全 文 ：第 29卷　第 4期
1999年　 11　月
植　物　病　理　学　报
AC TA PHYSOPATHOLO GICA SIN ICA
Vo l. 29　 No. 4
Nov .　 1999
豆薯细菌性角斑病的病原鉴定*
许志刚 1　姬广海 1　魏亚东 2
( 1南京农业大学植保系 , 南京 210095; 2天津动植物检疫局 , 天津 300457)
摘要　在安徽滁州的豆薯叶片上发现一种由细菌侵染引起角斑症状的病害 ,从角斑上分离到具有致
病性的非荧光的杆状细菌 ,菌株的表型特征、细菌学特征、 LO PAT试验和生理生化试验表明该细菌
与丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae van Hall)相似 , BIOLOG系统鉴定结果与丁香假单胞菌豌豆
致病变种 (P . syringae pv . pisi )相近 ,接种试验表明豆薯菌株能侵染大豆、菜豆和眉豆 ,但对豌豆的致
病性差 ;在豇豆、绿豆和蚕豆上不表现症状。 结果表明豆薯细菌性角斑病是一种新病害 ,病原菌属于
丁香假单胞菌群的一个新的致病变种 ,命名为 P . sy ringae pv. pachy rhizus nov .
关键词: 豆薯 , 细菌性角斑病 , P . sy ringae pv. pachy rhizus nov .
IDENTIFICATION OF BACTERIAL STRAIN CAUSING
ANGULAR LEAFSPOT OF YAM BEAN
Xu Zhigang1　 Ji Guanghai1　Wei Yadong2
( 1 Dept. of Plan t Protection, Nanjing Agric. Universi ty, Nanjing 210095)
( 2 Tianjin Animal and Plant Quaran tine Bu reau, Tianjin 300457)
Abstract Angular spo ts w ere observ ed on leaves o f yam bean(Pachyrhizus tuberosus Spreng. )
in Anhui province. Numerous w ater-soaked angula r leafspo ts, each wi th a yellow halo w ere
observ ed on the diseased leaves. Non-f luorescent bacterium was consistently isolated f rom in-
fected tissues. Resul ts from morphological study , LOPAT test and physio logical and biochemi-
cal tests indica ted that this st rain w as similar to Pseudomonas syringae. BIOLOG analy sis sug-
gested tha t i t w as close to P . syringae pv. pisi . Comparativ e inoculations perfo rmed on legume
plants show ed tha t the vi rulent strain f rom yam bean can infected soybean kidney bean and
snapbean. Sporadic leafspo t o ccurred on pea. No symptoms w ere reco rded from o ther hosts
tested. Resul ts indica ted that this bacterial angula r leafspot of yam bean can be considered as a
new disease caused by a non-fluorescent member, a new pa thova r of P. syringae, named as
Pseudomonas syringae pv. pachy rhizus nov .
Key words: yam bean ( Pachyrhizus tuberosus Spreng. ) , Bacterial angular lea fspo t, Pseu-
domonas syringae pv . pachyrhizus nov.
