全 文 ：3 讨论
中国药典 2015 年版微生物计数方法适用性试验与 2010
年版的微生物限度验证试验有很多不同之处，微生物计数方
法的变化尤为明显:2010 年版试验方法是将菌液和供试液
分别加入到平皿中，即两者在倾注培养基之前不接触;而
2015 年版试验方法是先将不超过供试液体积 1%的菌液加
入到供试液中并且混匀后，再将此混合液加入到平皿中，即
2015 年版方法是在倾注培养基前，菌液与供试液已先适当
接触，这使新版方法更能反映出药品对微生物的抑制作用。
因此，精致冠心片按照两版方法试验虽然都对枯草芽孢杆菌
抑制，但按 2010 年版方法，采用培养基稀释法即能使枯草芽
孢杆菌回收率符合规定，而按 2015 年版方法，需用薄膜过滤
法才能使其回收率达到要求。另外，虽然两版药典对大肠埃
希菌(控制菌)的试验方法、所用培养基不同，但精制冠心片
对大肠埃希菌的抑制作用弱，因此其对控制菌的检查，均可
采用常规法。
参 考 文 献
1 中国药典［S］． 2010 年版．一部． 1213-1214，附录 79-85
2 中国药典［S］． 2015 年版．四部． 1698-1699，140-149
3 李秀英，黄文华，涂爱国． 精制冠心片的配伍机制研究［J］． 江西
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品科学，2015，40(2) :311-313
(2016-03-16 收稿 2016-05-17 修回)
通讯作者:李明 Tel:13793159405 E-mail:liming250011@ 163． com
HPLC法同时测定不同产地荔枝草中齐墩果酸和熊果酸含量
李明 (山东中医药大学附属医院 济南 250011)
摘 要 目的:建立 HPLC法同时测定不同产地荔枝草中齐墩果酸和熊果酸的含量。方法:采用 Agilent-C18色谱柱(250 mm
×4． 6 mm，5 μm) ，流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90 ∶ 10 ∶ 0． 03 ∶ 0． 06) ，检测波长:210 nm，流速:1． 0 ml·min －1，柱温:25
℃。结果:齐墩果酸在7． 50 ～ 75． 00 μg· ml －1、熊果酸在5． 00 ～ 50． 00 μg · ml －1浓度范围内线性关系良好，r 均为0． 999 7。
齐墩果酸和熊果酸的平均加样回收率分别为100． 15%(ＲSD = 1． 14%，n = 6)、99． 40%(ＲSD = 1． 67%，n = 6)。结论:该方法简
便、准确，适用于荔枝草中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。
关键词 高效液相色谱法;荔枝草;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:Ｒ927． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)09-1776-03
Simultaneous Determination of Oleanic Acid and Ursolic Acid in Salvia Plebeia Ｒ． Br． from Different Ori-
gins by HPLC
Li Ming(Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250011，China)
ABSTＲACT Objective:To develop an HPLC method for the simultaneous determination of oleanic acid and ursolic acid in Salvia
plebeia Ｒ． Br． from different origins． Methods:The column was Agilent-C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm)with the temperature of 25℃，
the mobile phase was methanol-water-glacial acetic acid-triethylamine (90 ∶ 10 ∶ 0． 03 ∶ 0． 06)at the flow rate of 1． 0 ml·min －1，and
the detection wavelength was 210 nm． Ｒesults:The calibration curves were linear within the range of 7． 50-75． 00 μg · ml －1 for
oleanic acid(r = 0． 999 7)and 5． 00-50． 00 μg · ml －1 for ursolic acid(r = 0． 999 7)． The average recovery of oleanic acid and ursolic
acid was 100． 15%(ＲSD = 1． 14%，n = 6)and 99． 40%(ＲSD = 1． 67%，n = 6) ，respectively． Conclusion:The method is simple and
accurate，which is suitable for the determination of oleanic acid and ursolic acid in Salvia plebeia Ｒ． Br． from different origins．
KEY WOＲDS HPLC;Salvia Plebeia Ｒ． Br．;Oleanic acid;Ursolic acid
荔枝草系唇形科荔枝草 Salvia plebeia Ｒ． Br．的干燥地上
