全 文 ：一 166 8 一 药物分析杂志 C hin J P ham rAn al 20() 6 , 2 6 ( 1 1 )
R P 一 H P L C 法测定不同栽培品种粉葛中
葛根素 · 、 大豆昔和大豆昔元的含量
周红英` , 王建华” , 严凤云 2
( 1
. 山东农业大学农学院药用植物研究室 ,泰安 27 10 18 ; 2 . 山东省东明县人民医院药剂科 ,东明 2 74 500)
摘要 目的 :采用反相高效液相色谱方法测定栽培粉葛中葛根素 、 大豆昔和大豆昔元含量 ,为栽培粉葛质量控制提供方法学
参考 。 方法 : 采用 iD a m on isl C l :柱 (巧 0 m m x 4 . 6 m m , 5 协m ) , 流动相为 A 一 B 二元体系 , A 相为甲醇 , B 相为 l% 醋酸 。 梯度洗
脱程序为 : o 一 1 3 m i n ,保持 25% A ; 13 一 15 m in , A 线性增至 40 % ; 15 一 30 m i n , A 线性增至 60% ; 30 一 4 0 m i n , A 线性降至 2 5 % ,
洗脱时间为 40 nr in 。 流速为 1 m L · m in 一 ’ , 进样量 5 林 L 。 柱温为室温 ,检测波长 250 n m 。 结果 : 葛根素 、大豆昔和大豆昔元分
别在 0 . 2 1 一 1 . 89 , 0 . 05 一 0 . 4 5 , 0 . 06 5 一 0 . 58 5 林 g范围内呈良好线性关系 ;相关系数 r 分别为 0 . 999 7 , 0 . 99 96 , 0 . 99 96 。 其平均
回收率在 9 . 6% 一 10 . 9% 范围内 , R SD 均小于 2 % 。 在测定的 3 个样品中 ,小叶粉葛中葛根素 、大豆昔和大豆昔元含量均最
高 。 结论 : 建立的方法简便 、准确 ,分离效果好 , 可以用于粉葛质量控制 。
关键词 : R P 一 H P LC ;粉葛 ; 葛根素 ; 大豆昔 ;大豆昔元
中图分类号 : gR l7 文献标识码 : A 文章编号 : 02 54 一 17 9 3 ( 20 6 ) 1 一 1668 一 03
R P 一 H P L C d e t e r m in a t i o n o f P u e r a r i n , d a id z in a n d d a i d z e i n in
R a d i x P u e r a r i a e T h o m s o in i o f d i fl 沁r e n t c u l t i v a t e d s P e c i e s
z H o u H o n g 一 y i n g ` , w A N G J i a n 一 h u a ” , Y A N F e n g 一 y u n Z
( 1
.
1刀 l〕o rat o尽 o f M e d i e i n a l P l a n t , C o l le g e o f A gor n o m y , S han d o n g A颤 e u l t u r al U n iv e r s iyt , aT i ’ a n 27 10 18 , C h i n a ;
2
.
D e p a rt m e n t o f P h
a
mr
a e y
,
P e o p l e
, 5
H
o s p i tal o f D o n gln i
n g C o u n yt
,
D
o n脚 i n g 27 4 5X() , C h in a )
A b s t r a e t o bj e c t i v e : A n RP 一 H P LC m e th o d w a s a p P l ie d t o d e t e mr i
n e P u e r a ir n
,
d a id z i n a n d d a id z e i n i n R a d i x P u
-
e r a ir a e T h o m s o n ii o f d ife
r e n t e u l ti v a t e d s p e e i e s
, a n d t o d e v e l o p a g o o d m e t h o d t o e o n t or l t h e q u a l i yt fo r R a d i x P u e r
-
a ir a e T h o m s o n i i
.
M
e t h o d s
: A n R P 一 H PL C m e t h o d w a s a p p l i e d w i t h a D i a m o n s i l C 18 e o l u m n ( 15 0 m m x 4
.