豆薯 ( Pachyrhizus tuberosus Spreng. )俗称地瓜 ,是一种兼作蔬菜和水果用的豆科植物 ,在
东南亚和非洲各国有较大面积栽种 ,国内主要在长江流域及南方种植。 豆薯上的细菌病害不多 ,
　　* 本课题获国家博士点基金资助。
　　收稿日期: 1998- 04- 26, 修改稿收到日期: 1998- 09- 16。
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 1999. 04. 015
仅方中达等曾在南京发现一种细菌性叶斑病 ,病菌经分离和鉴定后命名为 P. pachy rhiz us [1 ] ,国
外未有类似的报道。 1996～ 1997年在安徽滁州大郢乡豆薯上发现一种细菌性角斑病 ,主要症状
为叶片上产生黄褐色角斑 ,病斑初期为退绿色小点 ,以后逐渐扩大为褐色多角形水渍斑 ,大小为
2～ 4 mm,周围有褪色晕圈 ,天气潮湿时 ,病斑上出现灰白色细菌溢 ,叶背较明显 ;严重时病斑联
合成片 ,叶片枯黄脱落 ,影响产量和品质。 在叶柄和茎上出现褐色线形病斑。 豆薯上的角斑症状
与大豆、菜豆疫病的症状相似。 本文报道对豆薯细菌性角斑病病原细菌的致病性和寄主范围测
定、形态和培养性状观察、生理生化测定等研究的结果。
1　材料与方法
1. 1　试验菌株
选取病叶上的典型病斑作分离材料 ,在金氏 B( KB)或肉汁胨培养基 ( N A)平板上划线分离 ,
27℃下培养 3 d,挑取单菌落纯化 ,编号分别为 Pb1, 2, 3, 4～ 10和 Pg1～ 10等 20个菌株 ,参试菌
株有桑疫病菌 (P . s . pv .mori ) ,丁香疫病菌 ( P. s. pv. syringae )和大豆疫病菌 ( P. s. pv. glycinea ,
由东北农业大学李永镐先生惠赠 )等。
1. 2　致病性测定
将 KB斜面培养基上生长 48 h的细菌用无菌水配成 6× 108 cfu /ml的菌悬液 ,分别采用喷
雾、涂抹和针刺及注射法接种在豆薯叶片上。每个菌株接种 5～ 6叶 ,接种后保湿 24 h,在温室或
生长箱中培养 ,观察记载病情。 发病后采取病斑重新分离菌株。
1. 3　寄主范围测定
　　供试豆科植物 8类 22种 (品种 )。大豆 (Glycine max )类品种有南农 86- 11,南农 108- 6,
D30, G53, 68006, 690011, 690027;菜豆 ( Phaseolus vulgaris )类品种有 623, 6, 901,架刀豆 ,无架
豆和眉豆 ;豇豆 (Vigna sesquipedal is )有长豇豆 ,地豇豆 ,白豇豆 ,黑豇豆 ,之豇 28和宁豇 3号 ;豌
豆 ( Pisum sativum ) ;绿豆 (Vigna radiata )和蚕豆 (Vicia faba )等。供试植物的种子用 0. 1%次氯
酸钠浸泡 10～ 20 min表面消毒后 ,种植于盆钵中 ,在温室或光照培养箱中培养 ,待真叶完全展开
后采用涂抹法接种。
1. 4　细菌形态和培养性状
在 KB培养基和 NA培养基上分别观察菌落形态、颜色、质地及色素等 ,并在紫外灯下观察
荧光产生情况 ;菌体形态观察是用 2%的磷钨酸染色液 ( PT A, pH7. 2)负染 ,用透射电镜观察细
菌形态、鞭毛着生位置及鞭毛数目等。
1. 5　生理生化特性测定
Biolog鉴定实验在天津动植物检疫局实验室进行 ,采用 Bio log公司的 Micro stationTM V 3. 5
系统和格兰氏阴性菌微板 ( GN)和数据库 ,胰酶解大豆胨琼脂 ( TSA)培养基均由该公司提供 [2 ]。
代表菌株 Pb7在 TSA培养基上 25℃培养 24 h,用生理盐水配制菌悬液 ,终浓度 OD590 nm值在
0. 24～ 0. 29之间 ,每孔加 150μl菌悬液 , 28℃培养过夜 ,在 4 h和 24 h时分别采用肉眼预判和仪
器检测记录结果 ,重复 2次 ,检测结果与数据库的标准菌株比较 ,获得鉴定结果 [3 ]。也可输入自建