部分，性凉，味苦、辛，具清热、解毒、凉血、利尿等作用，用于
咽喉肿痛、支气管炎、肾炎水肿、痈肿，外治乳腺炎、痔疮肿
痛、出血等［1］，产于除新疆、甘肃、青海、西藏以外的全国各
地，还具有保肝、止咳平喘、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等
作用。其主要含有二萜类、三萜类、黄酮类等成分［2 ～ 4］。
对于荔枝草的质量控制方法近年来研究已有报道，多为
黄酮类成分。现代研究发现荔枝草中含齐墩果酸、熊果酸等
多种有机酸类成分［5，6］，且在药物中共同发挥药理活性，国
内外未见对其进行含量测定的相关报道。为保证其临床使
6771
www． zgys． org 研究报告
用疗效，本研究建立了 HPLC同时测定荔枝草中齐墩果酸和
熊果酸含量的方法，现报道如下。
1 仪器与试药
1． 1 仪器
LC-2010 高效液相色谱仪(日本岛津公司，UV 检测器，
Class-VP工作站) ，BSA124S 电子分析电平(德国赛多利斯电
子天平) ，KQ-300E 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司，400W，40kHz)。
1． 2 试药
取产地分别为贵州安龙(批号:20160121、20160219)、贵
州翁安(批号:20160312、20160326)、福建福州(批号:
20160217、20160226)、江西(批号:201600211)、广东(批号:
201600211)、湖 南 (批 号:201600318)、湖 北 (批 号:
201600318)的荔枝草进行试验，荔枝草经山东中医药大学李
峰教授鉴定均为唇形科植物荔枝草 Salvia plebeian Ｒ． Br．的
干燥地上部分。齐墩果酸对照品(供含量测定用，含量大于
98%，中国食品药品检定研究院，批号:110709-201206) ;熊
果酸对照品(供含量测定用，含量大于 98%，中国食品药品
检定研究院，批号:110742-201220)。甲醇为色谱纯(美国
Fisher公司) ，水为重蒸水，其他试药均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 溶液的配制
2． 1． 1 对照品溶液 对照品储备液的制备:分别精密称取
齐墩果酸对照品和熊果酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释成
浓度分别为 150 ，100 μg· ml －1的溶液，即得。对照品溶液
的制备:精密量取对照品储备液 2 ml，置 10 ml 量瓶中，加甲
醇定容至刻度，摇匀，即得(齐墩果酸及熊果酸对照品的浓度
分别为 30 ，20 μg· ml －1)。
2． 1． 2 供试品溶液 取荔枝草粉末(过 40 目筛)约1． 0 g，
精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 ml，密塞，称定
重量，超声处理(250 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，
加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，以微孔滤膜
(0． 22 μm)滤过，即得。
2． 2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Agilent-C18(250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ;流动相:
甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90 ∶ 10 ∶ 0． 03 ∶ 0． 06) ;检测波长:
210 nm;流速:1． 0 ml·min －1;柱温:25 ℃;进样量:10 μl。在
上述测定条件下，荔枝草中齐墩果酸和熊果酸基线分离良
好，理论板数按熊果酸峰计算应不低于 3 000，峰与相邻峰的
分离度大于 2，色谱图见图 1。
2． 3 线性关系考察
分别精密量取齐墩果酸和熊果酸对照品储备液0． 5，1，
2，3，4，5 ml，置于 10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制
得系列混合对照品溶液。按“2． 2”项下色谱条件分别进行
测定，以峰面积为纵坐标(Y) ，浓度为横坐标(X，μg ·
ml －1)绘制标准曲线，得齐墩果酸和熊果酸的回归方程为:齐
墩果酸 Y = 15． 13X － 6． 72，r = 0． 999 7;熊果酸 Y = 15． 49X －
7． 98，r = 0． 999 7。结果表明，齐墩果酸在7． 50 ～ 75． 00 μg ·
A．对照品 B．供试品 1．熊果酸 2．齐墩果酸
图 1 荔枝草中齐墩果酸和熊果酸的 HPLC色谱图
ml －1、熊果酸在5． 00 ～ 50． 00μg · ml －1浓度范围内与峰面积
呈良好的线性关系。
2． 4 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液 10 μl，按“2． 2”项下色谱条件
重复进样 6 次，记录峰面积。结果得齐墩果酸和熊果酸峰面
积 ＲSD分别为0． 78%(n = 6)、1． 49%(n = 6) ，表明仪器精密
度良好。
2． 5 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，10，12 h 按
“2． 2”项下色谱条件进行测定，结果得齐墩果酸和熊果酸峰
面积 ＲSD分别为1． 10%、2． 24%，表明供试品溶液在 12 h内
稳定。
2． 6 重复性试验
取同一产地(湖北)荔枝草粉末(过 40 目筛)6 份，每份
约1． 0 g，精密称定，按上述供试品溶液制备方法制备，按
