全 文 ：收稿日期:2014-03-02; 修订日期:2014-09-03
基金项目:湖南中医药大学青年基金(No． 9982001 － 98)
作者简介:彭求贤(1983-) ，男(汉族) ，湖南衡阳人，南方医科大学博士研
究生，博士学位，主要从事中药药理及机制研究工作．
* 通讯作者简介:彭江丽(1983-) ，女(汉族) ，湖北娄底人，湖南中医药大
学药学院助教，硕士学位，主要从事中药学研究工作．
含羞草水提物对人子宫癌 Hela细胞凋亡
及 mcl － 1 与 bim蛋白表达基因表达的影响
彭求贤1，彭江丽2* ，刘塔斯1，罗 堃2，莫志贤1
(1．南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515; 2．湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410007)
摘要:目的 观察含羞草水提物(WEMP)对人子宫癌细胞(Hela)生长的抑制和凋亡诱导效果及其对 mcl － 1 和 bim 表达
的影响。方法 采用 MTT比色法观察不同浓度的 WEMP对 Hela的生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western
blot 方法检测 WEMP对人胃癌细胞 Hela中 mcl － 1、bim蛋白表达的影响。结果 WEMP作用 Hela细胞 24 h后，细胞存活
率显著降低(P ＜ 0． 05) ，且与时间、剂量呈依赖关系。流式细胞仪 PI 单染亚二倍体峰分析，250，500，1000，2000，4000
mg /L WEMP作用 Hela细胞 24 h，Sub － G1 期细胞比率分别为(11． 60 ± 0． 85)%，(15． 95 ± 0． 64)% ，(18． 20 ± 1． 41)
%、(17． 5 ± 0． 14)%和(18． 10 ± 0． 57)%，与对照组(7． 4 ± 0． 84)%比较差异均有统计学意义(P﹤ 0． 01)。WEMP
可降低 Hela细胞 mcl － 1 基因表达和增加 bim基因表达。结论 WEMP对 Hela生长有明显的抑制作用并可诱导 Hela 的
凋亡，mcl － 1 基因表达降低和 bim基因表达增加可能是其凋亡机制之一。
关键词:含羞草; Hela; 细胞凋亡; 凋亡机制
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 01． 031
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2015)01-0078-02
含羞草 Mimosa pudica Linn．为豆科含羞草属植物含羞草的全
草，又名刺知羞草、怕羞草、惧内草、喝乎草［1］。主要分布在我国
西南、华南、华东等地的山坡、湿地、路旁。含羞草的化学成分有黄
酮类、酚类、氨基酸类、挥发油、生物活性多糖、有机酸类和其它微
量元素等［2 ～4］，具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、凉血止血之功
效，用于水肿、失眠、跌打损伤、疮痈肿毒等［5］。现代药理研究表
明，黄酮类化合物在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面具有
明显的药理作用［6］。含羞草对多种肿瘤细胞的增殖均具有良好抑
制作用，抑制率能达 90%以上［7］。本实验以体外培养的人子宫癌
Hela细胞为研究对象，探讨人子宫癌 Hela细胞凋亡的影响极其可
能的分子机制，为子宫癌的防治提供一定的实验依据。
1 材料与仪器
1． 1 细胞系 Hela细胞(人子宫颈癌细胞)取自香港浸会大学系
统生物中心(细胞源自美国 ATCC 细胞库)。用含有体积分数为
10%的 FBS的高糖 DMEM、ＲPMI － 1640、F － 12K、ＲPMI － 1640 和
ＲPMI － 1640 完全培养基加青霉素和链霉素。于 37℃，5%的
CO2 孵箱中培养。达到 90%汇合率时传代。取对数生长期细胞
