲ-PCＲ扩增
结果有明显影响，引物浓度过低，易导致模板与引物结合率
低，影响扩增效率;而浓度过高则容易导致错配及引物二聚
体的出现［26］。由图 4可知，随着引物浓度升高，扩增条带逐
渐增多且清晰，引物浓度为 0． 6 μmol /L 时，扩增效果最佳;
引物浓度为0． 7 ～0． 8 μmol /L时，扩增条带有阴影，因此确定
0． 6 μmol /L为最佳引物浓度。
2． 4 dNTPs浓度对 PCＲ的影响 dNTPs是 ISSＲ-PCＲ反应
的原料，浓度过低，易造成 PCＲ产率较低，条带模糊;浓度过
高，则会导致 PCＲ 错配产生非特异性条带［23 －24，27］。由图 5
可知，dNTPs为 0． 125 ～0． 250 mmol /L时扩增条带基本一致，
dNTPs浓度为 0． 200 mmol /L 时，条带最为清晰;浓度大于
0． 200 mmol /L时，条带出现模糊或减少的现象。因此，dNTPs
最佳浓度选择 0． 200 mmol /L。
2． 5 Mg2 + 浓度对 PCＲ 的影响 Mg2 + 浓度是影响 ISSＲ-
PCＲ的重要因素，它对整个 PCＲ过程中 Taq酶活性、退火温
度及特异性条带的产生都有一定影响［28 －29］。研究表明，
Mg2 +的最佳浓度在 1． 5 ～ 2． 5 mmol /L［30 －32］。由图 6 可知，
Mg2 +浓度为 1． 25 ～2． 50 mmol /L时均有扩增产物，浓度较低
或较高时，扩增条带缺失或模糊;Mg2 +浓度为 2． 00 mmol /L
时，扩增效果最好，带型及亮度较好。因此，油楠 ISSＲ 反应
体系中最佳 Mg2 +浓度为 2． 00 mmol /L。
2． 6 Taq酶浓度对 PCＲ 的影响 Taq 酶是影响 ISSＲ-PCＲ
的重要因素，浓度过低导致扩增产物较少，浓度过高则会造
成假阳性扩增，即非特异性扩增［33 －34］。由图 7 可知，不同浓
度扩增结果不尽相同，Taq酶用量为 0． 5 ～ 1． 0 U 时，条带少
且模糊，当 Taq酶用量为 1． 5 U 时，条带清晰且扩增效率较
41 安徽农业科学 2015 年
注:1 ～12为第二次提取，13 ～24为第 1次提取。
图 2 油楠基因组 DNA
注:1 ～6分别为横板浓度 10、20、30、40、60、80 ng。
图 3 模板浓度对 PCＲ的影响
注:1 ～6分别为引物浓度 0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8 μmol /L。
图 4 引物浓度对 PCＲ的影响
注:1 ～6 分别为 dNTPs 0． 125、0． 150、0． 175、0． 200、0． 225、0． 250
mmol /L。
图 5 dNTPs浓度对 PCＲ的影响
高。因此，选择 Taq 酶 1． 5 U 为油楠 ISSＲ-PCＲ 反应体系的
最适用量。
2． 7 退火温度对 PCＲ的影响 引物退火温度是影响 PCＲ
扩增的重要因素，退火温度直接关系到引物与模板特异性结
合程度以及扩增条带的样式，退火温度过低会导致引物的非
特异性结合，温度过高则会影响引物与模板结合的稳定
性［29］。由图 8可知，退火温度过低时，非特异性条带扩增明
注:1 ～ 6 分别为 Mg2 + 浓度 1． 25、1． 50、1． 75、2． 00、2． 25、2． 50
mmol /L。
图 6 Mg2 +浓度对 PCＲ的影响
注:1 ～6分别为 Taq酶 0． 50、0． 75、1． 00、1． 25、1． 50、1． 75 U。
图 7 Taq酶对 PCＲ的影响
注:1 ～6分别为退火温度 48、50、52、54、56、58 ℃。
图 8 退火温度对 PCＲ的影响
显，而温度过高时，特异性强，但会造成一些目的条带的缺
失。综合考虑，选择 54 ℃为最佳退火温度。
2． 8 ISSＲ引物的筛选 对 100 条随机引物进行单模板初
筛，选出能扩增出条带的引物，在此基础上，采用多模板复
筛，选出多态性高、重复率好、特异性强的引物共 13 条，分别
为 U807、U808、U814、U825、U827、U841、U842、U860、U864、
U880、U886、U888、U889。引物 U808 对部分油楠 DNA 的 IS-
5143卷 26期 吴忠锋等 油楠基因组 DNA提取·ISSＲ反应体系优化及引物筛选
SＲ扩增图谱见图 9，引物具体信息见表 2。
注:1 ～48为样本 1 ～48号。
图 9 引物 U808对部分油楠 DNA的 ISSＲ扩增图谱
表 2 ISSＲ引物序列及退火温度
引物 引物序列(5 －3) 退火温度∥℃
U807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 50． 0
