全 文 ：收稿日期:2012-07-12 接受日期:2013-03-20
* 通讯作者 Tel:86-744-8202072;E-mail:tkk651@ 126． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2013，25:1185-1191
文章编号:1001-6880(2013)9-1185-07
青牛胆总黄酮的对比提取研究
唐纯翼*
吉首大学城乡资源与规划学院，张家界 427000
摘 要:采用分光光度法对青牛胆块根中总黄酮进行超声波法、浸提法和微波法比较提取研究。以总黄酮提取
率为考察对象，研究提取温度、乙醇体积分数、料液比及提取时间等因素对青牛胆块根中总黄酮提取率的影响。
结果表明:最佳提取方法为浸提法，最佳提取条件:乙醇体积分数 60%，提取温度 90 ℃，料液比 1∶ 30，提取时间 4
h，总黄酮提取率 6． 294 mg /g。
关键词:青牛胆;提取;正交试验;总黄酮;分光光度法
中图分类号:TQ110． 6 文献标识码:A
Extraction of Total Flavonoids from Tinospora sagittata of Tongdao
TANG Chun-yi*
College of Ｒesources and Planning Sciences，JiShou University，Hunan Zhangjiajie 427000，China
Abstract:In this study，three extraction methods，namely ultrasonication，lixiviation and microwave，were compared for
the extraction of total flavonoids from Tinospora sagittata root by UV spectrometer． The effects of extraction temperature，
concentration of aqueous ethanol，ratio of material-solvent，and extraction time on the extraction yield of total flavonoids
were investigated． The results showed that the best extraction method was the lixiviation method，the optimal extraction
conditions was determined to be:extraction temperature was 90 ℃，concentration of aqueous ethanol was 60%，ratio of
material-solvent was 1∶ 30，extraction time was 4 h． Using the optimal extraction condition，the extraction yield of total fla-
vonoids was 6． 294 mg /g．
Key words:Tinospora sagittata;extraction;orthogonal test;flavonoids;spectrophotometry
防己科青牛胆属是一个相对较大的常绿缠绕藤
本属，全属约 30 余种，主要分布在东半球热带及亚
热带地区，我国有 6 个种 2 个变种，集中分布在西南
和南部各省区。该属植物的块根常作为中药入药。
青牛胆为防己科青牛胆属植物青牛胆(Tinospora
sagittata)的干燥块根，有清热解毒、消肿镇痛之功
效。内服用于治疗各种炎症，如咽喉肿痛、扁桃体
炎、急性胃肠炎、菌痢、痈肿疔疖等;外用有浸膏、磨
汁涂搽或研末调搽，用以治疗静脉炎、毒蛇咬伤等
症。主产于广西、江西、湖北、湖南等地，是常用中
药［1-3］。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
1． 1． 1 材料
购自湖南省通道县药材市场，经吉首大学廖博
儒教授鉴定为防己科青牛胆属植物青牛胆块根。洗
净，40 ℃干燥至恒重，粉碎过 40 目筛。
1． 1． 2 试剂
芦丁标准品购于中国药品生物制品鉴定所，
99%;NaOH、Al(NO3)3、无水乙醇、NaNO2 均为国产
分析纯。
1． 2 仪器与设备
SK3200H型超声波清洗器，上海垒固仪器有限
公司;UV-160A 型紫外-可见分光光度计、AUY120
型电子天平，日本岛津公司;SF8213 型医药不锈钢
粉碎机，上海科太粉碎设备厂;TDZ5-WS 型台式离
心机，赛特湘仪离心机仪器有限公司;HH-4 型数显
恒温水浴锅，常州国华有限公司;改制格兰仕微波
炉，格兰仕电器实业公司。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 标准曲线绘制