进行实验。
1． 2 试剂与仪器 中药含羞草购于广州市清平药材市场，经湖南
中医药大学刘塔斯教授鉴定为豆科植物含羞草 Mimosa pudica
Linn．。mcl － 1 和 bim抗体购买于 SANTA CＲUZ公司。
2 方法
2． 1 药物制备 含羞草水提物:以含羞草为原料，分别以 12 倍和
8 倍水加热提取两次，每次 1 h，用滤纸过滤，合并两次水提液体，
冷冻干燥，得含羞草水提物粗品。60Co照射灭菌，0． 22 μm过滤除
菌，制成受试样品备用，本实验均为生药浓度。
2． 2 MTT测定含羞草对细胞存活率的影响 取对数生长期细
胞，用 DMEM培养基制成细胞悬液(5 × 104 /ml)加入 96 孔板，
100 μg /孔，培养 24 h 后加药，实验组分别加入不同浓度药物使
其终浓度为 250，500，1000，2000 g /ml，分别培养 24，48，72 h，
加入 10 μg /孔 MTT，振荡 10 min。波长 490 nm 测吸光值(OD)。
相对细胞数(%)=(实验组平均 OD 值 /对照组平均 OD 值)×
100%，以空白组 OD凋零。
2． 3 流式细胞术检测 调整细胞密度为 2 × 105 cells /ml，以 1． 5
mL /well种入 6 孔板。每组 6 个复孔。药物作用 48h 后，细胞刮
刮取细胞，1000 r /min 离心 10 min，去上清，PBS 漂洗两次，沉淀
中缓慢依次加入 80%的冰乙醇固定。 － 20℃ 固定 24 h。然后
1000 r /min离心 5 min，去上清，PBS漂洗两次，调整细胞浓度为 1
× 106 /ml。加 ＲNase至终浓度 100 μg /ml，37℃水浴 30 min。加
PI 至终浓度 50 μg /ml，350 目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃
避光染色后，上流式细胞仪检测(激发波长:488 nm;发射波长:
610 nm)各期细胞 DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置
的软件进行数据处理，以 DNA组方图出现低于 G期 DNA含量亚
G峰的大小代表凋亡细胞的多少。
2． 4 Western bolt 检测 mcl － 1 与 bim蛋白表达 经不同浓度含羞
草作用 72 h 后，细胞约 2． 4 × 106个加入 LDS 样品裂解液(Nu-
PAGE，invitrogen，USA，lot No． 744334A)冰上裂解 10 min，每个
样品中加 1μl Benzonase Nuclease(EMD Chemicals Inc．，USA lot
No． D00098016)。灌制 10% 分离胶，5% 浓缩胶的 SDS － PAGE
凝胶。吸取 10 μl总蛋白，恒压 200 V电泳直到溴酚蓝到达分离
胶底部。恒流 100 mA 湿法电转，将蛋白从 SDS － PAGE 凝胶转
至 PVDF膜。3% 的脱脂奶粉 /PBS － T封闭。1∶ 3000 稀释二抗
Goat anti － Ｒabbit IgG，孵育 1 h，增强化学发光(enhanced chemilu-
minescence ，ECL)显影，暗室显影，UVI凝胶成像系统摄像。
2． 5 统计学处理 全部数据均采用 SPSS13． 0 统计软件进行统计
分析，数据用 珋x ± s表示，组间比较用单因素方差分析(One － way
ANOVA)检验。
3 结果
3． 1 含羞草对 Hela细胞存活率的影响 以不同浓度的按照上述
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 1
方法制备的含羞草提取物作用于培养的 Hela 细胞，在规定时间
内，显微镜下对细胞进行计数，结果如图 1 所示。实验结果显示，
对照组细胞生长良好，经含羞草提取物作用后的细胞，随着浓度
逐渐增高，作用时间的不断延长，Hela 活细胞的数目下降，其中
将未经处理的对照组细胞的存活率设定为 100%。