6 m m
,
5 林m ) b y g r a d i e n t e l u t i o n u s i n g m e t h a n o l 一 l % a e e t i e a e id s o l u t i o n a s t h e m o b i l p h a s e ( o 一 1 3 m i n , 2 5 : 7 5 ; 1 3 一 15
m i n
,
4 0
:
6 0 ; 15 一 3 0 m i n , 6 0 : 4 0 ; 3 0 一 4 0 m i n , 2 5 : 7 5 )
.
hT
。 fl o w r a t e w a , 1 m L
·
m i n
一 ’ . T h。 d e t e e ti v 。 w a v e l e n gt h
w a s 2 5 0 n m
.
hT
e e o l u m n t e m p e
r a t u er w a s 2 5 ℃ . hT e s a m p l e inj e e ti o n v o l u m e w a s s 林 L . R e s lu st : hT er e e o m p o u n d s
。h o w e d g o o d l i n e a ir ty ( r > 0
.
9 9 9 5 ) i
n a d e t e e t e d e o n e e n t ar t i o n ar n g e
.
Th e a v e asr
e r e e o v e可 ar te w a s i n t h e r a n g e o f
9 9
.
6% 一 10 0
.
9%
.
T h e R SD o f p er e i s i o n w a s Ie s s th a n Z%
.
hT
e e o n t e n ts o f p u e r a ir n
,
d a id z i n a n d d a id z e i n i n X i
-
a o y e 凡 n罗 w e er th e h i g h e s t i n t h e th er e d e t e mr i n e d s p e e i e s . C o n d u is o n : hT e m e t h o d 15 s im lP e , a e e u ar t e an d e an
b e u s e d ro e o n t r o l th e q u a l i t y fo r R a d i x P u e ar ir a e hT
o m , o n i i
.
K e y ow dr
s : R P 一 H P LC ; R a d i x P u e ar ir a e hT
o m s o n i i ; Pu e ar ir n ; d a i d z i n : d a id
z e i n
粉 葛为 豆科植物 甘葛藤 uP e ar ir a : h0 0 0n i
B e nt h
. 的干燥根 , 自古与野葛 同作 中药葛根用 。
20 05 年版中国药典首次将粉葛作为分列中药材记
载川 。 粉葛中含有的葛根素 、 大豆昔和大豆昔元等
异黄酮类化合物具有降血压 、 扩张冠状动脉等多种
生物活性 。 粉葛富含淀粉 , 现已 开发出葛淀粉系列
多种保健食品 。 目前 ,粉葛的栽培面积不断扩大 ,并
出现了许多栽培品种 。 葛根中葛根素 、 大豆昔和大
豆昔元的 H P L C 法含量测定已有报道否’ 一 4」 , 不同栽
培品种粉葛中葛根素 、大豆昔和大豆昔元的含量测
定研究未见报道 。 本实验对文献方法洗脱程序进行
了改进 ,提高了分离度 , 缩短了检测 时间 ,并测 定了
* 通讯作者 T e l : ( 0 53 8 ) 8 2 4 80 76 , 13 7 0 5 3 89 9 6 3 ; E 一 m ia l : Jh w a n自h @ 16 3 . e o m
药物分析杂志 C hin J P harm n Aa 2 l0) ( 6
,
2 6 ( 1 1 ) 一 1 66 9 一
山东泰安 3 个栽培 品种粉葛中葛根素 、大豆昔和大
豆普元含量 。
1 仪器与试药
W at er s 高效液相色谱仪 , 9% 型二极管阵列检
测器 , 知 d im e n s i o n a l 微量进样器 , M il l e n n i u m , 2 色谱
工作站 , 0 . 45 卜m 微孔滤膜 ( W at e sr 公司 ) 。 甲醇为
色谱纯 ,冰醋酸为分析纯 ,水为超纯水 。 对照品葛根
素 (批号 : 20 209 )和大豆普元 (批号 : 2 0 01 01 ) 购 自
中国药品生物制品检定所 , 大豆昔购 自美国 iS g m a
公司 (纯度 ) 95 . 5% ) 。
粉葛样品采自山东泰安 , 经山东农业大学药用
植物研究室王建华教授鉴定为粉葛的不同栽培品
种 ,根据其叶的大小或根的颜色暂拟定为大叶粉葛 、
小叶粉葛和黄金粉葛 。
2 方法与结果
2
.