数据库 ,用 MLCLU ST程序进行聚类分析 ,以此确定细菌的分类地位。其余生理生化项目测定按
常规方法进行 [4 ]。
3554期 许志刚等:豆薯细菌性角斑病的病原鉴定
2　结果与分析
2. 1　细菌形态及培养性状
菌株 Pb7菌体细胞呈短杆状 ,多数单生 ,偶成双 ,大小为 0. 4～ 1. 2μm× 1. 1～ 3. 0μm,革兰氏
染色阴性反应 ,能运动 ,具 1～ 3根极生鞭毛 (图 1)。好气性 ,不产芽孢。在 KB培养基上生长良好 ,
培养 48 h ,形成肉眼可见菌落 ,培养 72 h的菌落圆形 ,边缘整齐 ,灰白色且表面发亮 ,直径约 2～ 4
mm,隆起 ,半透明 ,紫外光照射下 ,不产生荧光色素。在 N A培养基平板上生长缓慢 , 72 h始见菌落 ,
96 h形成的菌落圆形 ,隆起度高 ,灰白色 ,质地不均匀 ,多次转管后 ,菌落不粘稠 ,呈灰白色或微黄色。
2. 2　致病性测定
分离纯化得到的 Pb7等 20个菌株接种在豆薯叶片上 ,均表现出典型角斑症状 ,与田间的症
状一致。涂抹或喷雾接种 4～ 5 d后 ,叶片上开始出现针尖大小的水渍点 , 1周后水渍点增多 ,随后
逐渐扩大呈不规则形水渍斑 ,略透明 ,湿度大时 ,叶面出现灰白色细菌溢 ,以背面表现更明显 , 2
周后 ,水渍斑变成黑褐色角斑 ,病斑外围有褪绿晕圈 ,许多病斑可联合成片 ,可使整片或大部分叶
片枯黄 ,最后萎蔫脱落 (图 2)。针刺或注射叶柄或幼茎 ,可引起维管束变褐色 ,产生棕褐色长条形
病斑。 以摩擦接种或毛笔涂抹法接种易成功 ,其次是喷雾法。
图 1　细菌形态 (电镜 )
Fig. 1　 Electr on micr og raphs of
P . s. pv . pachyrhiz us, showing
cell mo rph olog y and flag ellar
图 2　豆薯角斑病的症状
Fig. 2　 Symptom o f bacteria l angular
leafspo t on yam bean
　
2. 3　寄主范围测定
从豆薯上分离的代表菌株 ,采用涂抹法接种在 8类 22种豆科植物上 ,接种试验的结果表明:
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豆薯菌株能侵染大豆 ,菜豆 ,眉豆 ;豌豆上偶而也产生零星病斑 ;豇豆 ,绿豆 ,蚕豆和药黑豆植株和
以无菌水接种的对照植物上未发现任何症状。供试大豆品种中 ,除品种 690011无症状外 , 5个品
种在接种 4～ 5 d后复叶上开始出现水渍状小点 ,后渐扩大呈褐色多角形水渍斑 ,以后联合成带
有黄色晕圈的暗褐色坏死斑。潮湿环境下 ,叶背面也产生灰白色细菌溢 ,随大豆品种和菌株的不
同 ,症状严重度以及病斑数目和大小均有差异。菜豆类仅品种 623上症状明显 ,与豆薯上的不同 ,
接种 1周后 ,可见油腻状、墨绿色病斑 ,单个 ,大而不规则 ,直径约 5 mm左右 ,病斑可逐渐扩大 ,
形成黑色角斑 ,病斑组织周围不褪绿 ,沿叶缘或叶脉侵入 ,叶尖扭曲 ,且萎蔫状 ,叶脉受害呈放射
状褐色坏死。眉豆叶片在接种 4～ 5 d后可见水渍状褪绿斑 ,后期病斑呈褐色不规则角斑 ,病斑周
围组织枯黄 ,严重时 ,叶片脱落 ,切下病斑镜检均可观察到大量细菌溢出。
2. 4　生理生化试验及 BIOLOG鉴定结果
2. 4. 1　生理生化特性　常规的生理生化以及碳氮源利用 ( BIO LOG系统 )试验结果详见表 1、表 2。
表 1　豆薯角斑病细菌的主要生理生化特性
Table 1　 Physiological and biochemical character istics of bacteria isolates fromPachyrhizus tuberosus
测 试项 目
Tes ted i tems
测试菌株 ( Pb7等 )
Tested isolates
参考菌株 ( Reference is olates (P . s. pvs. )
pv. mori pv. pisi pv. g lycinea
