全 文 ：收稿日期:2013-01-08
基金项目:安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ2012B109)
作者简介:王春景(1972-)，男，硕士，副教授，主要从事天然药用植物资源的开发利用研究;Tel:0552-3175292，13695525872，E-mail:wchjro-
sa@ 163. com。
鸡眼草抗氧化活性部位的筛选及其黄酮和总酚含量
王春景，胡小梅，张 鼎，胡爱武
(蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233030)
摘要 目的:对鸡眼草高抗氧化活性萃取部进行筛选，测定其黄酮和总酚含量。方法:采用超氧阴离子( )、
羟自由基(·OH)和 DPPH·清除实验以及还原能力实验评价鸡眼草不同极性萃取部的抗氧化能力，分别用
NaNO2-Al(NO3)3 -NaOH比色法和 Folin-Ciocalteu 试剂法测其黄酮与多酚含量。结果:鸡眼草各萃取部清除·OH
能力的强弱顺序为乙酸乙酯部位 ＞正丁醇部位 ＞ VC ＞氯仿部位 ＞石油醚部位;对 的清除结果为乙酸乙酯部位和
正丁醇部位的清除效果与 VC 相当，氯仿部位和石油醚部位的清除效果差于 VC;各萃取部位对 DPPH·自由基的清
除能力均弱于 VC，石油醚部位和氯仿部位的 IC50均显著高于乙酸乙酯部位和正丁醇部位(P ＜ 0. 05);还原能力的
大小顺序为 VC ＞乙酸乙酯部位 ＞正丁醇部位 ＞氯仿部位 ＞石油醚部位。乙酸乙酯部位的黄酮和总酚含量均显著
高于正丁醇部位(P ＜ 0. 05)。结论:鸡眼草抗氧化性最强的萃取部位是乙酸乙酯部位，其次为正丁醇部位，石油醚
部位最差，黄酮和多酚类可能是其抗氧化活性成分。
关键词 鸡眼草;自由基清除;黄酮;多酚
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)05-0868-04
鸡眼草 Kummerowia striata(Thunb. )Schindl.
俗称人字草、掐不齐，是豆科鸡眼草属的一年生草本
植物，生长于田野、路边、山地、丘陵、林下，资源较为
丰富。我国民间用药时，鸡眼草可全草入药，具清
热、解毒、利湿、消肿等功效。已有研究表明鸡眼草
具有抗炎镇痛〔1，2〕、止血〔3〕、抗氧化〔4〕、抑制白介素-
5〔5〕等生物活性，治疗婴幼儿慢性腹泻效果显著〔6〕，
对 IgA肾病也有一定的治疗作用〔7〕。本实验初次研
究了鸡眼草乙醇提取物不同极性萃取部的自由基清
除能力，并对其黄酮和总酚含量进行了测定，以期筛
选出其高抗氧化活性萃取部，为其抗氧化活性成分
的追踪提供实验依据，为开发天然功能性保健食品
或生物制品及天然抗氧化剂的药用植物源研究提供
理论依据。
1 材料与仪器
1. 1 药物与试剂 鸡眼草采自蚌埠市郊，经安徽
师范大学生命科学学院周守标教授鉴定为豆科植物
鸡眼草 Kummerowia striata(Thunb. )Schindl. ，取鸡
眼草地上部分 65 ℃烘干，粉碎，70%乙醇回流提取
8 h，过滤，滤渣重新加 70%乙醇回流提取后过滤，共
3 次，合并 3 次滤液，旋转蒸发器减压蒸干得浸膏，
将浸膏用温蒸馏水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸
乙酯、正丁醇萃取，每部位重复萃取 3 次，合并各部
位萃取液，减压蒸干，得鸡眼草醇提物的不同极性萃
取物;芦丁(北京恒元启天化工研究所);没食子酸
(中国药品生物制品检定所);抗坏血酸(VC)、邻菲
啰啉、硫酸亚铁铵、L-蛋氨酸、氯化硝基四氮唑蓝
(NBT)、核黄素、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)、
三氯乙酸、铁氰化钾、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Fo-
lin-Ciocalteu试剂等均为国产分析纯。
1. 2 主要仪器 UV-1800 紫外 /可见分光光度计
(北京瑞利分析仪器公司);Ｒ201D 旋转蒸发器(陕
西泰康生物科技有限公司);SHB-ⅢA 循环水真空
泵(陕西泰康生物科技有限公司)。
2 方法
2. 1 抗氧化性实验
2. 1. 1 羟自由基清除实验〔8〕:向反应体系依次加
入 2 mL pH = 7. 4 的 Tris-HCl 缓冲溶液、10 mmol /L
邻菲啰啉 0. 3 mL、1 mL不同浓度样品液、10 mmol /L
硫酸亚铁铵 0. 3 mL、0. 7 mL 1% H2O2，用超纯水分
别定容至 10 mL，37 ℃水浴 1 h，510 nm测各样品光
密度 D(λ)样，同法测加 H2O2 但不加提取液的光密
度 D(λ)损和 H2O2 与提取液均不加的光密度 D
(λ)未损，计算清除率。
清除率(%)=
D(λ)样 － D(λ)损
D(λ)未损 － D(λ)损
× 100%
2. 1. 2 清除超氧阴离子实验〔9〕:向各试管加入 3