1 溶液制备
2
.
1
.
1 对照品溶液 精密称取葛根素 、大豆昔和大
豆昔元对照品适量 ,加 甲醇溶解 , 准确定容 , 配制成
浓度分别为 0 . 2 1 , 0 0 5 0 , 0 . 0 6 5 9 · L 一 ’ 的混合溶液 ,
用 0 . 45 林m 微孔 滤膜过滤 , 续滤液作为 对照 品溶
液 。
2
.
1
.
2 样品溶液 取各样品粗粉 (过 65 目筛 , 50
℃烘干至恒重 )约 0 . 1 9 ,精密称定 ,置 or o m L 三角
烧瓶中 , 精密加人甲醇 2 0 m L , 称重 , 超声波 ( 功
率 4 0 k H z , 频率 1 6 0 w )振荡提取 3 0 m i n , 冷却
至室温 , 用 甲醇补 足重量 , 离心 ( 转速 I 0 0 0 O r ·
m i n
一 ’
)沉淀 10 m i n , 取上清液 ,经 0 . 4 5 林m 微孔
滤膜滤过 , 续 滤液 作为 样 品 溶液 , 4 ℃ 冰箱 保
存 。 每种供试药材同法制备 3 份样品溶液 。
2
.
2 色谱条件 D i a m o n s i l C l。 柱 ( 15 0 m m x 4 . 6
m m
,
5 林m ) ,采用二元梯度洗脱 , A 相为甲醇 , B 相为
l % 醋酸 。 洗脱程序为 : o 一 13 m in , 保持 25 % A ; 13
一 15 m i n , A 线性增至 4 0% ; 15 一 3 0 m i n , A 线性增
至 60 % ; 30 一 4 0 m in , A 线性降至 25 % , 洗脱时间为
4 0 m i n
。 流速为 1 m L · m i n 一 ’ 。 进样量 5 协 L 。 柱温
为室温 。 检测波长 2 50 n m 。 每次运行结束后 , 以初
始流动相平衡色谱柱 30 m in 。 在该条件下 , 对照品
与样品的色谱图见图 1 。
2
.
3 线性关系考察 分别准确吸取对照品溶液 1 ,
3
,
5
,
7
,
9 林L ,进样 ,在 “ 2 . 2 ” 项色谱条件下测定峰面
积积分值 , 以峰面积积分值 Y 为纵坐标 ,进样量 X
(此 )为横坐标进行线性回归 ,得葛根素 、大豆昔 、 大
豆昔元的回归方程分别为 :
2 5 七/ m i n
图 l
F ig l
B
混合对照 品 ( A )和 1 号样品 ( B) 色谱图
Ch or atn
o盯 a m s Of er fe er 二 e su bst an e e s ( A ) an d s am lP e N o . l ( B )
1
. 葛根素 ( p u e o n ) 2
. 大豆昔 ( d a id z i n ) 3 . 大豆昔元 ( d a id z e i n )
Y = 3 9
.
5 7 X 一 1
.
1 13 厂 = 0
.
9 9 9 7
Y = 19 1
.
3 X 一 0
.
7 6 5O r = 0
.
9 9 9 6
Y = 5 3
.
4 4 X 一 0
.
5O9 5 r = 0
.
9 9 9 6
线性范围分别为 0 . 2 1 一 1 . 8 9 , 0 . 0 5 一 0 . 4 5 , 0 . 0 6 5 -
0
.
5 8 5 林9 0
2
.
4 精密度考察 在 “ 2 . 2 ” 项色谱条件下 ,精密取
对照品溶液 5 林 L 进样测定 ,计算峰面积积分值 。 5
次进样 , 测得葛根素 、 大豆昔和大豆昔元的峰面积积
分值的 R SD 分别为 0 . 7 % , 0 . 9% , 0 . 6% 。 结果表明
各色谱峰的峰面积积分值比较稳定 。
2
.