图 1 含羞草水提物不同浓度与
作用时间对 Hela细胞存活率的影响(n = 6)
3． 2 流式细胞仪亚二倍体峰分析 细胞凋亡时有 DNA 的断裂
丢失，细胞 DNA 的含量较二倍体少，FCM 检测时出现在 G1 期
前，称为亚二倍体峰(sub － G1) ，我们把 sub － G1 峰在细胞周期中
的百分比看出凋亡率。结果见图 2。FCM 定量分析为随含羞草
提取物浓度增加，sub － G1 期细胞增加，G0 /G1 期细胞减少。浓度
为 250，500，1000，2000，4000mg /L提取物作用 Hela细胞后，sub －
G1 期细胞比率分别为(11． 60 ± 0． 85)%，(15． 95 ± 0． 64)% ，
(18． 20 ± 1． 41)%、(17． 5 ± 0． 14)%和(18． 10 ± 0． 57)%，
与对照组(7． 4 ± 0． 84)%比较差异均有显著性(P﹤ 0． 05)。
图 2 不同浓度的含羞草水提物
对 Hela细胞周期的流式细胞术分析
3． 3 western bolt 检测 mcl － 1 与 bim蛋白表达 本研究结果说明
经(250 ～ 4000 mg /L)的含羞草作用 72 h 后，Hela 细胞中 mcl － 1
随着浓度增加而明显减低。bim 蛋白表达率随着浓度增加而明
显升高。见图 3。
图 3 不同浓度 WEMP作用 Hela细胞
72 h后 mcl － 1 与 bim蛋白表达
4 讨论
Bcl － 2 家族蛋白是线粒体凋亡途径中的关键蛋白，根据结
构和功能的特点，Bcl － 2 蛋白家族可分为两大类:一类是抗凋亡
蛋白家族，如 Bcl － 2、Bcl － xl、Bcl － w、Mcl － 1 和 Al 等，另一类
是促凋亡蛋白家族，可以分为 2 个亚类，一个是 Bax 亚家族，包括
BAX、BAK 和 Bok 等，它们是促凋亡的执行者，直接参与凋亡的
过程;另一个是 BH3 亚族，包括 Bim、Bad 和 Bid 等，它们只含有
短小的 BH3 结构域，主要发挥促凋亡作用［8］。这两类蛋白的比
率决定细胞是否发生凋亡的关键因素［9］。本研究结果显示，经
250 ～ 4000 mg /L的含羞草作用 72h后，人子宫癌细胞中 Hela细
胞中 mcl － 1 随着浓度增加而明显减低，bim 蛋白表达率随着浓
度增加而明显升高(图 3)。提示含羞草可能可减少 mcl － 1 的表
达，进一步提高 bim的表达。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率跟
着浓度的增加而降低，这可能与诱导 Hela细胞凋亡有关。
中药抗肿瘤作用除了与药物有关，还与药物浓度和作用时间
有关。本实验结果显示，WEMP作用于 Hela细胞后，对该细胞有
明显的抑制作用，作用 48 h 或 72 h 后，不同浓度的 WEMP 对
SGC － 7901 细胞生长的抑制率显著增加，细胞相对数目减少，且
WEMP抑制 Hela 细胞生长的作用与浓度、时间正相关(图 1)。
流式细胞术检测细胞周期，不同浓度作用 Hela细胞 48 h后，停滞
在 sub － G1 的细胞比率分别为(11． 60 ± 0． 85)%，(15． 95 ± 0． 64)
% ，(18． 20 ± 1． 41)%、(17． 5 ± 0． 14)%和(18． 10 ± 0． 57)%
(图 2)。结果也说明，随着 WEMP浓度的升高，诱导凋亡的趋势
增大。
综上所述，WEMP 能抑制子宫癌细胞株 Hela细胞增殖，降低
细胞存活率。WEMP能改变 Hela 细胞的细胞周期，使细胞停止
在 sub － G1 期，并通过上调抗凋亡蛋白和下调促凋亡蛋白降低肿
瘤细胞对化疗药物的敏感性，但 WEMP 调节凋亡调控蛋白的具
体途径和通路仍有待进一步研究。
参考文献:
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 1 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 1 期