U808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 53． 0
U814 CTC TCT CTC TCT CTC TA 49． 0
U825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 49． 5
U827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 53． 0
U841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 53． 5
U842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG 50． 0
U860 TGT GTG TGT GTG TGT GＲA 50． 5
U864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG 49． 5
U880 GGA GAG GAG AGG AGA 49． 0
U886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 54． 5
U888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 53． 0
U889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 52． 5
3 讨论
DNA的提取质量是 PCＲ 成功与否的关键。目前，DNA
提取材料一般选择嫩叶［35 －36］，野外采集叶样时，由于林分中
植株的枝下高较高，叶片采集难度大、成本高，将树皮韧皮部
作为试验材料能很好地解决该问题。树皮取样一般多用于
树皮内含物测定［37］，以树皮为试验材料研究遗传多样性报
道较少［38］，天然林取样中尚未见报道。油楠类似于玩拗植
物，植物组织内富含多糖及次生物质，DNA提取与纯化难度
较大。结合多种 DNA提取方法，在提取液中加入 β-巯基乙
醇、PVP以及高浓度 NaCl 提供的高盐环境能有效减少酚类
及多糖［39］，对试验材料进行二次提取，可有效降低杂质含
量，但会造成 DNA的损耗，考虑到油楠组织内多糖及次生物
质较多以及天然林中高大乔木采取嫩叶样品较为困难，用树
皮作为 DNA提取的试验材料可为其他树种天然居群遗传多
样性研究提供新思路。
ISSＲ标记可有效揭示物种种群内和种群间遗传多样性
差异，在分析其系统分化规律、遗传结构、基因流动以及种源
区划上具有重要意义［40］。目前有关 ISSＲ-PCＲ 反应体系优
化方法的报道较多，包括单因素法［41 －42］、正交试验法［43］以及
正交试验设计与单因素分析相结合的方法［44］，单因素法能
直观快速得到最佳反应体系。此外，为保持该试验结果的一
致性，PCＲ基因扩增在同一台 PCＲ仪上进行。该研究对 IS-
SＲ-PCＲ各反应因子进行研究和筛选，建立了最佳反应体系，
并筛选出 13条 ISSＲ引物，为进一步研究油楠遗传多样性及
种质资源评价利用等方面提供重要参考依据。
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( 下转第 35页)
61 安徽农业科学 2015 年
2． 4 稻米品质 从表 4可知，水管较旱管各品种食味值、直
链淀粉含量均有不同程度的增加，而蛋白质含量却减少，说
明灌水管较旱管对改善稻米品质方面有良好作用。
表 4 不同灌溉方式下不同品种的品质测定结果
品种
灌溉
方式
食味值
%
直链淀粉
%
蛋白质
%
水分
%
徐稻 3号 旱管 64 20． 1 7． 9 10． 8
水管 68 19． 7 7． 4 10． 7
徐优 502 旱管 58 20． 8 8． 9 12． 1
水管 61 20． 4 8． 4 12． 5
郑旱 277(CK) 旱管 51 22． 2 10． 2 11． 0
水管 53 21． 6 9． 4 10． 0
3 结论
2012、2013年 2年试验结果表明，不论是早熟品种，还是
中熟的常规稻和杂交粳稻，旱种水管较旱种旱管灌溉方式均
促进了水稻品种营养器官的生长，加快了生育进程，相应缩
短了生育期;水管促进分蘖生长，增加了群体数量，但减少了
群体成穗率;水管促进了穗部的发育，使单穗颖花数、结实率
和千粒重均有不同程度的增加。同时，水管由于促进了子粒
的充实，亦改善了稻谷品质。试验还表明，如基本苗数多，生
长过旺盛，群体过大，则出现分蘖率高，群体成穗率低，单穗
颖花量减少的现象。所以，直播稻选用品种时要合理安排播
种量，大群体田块够苗即断水适当烤田，控旺促成穗，促大
穗、促灌浆、促成熟。
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