mL pH = 7. 8 磷酸缓冲液、0. 75 mmol /L NBT、0. 1
mmol /L EDTA、130 mmol /L L-蛋氨酸、0. 2 mmol /L
核黄素各 0. 6 mL、各浓度待测样品液 1 mL，40 W荧
光灯室温光照 15 min，560 nm 处测样品光密度 D
(λ)样，不加样品液的光密度 D(λ)0，计算清除率。
·868· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月
清除率(%)=［1 －
D(λ)样
D(λ)0
］× 100%
2. 1. 3 清除 DPPH·自由基实验〔10〕:将 2 mL 各浓
度样品液与 2 mL浓度为 0. 2 mmol /L 的 DPPH·甲
醇溶液混合，暗处室温反应 30 min，517 nm 处测光
密度 D(λ)样，同法 2 mL甲醇与 2 mL各浓度样品液
混合测样品本底光密度 D(λ)底，2 mL 甲醇与 0. 2
mmol /L的 DPPH·溶液 2 mL 混合测空白光密度 D
(λ)0。
清除率(%)=
D(λ)0 －［D(λ)样 － D(λ)底］
D(λ)0
× 100%
2. 1. 4 还原能力实验〔11〕:各管中分别加入 3 mL
pH =6. 6 的磷酸缓冲液、2. 5 mL样品液、2. 5 mL 1%
铁氰化钾，摇匀后 50 ℃水浴 20 min，快速冷却，加
2. 5 mL 10%三氯乙酸，离心 10 min(3 000 r /min)，
取 5 mL各上清液，分别加 1 mL 0. 1%的三氯化铁，
超纯水 4 mL，放置 10 min后，700 nm测光密度。
2. 2 黄酮和总酚含量测定
2. 2. 1 黄酮含量测定〔12〕:将芦丁配成 0. 1 mg /mL
的标准液，吸取不同体积的芦丁标准液配成系列浓
度，分别加入 5%的 NaNO2 0. 3 mL，摇匀静置 6 min
后，加 0. 3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀、静置 6 min，加
4 mL 4%的 NaOH，超纯水定容至 10 mL，摇匀、静置
15 min 后，510 nm 测各光密度，通过回归分析建立
标准曲线 D(λ)= 12. 22C + 0. 0046，Ｒ2 = 0. 9983。
同样方法测样品液光密度，利用所得标准曲线计算
黄酮含量。
2. 2. 2 总酚含量测定〔12〕:将没食子酸标准品配成
0. 1 mg /mL的标准液，用此标准液配成系列浓度梯
度，分别加 0. 5 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀后 5
min加 1. 5 mL 17% Na2CO3 溶液，超纯水定容至 10
mL，75 ℃水浴反应 10 min，选择波长 760 nm测定光
密度，将没食子酸浓度和光密度进行线性回归，得标
准曲线 D(λ)= 0. 1045C + 0. 0293，Ｒ2 = 0. 9965。样
品总酚含量利用同样方法测定，根据此标准曲线计
算。
2. 3 统计学处理 利用 SPSS 12. 0 进行统计分析，
两样本间采用 t 检验，多样本间用单因素方差分析
并进一步用 LSD 法进行组间两两比较，以 α = 0. 05
作为检验差异显著性水平。
3 结果
3. 1 各萃取部抗氧化实验结果
3. 1. 1 清除羟自由基(·OH)能力:结果如图 1、表
1 所示，鸡眼草 4 个不同极性萃取部位对·OH的清
除能力存在差异，最强为乙酸乙酯部位，其次为正丁
醇部位，均强于阳性对照 VC，石油醚部位和氯仿部
位弱于 VC，石油醚部位最弱。IC50大小顺序为乙酸
乙酯部位 ＜正丁醇部位 ＜ VC ＜氯仿部位 ＜石油醚
部位，各组间差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。
3. 1. 2 超氧阴离子( )清除效果:结果如图 2、表
1 所示，鸡眼草四个萃取部位对 均有一定的清除
效果，且随着浓度的增加清除率逐渐增加，实验最高
浓度时清除率大小顺序为乙酸乙酯部位 ＞正丁醇部
位 ＞氯仿部位 ＞石油醚部位。乙酸乙酯部位、正丁
醇部位与 VC 相比，三者之间的 IC50差异无统计学意
义(P ＞ 0. 05)，说明乙酸乙酯部位和正丁醇部位清
除 的效果与 VC 相当;石油醚部位的 IC50显著高于
氯仿部位(P ＜ 0. 05)，但二者的 IC50均显著高于 VC
(P ＜ 0. 05)，表明氯仿部位和石油醚部位对 清除
效果不及 VC。
图 1 鸡眼草各萃取部位对羟自由基
的清除效果(珔x ± s，n =3)
图 2 鸡眼草各萃取部位对超氧阴离子
的清除效果(珔x ± s，n =3)
3. 1. 3 DPPH·自由基清除效果:结果如图 3、表 1
所示，VC 清除 DPPH·自由基的能力强于鸡眼草各
萃取部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的清除能力