革兰氏染色 ( Gram staining) - - - -
鞭毛 (极生 ) ( Flagella typ e) + + + +
荧光色素产生 ( Fluorescent pigm ent ) + + + +
明胶液化 ( Gelatin liqu efaction) + - - -
淀粉水解 ( Starch h ydrolysi s) - - - -
硝酸盐还原 (Ni trate red uction) - - - -
吐温 80 ( Tw een80) + - - NR
L-阿拉伯糖 ( L-Arabinos e) + + + +
纤维二糖 ( Cellobiose) - - - -
赤藓糖醇 ( Eryth ri tol ) - - - -
D-乳糖 ( D-Lactose) - - - -
D-果糖 ( D-Fructos e) + + + +
D-半乳糖 ( D-Galactos e) + + + +
D-葡萄糖 ( D-Glucos e) + + + +
meso-肌醇 (m eso-Inosi tol ) + + + +
D-甘露糖 ( D-Mannose) + + + +
D-甘露醇 ( D-Mannitol) + + + +
麦芽糖 (M al tos e) - (+ ) + NR
L-鼠李糖 ( L-Rhamnose) - - - -
D-山梨醇 ( D-Sorbi tol ) - + + -
蔗糖 ( Sucros e) + + + +
D-海藻糖 ( D-Trehalos e) - (+ ) (+ ) -
乙酸 ( Acetic acid) + - - NR
D-葡糖酸 ( D-Gluconic acid) + + + +
D-葡糖胺酸 ( D-Glucos aminic acid) + - - NR
D-葡糖醛酸 ( D-Glucuronic acid) - + + NR
奎尼酸 (盐 ) ( Quinate) - + + +
葡糖醛酰胺 ( Glucuronamide) - + + NR
甘氨酰 -L谷氨酸 ( Glycyl-L-glutamic acid ) + - + NR
D-丝氨酸 ( D-Serine) - + + NR
L-丝氨酸 ( L-Serine) + + + NR
L-苏氨酸 ( L-Th reonine) - (+ ) + NR
甘油 ( Glycerol ) + + + (+ )
D. L-α磷酸甘油 ( DL-Glycerophosph ate) - - + NR
　　注 ( Note)　+ :示阳性 ( posi tiv e) ; (+ ):示弱阳性 ( w eak react ion) ; - : 示阴性 ( negative) ; N R:无记录 ( not recorded) .
3574期 许志刚等:豆薯细菌性角斑病的病原鉴定
从表 1可知 Pb7等豆薯菌株能液化明胶 ,但菌株间有差异 ,淀粉不水解 ,果聚糖产生和烟草枯斑
反应呈阳性 ,氧化酶、马铃薯软腐和精氨酸双水解酶为阴性反应 , 41℃以上不生长 ,最适生长温度
25～ 27℃ ,根据上述结果 , Pb7等菌株应归入假单胞菌属的第一组 ,即与丁香假单胞菌在同一组 ;
碳氮源利用方面 ,菌株 Pb7等能利用吐温 40、吐温 80、 L-阿拉伯糖、 D-阿拉伯糖醇、 D-果糖、 D-半
乳糖、 D-葡萄糖、 meso-肌醇、 D-甘露糖、 D-甘露醇、 D-阿洛酮糖、 D-棉子糖、蔗糖、乙酸、 D-葡糖
酸、 D-葡糖胺酸、 L-丙氨酸、 L-天冬氨酸、甘氨酰-L谷氨酸、 L-丝氨酸、甘油等。不能利用纤维二
糖、赤艹鲜糖醇、α-D-乳糖、麦芽糖、 D-山梨醇、 D-海藻糖、 D-密二糖、 D-葡糖醛酸、奎尼酸 (盐 )、苯丙
氨酸、 L-组氨酸、D-丝氨酸、 L-苏氨酸等。
测定结果经与标准库已知细菌菌株比较 ,豆薯菌株 Pb7的代谢特征图谱与丁香假单胞菌豌
豆致病变种 ( P. s. pv . pisi )相似程度高 ,相似度达到 0. 757～ 0. 789。对照菌株 P. syringae pv.