称取 120 ℃下干燥至恒重的芦丁标准品 6． 2
mg，70%乙醇溶解并定容至 50 mL。吸取 25． 0 mL，
蒸馏水定容至 50 mL，得标准溶液，浓度 0． 062 mg /
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.09.005
mL。
移取标准溶液 5． 0 mL，加 5% NaNO2 溶液 1． 0
mL，6 min 后加 10% Al(NO3)3 溶液 1． 0 mL，6 min
后加 4%NaOH溶液 10． 0 mL，蒸馏水定容至 25 mL，
15 min 后，以不加标准品的溶液为空白，460 ～ 700
nm自动扫描，509 nm处有最大吸收峰。
吸取标准溶液 0． 0、1． 0、2． 0、3． 0、4． 0、5． 0、6． 0
mL分别置于 25 mL 容量瓶中，配制系列溶液，509
nm处测定吸光度值。以浓度为纵坐标，吸光度为横
坐标，绘制标准曲线，回归方程式:Y = 0． 0867X +
0. 0001，相关系数 Ｒ2 = 0． 9997。
1． 4 提取方法
称取样品 2． 000 g，在一定乙醇浓度、提取时间、
提取次数、料液比、水浴温度、微波功率下分别用超
声波、浸提法、微波法提取，提取液过滤、浓缩并定容
至 100 mL。
1． 5 含量测定
取样品液 2． 0 mL 按“1． 3． 1”项方法操作，按下
式计算总黄酮含量。
总黄酮含量( mg /g) = ( 样品浓度 ×稀释倍数 ×
体积 × 10) ÷样品质量
2 结果与分析
2． 1 单因素实验［4-10］
2． 1． 1 乙醇浓度影响
料液比 1 ∶ 20，超声波法中萃取 2 次，每次 20
min;浸提法中 70 ℃恒温水浴浸提 2 h。结果表明，
总黄酮含量随乙醇浓度增加而增加，70%后开始减
少，选定乙醇浓度范围在 50% ～70%之间(图 1)。
图 1 乙醇浓度对提取结果的影响
Fig. 1 Effect of alcohol concentration on extraction ratio of
total flavonoids
2． 1． 2 提取时间影响
超声波法中，70% 乙醇，料液比 1 ∶ 20，提取 2
次。结果表明，总黄酮含量随时间延长而增加，30
min后开始下降，故选萃取时间范围为 20 ～ 40 min。
浸提法中，90 ℃，70%乙醇，料液比 1∶ 30，分别浸提
1、2、3、4、5、6 h。结果表明，总黄酮含量在 1 ～ 5 h之
间增加明显，之后下降明显，故选浸提时间范围为 3
～ 5 h。微波法中，料液比 1∶ 30 下加水浸泡 30 min，
功率为解冻。结果表明，总黄酮的含量先增大后下
降，微波作用 30 s 总黄酮含量达到了 4． 018 mg /g，
故选提取时间范围为 10 ～ 30 s(图 2)。
图 2 提取时间对提取结果的影响
Fig. 2 Effect of extraction duration on extraction ratio of to-
tal flavonoids
2． 1． 3 提取次数影响
超声法中，70%乙醇，料液比 1∶ 20，时间 30 min
(图 3)。结果显示，总黄酮含量随提取次数增多而
增加，第 3 次后增加幅度不大，选定提取次数为 1 ～
3 次。
图 3 提取次数对提取结果的影响
Fig. 3 Effect of times of extraction on extraction ratio of total
flavonoids
2． 1． 4 料液比影响
超声法中，70%乙醇，30 min，提取 3 次。结果
表明，总黄酮含量随料液比的增加而增加，1 ∶ 20 以
后开始下降，选定料液比范围在 1∶ 15 ～ 1∶ 25 之间。
浸提法中，70%乙醇，90 ℃，2 h。结果表明，料液比
对浸提效果影响不大，增加幅度不明显，当料液比为
1∶ 30 时黄酮含量最高，以后增加不明显，选择料液
比为 1∶ 20 ～ 1∶ 30。微波法中，解冻档，30 s。结果表
明，总黄酮含量随着料液比的增大而增大，但到1∶ 20
以后，总黄酮含量有所下降，选 1∶ 10 ～ 1∶ 30(图 4)。
6811 天然产物研究与开发 Vol. 25
图 4 超声法中料液比对提取结果的影响
Fig. 4 Effect of material-solvent ratio on extraction ratio of
total flavonoids
2． 1． 5 水浴温度影响
浸提法中，70%乙醇，料液比 1∶ 20，恒温水浴浸
提 2 h(图 5)。结果表明，温度高则浸提效果好，100
℃后提取率下降，选择浸提温度为 70 ～ 90 ℃。
图 5 温度对浸提效果的影响
Fig. 5 Effect of temperature on extraction ratio of total flavonoids
2． 1． 6 微波功率影响
料液比 1 ∶ 30，浸泡 30 min，微波功率分别在 A
档(解冻)、B 档(中火)、C 档(中高火)、D 档(高