基本相同，强于石油醚部位和氯仿部位，本实验最高
浓度 0. 2 mg /mL 时，乙酸乙酯部位、正丁醇部位的
清除率分别为 87. 83%、87. 51%，表明其对 DPPH·
的清除能力较强。IC50比较，乙酸乙酯部位和正丁
醇部位差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，均显著低于
氯仿部位(P ＜ 0. 05)，氯仿部位 IC50显著低于油醚
部位(P ＜ 0. 05)。
·968·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月
表 1 鸡眼草各萃取部位对自由基的半清除浓度
(mg/mL，珔x ± s，n =3)
羟自由基
超氧阴离子
自由基
DPPH·自由基
石油醚部位 1. 82 ± 0. 09e 1. 61 ± 0. 18c 0. 36 ± 0. 00c
氯仿部位 1. 30 ± 0. 07d 0. 40 ± 0. 02b 0. 07 ± 0. 00b
乙酸乙酯部位 0. 50 ± 0. 62a 0. 27 ± 0. 01a 0. 04 ± 0. 00a
正丁醇部位 0. 62 ± 0. 02b 0. 26 ± 0. 00a 0. 04 ± 0. 00a
抗坏血酸(VC) 0. 75 ± 0. 02c 0. 28 ± 0. 01a －
注:上标不同字母的同列数据表示差异具有显著性，P ＜ 0. 05;
“ －”未计算，因其 IC50远低于实验最低浓度
图 3 鸡眼草各萃取部位对 DPPH·自由基
的清除效果(珔x ± s，n =3)
3. 1. 4 还原能力测定结果:鸡眼草各萃取部位还
原能力均低于 VC，氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁
醇部位还原能力相当，实验最高浓度时其平均光密
度值分别为 0. 548、0. 610、0. 570，均高于石油醚部
位。见图 4。
图 4 鸡眼草各萃取部位的还原能力(珔x ± s，n =3)
3. 2 黄酮和总酚含量 选取鸡眼草对自由基清除
效果较好的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行了黄酮
和总酚含量的测定，结果表明，鸡眼草乙酸乙酯萃取
部位黄酮和总酚的含量均显著高于正丁醇萃取部
位。见表 2。
表 2 鸡眼草提取物中黄酮和总酚含量
(mg/g，珔x ± s，n =3)
黄酮含量 总酚含量
乙酸乙酯萃取部位 225. 35 ± 3. 80a 182. 97 ± 2. 31a
正丁醇萃取部位 234. 62 ± 3. 64b 149. 76 ± 2. 86b
注:上标不同字母的同列数据表示差异具有统计学意义，P ＜
0. 05
4 讨论
机体在代谢过程中会产生各类活性氧，如超氧
阴离子自由基、羟自由基、单线态氧等，这些自由基
如不能及时清除，就会影响细胞正常生理功能的发
挥，损伤组织和器官，从而导致多种疾病或加速机体
的衰老〔13〕。很多研究表明一些植物提取物具有较
强的自由基清除作用，故筛选具有较强抗氧化活性
的天然药用植物资源越来越受到研究者的关
注〔10，12〕。
本实验研究表明鸡眼草醇提物的 4 个不同极性
萃取部位均具有一定的抗氧化作用，其中乙酸乙酯
和正丁醇萃取部位对·OH 的清除能力显著超过了
阳性对照物 VC，对 的清除效果与 VC 相当，差异无
统计学意义，清除 DPPH·自由基的能力和还原能
力弱于 VC，4 个萃取部位中，乙酸乙酯部位和正丁
醇部位对 DPPH·的清除能力和还原能力要强于氯
仿部与石油醚部位。已有研究表明鸡眼草乙醇、丙
酮和乙酸乙酯 3 种不同溶剂提取物中，乙酸乙酯提
取物表现出的抗氧化能力最优异〔4〕，本实验结果与
其一致。鸡眼草 70%乙醇提物的乙酸乙酯萃取部
抗氧化性最强，正丁醇部次之，石油醚部活性最弱。
药用植物天然产物或次生代谢物含有多糖、萜
类、生物碱、黄酮、酚酸等多类化合物，大量研究表明
黄酮类和多酚类均有较强的抗氧化活性〔13，14〕。本
研究证实鸡眼草乙酸乙酯和正丁醇萃取部位的黄酮
和总酚含量均较高，且乙酸乙酯部位这两类物质的含
量均显著高于正丁醇部位，与它们所表现的抗氧化能
力是一致的，提示其抗氧化活性物质可能为黄酮类和
多酚类，可考虑进一步从其乙酸乙酯和正丁醇萃取部
位分离相关单体化合物，从而追踪其具体的抗氧化活
性成分，以促进天然抗氧化产品的开发和鸡眼草的利
用。
参 考 文 献
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收稿日期:2013-10-14
基金项目:国家自然科学基金(31200261);山东省自然科学基金(ZＲ2012CQ029)
作者简介:杨赛飞(1989-)，男，在读硕士研究生，专业方向:药用植物资源开发与利用;Tel:15966019375，E-mail:yangsaifei1989128@
163. com。