mori可鉴定到种的水平 ,相似系数达 0. 778。
2. 4. 2　豆薯菌株的主要鉴别性生理生化反应类型　详细分析了豆薯菌株与丁香假单胞菌几个
致病变种间的生理生化差异 ,具有鉴别作用的是表 1中的 14项 ,豆薯菌株能液化明胶 ,且菌株间
液化能力存在差异 ,对照菌株为阴性。在碳氮源利用方面 ,豆薯菌株能利用吐温 80、乙酸、 D-葡糖
胺酸、甘氨酰 -L-谷氨酸 ;而不能利用麦芽糖、 D-山梨醇、 D-海藻糖、 D-葡糖醛酸、奎尼酸 (盐 )、 D-
葡糖醛酰胺、 D-丝氨酸、 L-苏氨酸、 D. L-α-磷酸甘油 ,从表 1可知 ,豆薯叶斑病菌的生理生化反应
类型与丁香假单胞菌种下几个致病变种 (如 pv. mori、 pv. pisi )明显不同 ,从相互间总的反应水平
上可将它们区分 ,与 P. s. pv. gly cinea之间也有差异 ,如明胶液化、奎尼酸 (盐 )等。
2. 4. 3　血清学双扩散反应　以 Pb7菌株免疫后制备的抗血清 ,只与豆薯菌株发生反应 ,与 P.
syr . glycinea等不发生反应。
表 2　细菌用 Biolog95 Microstation TM的 GN微板测试结果
Table 2　Metabolic act ivity of tested bacterial in the Biolog95 GN microplate assay
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0 5 58 15 < 89> < 79> 2 - 1 < 311> < 351> 12
B 14 < 315> 34 < 210> - < 275> < 284> 1 8 17 < 357> < 293>
C 7 4 < 196> < 239> 1 43 < 468> 15 38 - < 290> < 304>
D < 137> < 385> < 342> < 118> < 86> 20 < 430> < 141> 25 2 < 74> 15
E - - 16 22 11 61 < 144> < 115> 11 < 531> 6 < 425>
F < 239> < 263> - < 124> < 161> < 208> < 185> < 209> < 334> < 307> 5 < 149>
G - - 2 1 7 < 329> 8 5 < 338> 12 8 < 304>
H 34 2 2 - - 2 36 35 < 277> - 1 8
　　注 ( Note): < XXX> 表中数字是比 A1(对照 )增加的光度值 ,以 > 70%判为阳性 ( Percent change posi tiv e if more th an
70% agains t A1 ( OD290nm ) ) ;`- ’ and < 70% 为阴性 ( Percent ch ang e negative) .