5 稳定性考察 取 1 号样品溶液 , 于 0 , 2 , 4 , 8 ,
16 h 分别进样 5 卜L ,在 “ 2 . 2 ” 项色谱条件下 ,分析测
定 ,计算葛根素 、大豆昔和大豆昔元的峰面积积分值
的 RS D 分别为 2 . 1% , 2 . 3% , 2 . 5% 。 可见样品溶液
在 16 h 内性质稳定 。
2
.
6 重复性试验 精密称取 1 号样品粉末 5 份 ,
约 0 . 1 9 , 照 “ 2 . 1 . 2 ” 项下方法制备样品溶液并测
定 ,结果葛根素 、 大豆昔和大豆昔元的 RS D 分别为
0
.
9%
,
1
.
1%
,
1
.
2%
。
2
.
7 回收率考察 精密称取已测知含量的 1 号样
品粉末约 0 . 1 9 ,精密加人对照品溶液 1 m (L 相当于
葛根素 2 10 林g 、大豆普 5 0 林g 、 大豆昔元 6 5 林g ) , 照
“
2
.
1
.
2
” 项下方法制备回收率测定用样品溶液 , 平
行 5 份 , 在 “ 2 . 2 ” 项色谱条件下测定 。 5 次平均回收
率及 R SD 分别为葛根素 1 0 . 1% , 1 . 0% ; 大豆昔
10
.
9 %
,
1
.
3% ;大豆昔元 9 . 6 % , 1 . 1% 。
一 1 67 0一 药物分析杂志 C h in JPh arm A n al 2 06 , 2 6 ( 1 1 )
2
.
8 样品测定 精密吸取样品溶液 5 协L , 注人液 份样品溶液 ,采用外标法 ,按干品计算样品中该 3 种
相色谱仪 ,在 “ 2 . 2 ” 项色谱条件下 , 测定样品中葛根 化合物的平均百分含量 ,结果见表 1 。
素 、大豆昔和大豆昔元的含量 , 每种供试药材测定 3
表 1 样品的分析结果 ( % , n = 3)
T a b 1 A n al 州cal r e s ul st of ht e sam P le
编号 ( n u m b e r ) 样品 ( s am p l e ) 葛根素 ( p u e anr n ) 大豆昔 ( d` 山i n ) 大豆昔元 ( da i山e i n )
l 大叶粉葛 ( D a y e Fe n罗 ) 0 . 9 8 ( 1 . 6 ) 0 . 3 8 ( 2 . 6 ) 0 . 0 33 ( 3 . 2 )
2 小叶粉葛 ( X ivao e Fe n罗 )
’
2
.
0 3 ( 1
.
9 ) 0
.
47 ( l
,
5 ) 0
.
2 5 ( 1
.
7 )
3 黄金粉葛 ( H u an 引 i n F e n g e ) 0 . 5 3 ( 3 . 0 ) 0 . 四5 ( 2 5 ) 0 . 05 5 ( 2 . 6 )
注 括号内数据为 R SD
N o t e : R SD 元n p ar e n t h e s i s
3 讨论
3
.
1 比较了甲醇 一 1% 醋酸 z[] 、 甲醇 一 水 3j[ 、 乙睛
一 0
.
02 m ol
·
L
一 ’ 磷酸二氢钾 [’J 3 种溶剂系统 。 发现
在本实验色谱条件下 ,样品各物质峰达到 良好的基
线分离 ,峰形良好 ,且基线漂移幅度小 。 经方法学考
察 , 表明该方法具有简便 、 准确和快速的优点 , 可以
用于粉葛药材中葛根素 、 大豆昔和大豆昔元的含量
测定 ,为粉葛药材的质量评价奠定基础 。
3
.
2 由表 1 可以看出 ,测定的 3 个样品中 , 小叶粉
葛中葛根素 、 大豆普和大豆昔元的含量高于大叶葛
和黄金葛中该 3 种化合物的含量 。
参考文献
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C ih n J P无口r7n Aan l( 药物分析杂志 ) , 2 0 (X ) , 20 ( 4 ) : 2 23
(本文于 2X() 5 年 1 1 月 2 3 日收到 )