火) ，时间为 30 s(图 6)。结果显示，随着功率的增
大，总黄酮含量降低，但下降幅度不大，选解冻、中火
和中高火。
图 6 微波功率对提取结果的影响
Fig. 6 Effect of microwave power on extraction
2． 2 正交试验
超声波法中，以乙醇浓度、提取时间、提取次数
和料液比 4 因素进行正交试验设计(表 1、表 2)。结
果表明，影响顺序为:乙醇浓度 ＞萃取次数 ＞萃取时
间 ＞料液比。最优水平组合 A1B1C2D1，此条件下总
黄酮含量 4． 960 mg /g。
表 1 超声波法试验因素水平表
Table 1 Levels and factors of the extraction parameters of the ultrasonic extraction
水平
Level
因素 Factor
乙醇浓度 A(%)
Concentration
萃取时间 B(min)
Time
萃取次数 C
Number
料液比 D(w /v)
Ｒatio of solid-liquid
1 50 20 1 1∶ 15
2 60 30 2 1∶ 20
3 70 40 3 1∶ 25
表 2 超声波法 L9(3
4)正交试验结果及分析
Table 2 L9(3
4)arrangement and results of orthogonal test of ultrasonic extraction
实验号
No．
A
乙醇体积分数(%)
Volume fraction
B
时间(h)
Time
C
次数
Number
D
料液比(w /v)
Ｒatio of solid-liquid
提取率 Extraction yield(mg /g)
1 2 3 均值 Means
1 1 1 1 1 4． 398 4． 343 4． 614 4． 452
2 1 2 2 2 4． 723 4． 452 4． 668 4． 614
3 1 3 3 3 4． 614 4． 398 4． 560 4． 524
4 2 1 2 3 4． 398 4． 560 4． 560 4． 506
5 2 2 3 1 4． 777 4． 614 4． 289 4． 560
6 2 3 1 2 4． 127 4． 235 4． 452 4． 271
7 3 1 3 2 4． 452 4． 452 4． 343 4． 407
8 3 2 1 3 4． 235 4． 127 4． 181 4． 181
9 3 3 2 1 4． 560 4． 452 4． 018 4． 343
7811Vol. 25 唐纯翼:青牛胆总黄酮的对比提取研究
K1 13． 590 13． 365 12． 904 13． 355
K2 13． 337 13． 355 13． 463 13． 292
K3 12． 931 13． 138 13． 491 13． 437
k1 4． 530 4． 455 4． 301 4． 452
k2 4． 446 4． 452 4． 488 4． 431
k3 4． 310 4． 379 4． 497 4． 404
Ｒ 0． 220 0． 076 0． 196 0． 048
浸提法中，以乙醇浓度，提取温度，提取时间和料
液比 4因素正交试验(表 3，表 4)。结果显示，影响顺
序为:提取时间 ＞料液比 ＞温度 ＞乙醇浓度，最佳组合
为 A2B3C1D2。此条件下总黄酮含量 4． 690 mg /g。
表 3 浸提法试验因素水平表
Table 3 Levels and factors of the extraction parameters of the lixiviation method
水平
Level
因 素 Factor
乙醇体积分数 A (%)
Volume fraction
提取温度 B (℃)
Temperature
料液比 C (w /v)
Ｒatio of solid-liquid
提取时间 D (h)
Time
1 50 70 1∶ 20 3
2 60 80 1∶ 25 4
3 70 90 1∶ 30 5
表 4 浸提法 L9(3
4)正交试验结果及分析
Table 4 L9(3
4)arrangement and results of orthogonal test of the lixiviation method
实验号
No．
A
乙醇体积分数(%)
Volume fraction
B
温度(℃)
Tmperature
C
料液比(w /v)
Ｒatio of solid-liquid
D
时间(h)
Time
提取率 Extraction yield(mg /g)
1 2 3 均值 Means
1 1 1 1 1 4． 452 4． 398 4． 452 4． 424
2 1 2 2 2 4． 831 4． 560 4． 831 4． 741
3 1 3 3 3 5． 373 5． 264 5． 156 5． 264
4 2 1 2 3 4． 885 4． 939 4． 560 4． 795
5 2 2 3 1 4． 506 4． 668 4． 885 4． 686