* 通讯作者:王建华，Tel:0538-8242226，E-mail:sdauwangjh@ 163. com。
·制剂与质量·
响应面法优化离子液体微波提取虎杖中 5 种蒽醌类成分
杨赛飞，孙印石，王建华*
(山东农业大学农学院 /作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 271018)
摘要 目的:应用响应面法优化离子液体微波辅助提取虎杖中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素
甲醚的提取工艺。方法:在单因素试验基础上，根据中心组合试验设计原理采用 3 因素 5 水平的响应面分析方法
进行工艺优化，以 5 种蒽醌化合物总提取率为指标，进行综合评价。结果:优选出虎杖 5 种蒽醌类成分的最佳提取
工艺为:加入 40 倍 0. 6 mol /L C8［MIM］Br，微波提取功率 200 W，提取温度 31 ℃，提取时间 8 min;此工艺下 5 种蒽
醌类成分总提取率为 11. 69 mg /g，理论值为 11. 74 mg /g。结论:该工艺提取时间短，操作简单，绿色环保，是快速高
效提取虎杖蒽醌类物质的理想方法。
关键词 响应面法;离子液体;微波辅助提取;虎杖;蒽醌类成分
中图分类号:Ｒ286 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)05-0871-05
Optimization of Ionic Liquid Based Microwave Assisted Extraction of Five Anthraquinones
from Polygonum cuspidatum by Ｒesponse Surface Method
YANG Sai-fei，SUN Yin-shi，WANG Jian-hua
(State Key Laboratory of Crop Biology /College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China)
Abstract Objective:Ionic liquid based microwave-assisted extraction(ILMAE)was developed for the effective extraction of five
anthraquinones namely aloeemodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion from Polygonum cuspidatum. Methods:Experimental fac-
tors and levels were firstly selected by one-factor test. According to the central composite experimental design principle，the response
surface methodology with three factors and five levels was adopted for comprehensive assessment by total extraction yield of five anthra-
quinones as a target. Ｒesults:The optimized parameters of MAE were:0. 6 mol /L［C8MIM］Br，solvent to solid ratio of 40∶ 1，power of
200 W，temperature of 31 ℃and extraction time of 8 min. Under the optimal conditions，this approach gained total extraction yield of five
anthraquinones 11. 69 mg /g，while the predicted total extraction yield was 11. 74 mg /g. Conclusion:The research indicates ILMAE is an
efficient，rapid，environment friendly and simple sample preparation technique to five anthraquinones from Polygonum cuspidatum.
Key words Ｒesponse surface methodology;Ionic liquid;Microwave assisted extraction;Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ;
·178·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月