3　结论与讨论
3. 1　发生在安徽滁州豆薯上的细菌性角斑病 ,是一种新病害。 病原菌与已鉴定过的细菌不同。
方中达曾报道了南京发生的豆薯细菌性叶斑病 ,病斑很大 ,有 3～ 4 cm ,寄主范围和菌落大小也
不同 ,病原细菌鉴定为 P. pachyrhizus[ 1] ,但因为未能保存该病原菌 ,现已无法对比和确认。此后 ,
国内外均未见有类似的报道。
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3. 2　关于病原菌的鉴定:自豆薯叶角斑上分离的菌株 ,经接种在豆薯、大豆和菜豆等豆科植物上
测定 ,均具致病性 ,寄主范围较广。 豆薯菌株经细菌形态、培养特征、生理生化测定以及采用 BI-
O LOG细菌鉴定系统测定菌株对 95项碳氮源利用的代谢谱 ,结果表明该病原细菌属于 Lellio t
等 ( 1996)划分的假单胞菌属第一组群的 P . sy ringae ,代谢谱与 P. s. pv. pisi接近 ,但寄主范围的
结果证实它对豌豆的致病性弱 ,也不表现典型角斑症状 ,且不侵染豇豆。 豆薯菌株与丁香假单胞
菌几个致病变种 (如 pv. pisi , pv. mori等 )生理生化测定中至少 10项有差异 ,与已报道的大豆细
菌性疫病菌 ( P. s. pv. glycinea )在明胶液化、 D-山梨醇和奎尼酸 (盐 )的利用方面也有差异 [5, 6 ]。另
外 ,豆薯菌株不产荧光 ,习惯上 ,人们将植物病原假单胞菌分为荧光菌和非荧光菌 2类 ,但荧光类
群中 ,有些丁香假单胞菌的致病变种 ,如丁香假单胞豌豆、菜豆等致病变种 ,正常情况下可产荧
光 ,但最初分离时偶有不产生荧光的菌系。据 Bazzi等报道引起菠菜细菌性叶斑病菌就属于丁香
假单胞菌的非荧光菌系 [3 ] , Pernezny等报道引起芫荽叶斑病的病原菌也为非荧光菌 [7 ] ,任欣正等
也发现构树疫病的病原菌菌株中光滑型菌株也不产生荧光 [8 ] ,故菌株是否产生荧光并不是十分
重要的性状。据致病性测定、生理生化、以及碳氮源利用的 Bio log分析后 ,认为该病原菌属于丁
香假单胞菌 ,且与 P . syringae pv . pisi相近 ,相似数为 0. 52～ 0. 81。因此 ,尽管豆薯菌株不产生荧
光 ,但表型特征和致病性上仍与 P. syringae相仿 ,且与已知的几个致病变种间差异明显。因此豆
薯角斑病菌是一个新的致病变种 ,命名为 P . syringae pv. pachyrhizus nov .。
3. 3　 Biolog细菌鉴定系统能够用于快速鉴定病原细菌 ,但数据库中的标准菌株亟待补充。 如数
据库中有与待鉴定细菌类似的标准菌株时 ,则鉴定结果符合率较高 ,如数据库中没有标准菌株 ,
鉴定结果就很不稳定。 另外 ,培养基种类和培养温度对鉴定结果影响较大 ,但随着数据库的增大
和选择适宜的培养条件 ,鉴定结果将更加准确、可靠 ,在植物病原细菌的鉴定和分类中应用前景
更加广阔。当然 ,在细菌分类方面 ,从 DNA水平上比较相关病菌间遗传关系 ,结果将更全面 ,值
得进一步研究。
参 考 文 献
1　方中达 ,任欣正 . 豆薯的一种新的细菌病害 . 植物病理学报 , 1960; 6( 1): 87- 89
2　赵友福 ,魏亚东 ,高崇省等 .利用 Biolog鉴定系统快速鉴定菜豆萎蔫病的研究 . 植物病理学报 , 1997; 27: 139- 144
3　 Baz zi C, Gozzi R, Stead D. A bacterial leaf spo t of s pinach ( Spinacia oleracea L. )caused by a non-fluores cent Pseudomonas
syrin gae van Hall ( path ovar) . Ph ytopath. Medi t. , 1988; 27: 103- 107
4　方中达 .植病研究方法 .北京:中国农业出版社 , 1998
5　李永镐 ,张原 .黑龙江省大豆细菌性疫病病原鉴定 .大豆科学 , 1995; 14( 2): 126- 131
6　 Prom L K, Venette J R. Races of Pseudomonas syrin gae pv. glycinea on commercial s oybean in eastern nor th Dakota. Plant
Dis. , 1997; 81: 541- 544
7　 Pernezny K, Raid R N. Bacterial leaf s pot of cilant ro in Flo rida. Plant Dis. , 1997; 81( 2): 232- 233
8　任欣正 ,黄琼 ,杨合同 .构树上一种新的丁香假单胞菌致病变种的研究 .植物病理学报 , 1995; 25: 179- 183
3594期 许志刚等:豆薯细菌性角斑病的病原鉴定