6 2 3 1 2 5． 915 6． 186 5． 481 5． 861
7 3 1 3 2 5． 373 5． 481 5． 210 5． 355
8 3 2 1 3 5． 102 5． 102 5． 048 5． 084
9 3 3 2 1 4． 560 4． 614 4． 614 4． 596
K1 14． 429 14． 574 15． 369 13． 706
K2 15． 342 14． 511 14． 132 15． 957
K3 15． 035 15． 721 15． 305 15． 143
k1 4． 810 4． 858 5． 123 4． 569
k2 5． 114 4． 837 4． 711 5． 319
k3 5． 012 5． 240 5． 102 5． 048
Ｒ 0． 304 0． 403 0． 412 0． 750
微波法中，以微波功率，提取时间，料液比 4 因
素进行正交设计(表 5，表 6)。结果表明，影响程
度:萃取时间 ＞ 料液比 ＞ 微波功率，最佳条件为
A3B2C3，此条件总黄酮的含量为 4． 425 mg /g。
8811 天然产物研究与开发 Vol. 25
表 5 微波法试验因素水平表
Table 5 Levels and factors of the extraction parameters of the microwave extraction
水平
Level
因素 Factor
微波功率 A
Microwave power
提取时间 B(s)
Time
料液比 C(w /v)
Ｒatio of solid-liquid
空白
Blank
1 解冻 10 1∶ 10
2 中档 20 1∶ 20
3 中高档 30 1∶ 30
表 6 微波法 L9(3
4)正交试验结果及分析
Table 6 L9(3
4)arrangement and results of orthogonal test of the microwave extraction
实验号
No．
A
微波功率
Microwave power
B
时间(h)
Time
C
料液比(w /v)
Ｒatio of solid-liquid
D
误差
Error
提取率 Extraction yield(mg /g)
1 2 3 均值 Means
1 1 1 1 1 3． 747 3． 856 3． 585 3． 729
2 1 2 2 2 4． 127 4． 290 4． 398 4． 272
3 1 3 3 3 4． 072 4． 181 4． 181 4． 145
4 2 1 2 3 3． 964 3． 856 4． 127 3． 982
5 2 2 3 1 4． 181 4． 343 4． 452 4． 325
6 2 3 1 2 4． 072 4． 127 3． 856 4． 018
7 3 1 3 2 4． 181 4． 235 4． 398 4． 271
8 3 2 1 3 4． 072 4． 398 4． 506 4． 325
9 3 3 2 1 4． 018 3． 910 4． 181 4． 036
K1 12． 146 12． 045 12． 072 12． 090
K2 12． 325 12． 922 12． 290 12． 561
K3 12． 632 12． 199 12． 741 12． 452
k1 4． 049 3． 994 4． 024 4． 030
k2 4． 108 4． 307 4． 097 4． 187
k3 4． 211 4． 066 4． 247 4． 151
Ｒ 0． 162 0． 313 0． 223 0． 157
2． 3 方差分析
超声波法结果(表 7)显示，乙醇浓度和提取次
数的影响显著，提取时间和料液比的影响不显著。
影响因素顺序:乙醇浓度 A ＞提取次数 C ＞提取时
间 B ＞料液比 D，与直观分析的结果一致。
表 7 超声波法方差分析结果
Table 7 Variance analysis of the extraction results of ultrasonic extraction
方差来源
Source
离差平方和 SS
Sum of deviation
square
自由度 DF
Freedom
平均离差平方和 MS
Sum of squares of
deviation from mean
F 显著性 PSignificant
A 0． 074 2 0． 037 74 显著*
B 0． 011 2 0． 0055 11 不显著
C 0． 073 2 0． 0365 73 显著*
D 0． 003 2 0． 0015 3 不显著
误差 0． 001 2 0． 0005
F0． 05(2，2)= 19 F0． 01(2，2)= 99
浸提法结果(表 8)显示，温度、料液比和时间的
影响极为显著，乙醇浓度影较小。影响因素顺序:提
取时间 B ＞ 料液比 C)＞温度 D ＞乙醇浓度 A，与直
观分析结果一致。此条件总黄酮化合物含量为
6. 294 mg /g。
9811Vol. 25 唐纯翼:青牛胆总黄酮的对比提取研究
表 8 浸提法方差分析结果
Table 8 Variance analysis of the extraction results of lixiviation extraction
方差来源
Source
离差平方和 SS
Sum of deviation
square
自由度 DF
Freedom
平均离差平方和 MS
Sum of squares of
deviation from mean
F 显著性 PSignificant
A 0． 144 2 0． 072 72 显著
B 0． 309 2 0． 155 155 极显著
C 0． 323 2 0． 162 162 极显著
D 0． 866 2 0． 433 433 极显著
误差 0． 002 2 0． 001
F0． 05(2，2)= 19 F0． 01(2，2)= 99
微波法结果(表 9)显示，三个因素的影响均不
显著。影响程度稍强的是萃取时间，其次是料液比
和微波功率，这与直观分析的结果是相一致的。
表 9 微波法方差分析结果
Table 9 Variance analysis of the extraction results of microwave extraction
方差来源
Source
离差平方和 SS
Sum of deviation
square
自由度 DF
Freedom
平均离差平方和 MS
Sum of squares of
deviation from mean
F 显著性 PSignificant
方差来源 离差平方和 SS 自由度 DF 平均离差平方和 MS F 显著性 P
Source Sum of deviation square Freedom Sum of squares of deviation from mean Significant
A 0． 040 2 0． 020 1 不显著
B 0． 161 2 0． 0805 4． 03 不显著
C 0． 078 2 0． 039 1． 95
误差 0． 040 2 0． 020 不显著
F0． 05(2，2)= 19 F0． 01(2，2)= 99
2． 4 最佳方法确定
比较超声波法、浸提法和微波法各自最优水平
总黄酮的含量，浸提法为最佳提取方法(表 10)。
2． 5 精密度试验
称取 5 份样品，按浸提法制备样品液，按“1． 3．
1”测定总黄酮含量，得 5 次同一浓度芦丁标样品的
吸光度 A 值分别为 0． 179、0． 180、0． 178、0． 181、
0. 176，平均 0． 1788，Sr 为 1． 08%，表明精密度良好。
2． 6 浸提法回收率试验
称取 2． 000 g 青牛胆样品各 5 份，其中 3 份加
入一定量的芦丁标准品，按“1． 3． 1”测定总黄酮含
量，计算回收率(表 12)。
表 10 不同提取方法的实验结果比较
Table 10 Comparison of extraction results with different extraction methods
提取方法
Extraction method
超声提取法
Ultrasonic extraction method
浸提法
Immersion extraction
微波提取法
Microwave extraction method
提取率 Extraction yield(mg /g) 4． 690 6． 294 4． 425
表 12 回收率实验结果(n = 5)
Table 12 Ｒesults of recovery experiment (n = 5)
样品含量
Content of samples(mg)
加入量
Sample
measurement(mg)
加标测得量
Mensuration
contents(mg)
回收率
Ｒecycle rate(%)
平均回收率
Average
recycle rate(%)
ＲSD(%)
0． 126 0． 2 0． 316 95
0． 126 0． 3 0． 416 96． 5
0． 126 0． 4 0． 5 93． 5 96． 5 1． 776
0． 126 0． 5 0． 611 97
0． 126 0． 6 0． 702 96
0911 天然产物研究与开发 Vol. 25
3 结论
超声波法、浸提法、微波法三种方法中，浸提法
为最佳方法。最佳因素水平:乙醇体积分数 60%，1
∶ 30 料液比，提取温度 90 ℃，浸提 4 h。此条件下总
黄酮提取率为 6． 294 mg /g，说明青牛胆具有很好的
开发利用价值。大量药理实验研究表明，黄酮类化
合物有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等
作用，因而广泛用于医药、食品等行业，具有极广的
开发前景。本研究从青牛胆中提取出总黄酮并测定
了含量，为建立该药材的质量标准提供了理论依据。
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