“2． 2”项下色谱条件进样测定，结果得齐墩果酸和熊果酸的
平均含量分别为 0． 716，0． 482 mg · g －1，ＲSD 分别为
1． 09%、1． 99%，表明本法重复性良好。
2． 7 加样回收率试验
取已知含量的同一产地(湖北)荔枝草粉末约0． 5 g，共
6 份，精密称定，分别精密加入齐墩果酸0． 36 mg · ml －1及
表 1 不同产地不同批次含量测定结果(mg· g －1，n =2)
产地(批号) 齐墩果酸 熊果酸
贵州安龙 1(051012) 0． 7108 0． 4795
贵州安龙 2(051007) 0． 7210 0． 4916
贵州翁安 1(051127) 0． 7070 0． 4805
贵州翁安 2(051209) 0． 7291 0． 4772
福建福州 1(050906) 0． 7144 0． 4940
福建福州 2(051008) 0． 7156 0． 4681
江西(060207) 0． 6987 0． 4591
广东(060218) 0． 6954 0． 4603
湖南(060307) 0． 7006 0． 4705
湖北(060228) 0． 7162 0． 4719
(下转第 1780 页)
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中国药师 2016 年第 19 卷第 9 期 China Pharmacist 2016，Vol． 19 No． 09
· ml －1、丹参酮ⅡA 0． 239 9 mg· ml
－1) ，挥干溶剂，按照
“2． 3”项下方法制成加样供试液。精密吸取加样供试液
0． 5 μl，按“2． 1”项下色谱条件进行测定，计算得加样回收率
分 别 为 98． 78%，97． 99%，98． 44%，99． 12%，98． 82%，
97． 80%，ＲSD 分 别 为 0． 50%，0． 76%，0． 85%，0． 66%，
0． 81%，0． 80%(n = 6)。测定结果表明，各成分加样回收率
均良好。
2． 11 样品测定
取 3 批精制冠心片，按“2． 3”项下方法制备供试品溶
液，按“2． 1”项下色谱条件进行测定，结果见表 1。
表 1 样品含量测定结果(mg /片，n =3)
批号 芍药苷 迷迭香酸
丹酚
酸 B
藁本
内酯
隐丹
参酮
丹参酮
ⅡA
XZYY140203 0． 1020 0． 1630 1． 1600 0． 1840 0． 2410 0． 3090
XZYY140801 0． 1340 0． 1580 1． 2090 0． 1730 0． 2320 0． 3110
XZYY140803 0． 1270 0． 1600 1． 1770 0． 1800 0． 2440 0． 3130
3 讨论
采用多成分含量测定法控制中药的质量已成为一种检
测趋势［6 ～ 10］。精制冠心片中化学成分复杂，采用 DAD 检测
器可同时检测丹参中的迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮和丹
参酮ⅡA，川芎中的藁本内酯，赤芍中的芍药苷。
本试验参考有关文献［2 ～ 5］，比较了以 70%甲醇、80%甲
醇、90%甲醇、80%乙醇为提取溶剂，及分别超声(300 W，40
kHz)20、30、40 min的提取方法，发现 80%甲醇超声(300 W，
40 kHz)30 min的方法提取效果最好。
精制冠心片中各化学成分极性差别较大，采用等度洗脱
难以达到满意的分离效果，以此考虑采用梯度洗脱。本试验
曾参考文献报道［4，5］分别考察了乙腈-0． 1% 甲酸、乙腈-
0． 05%磷酸不同比例的流动相，并对梯度比例进行研究，最
终确定了“2． 1”项下的流动相，该流动相下样品中 6 种成分
与其他组分峰可达基线分离。
经查询相关文献［3，4］，公开发表的精制冠心片质量控制
的探讨性文章中，同时测定芍药苷，迷迭香酸，丹酚酸 B，藁
本内酯，隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的方法未见报道。本文建立
的 UHPLC-DAD法对精制冠心片中 6 种成分同时进行测定，
为精制冠心片的质量控制提供参考。
参 考 文 献
1 李秀英，黄文华，涂爱国． 精制冠心片的配伍机制研究［J］． 江西
中医药，2013，44(2) :67-68
2 中国药典［S］． 2015 年版． 一部． 76-77，1698-1699
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(2016-04-21 收稿 2016-05-13 修回
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
)
(上接第 1777 页)
熊果酸0． 24 mg · ml －1的混合对照品 1 ml，然后按供试品溶
液的制备方法进行制备，按上述色谱条件进样测定，记录峰
面积并计算加样回收率。结果得齐墩果酸和熊果酸的平均
加样回收率分别为100． 15%(ＲSD = 1． 14%，n = 6)、99． 40%
(ＲSD = 1． 67%，n = 6)。
2． 8 样品含量测定
取不同产地荔枝草，按“2． 1． 2”项下方法制备，“2． 2”项
下色谱条件测定，结果见表 1。
3 讨论
流动相的选择上，因鲜见齐墩果酸和熊果酸含量测定方
法，本文经过多次试验摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系统，
甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流动相系统，结果以甲醇-水-冰醋
酸-三乙胺系统时，供试品各峰分离度良好，后经反复调试流
动相比例，最终确定流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90 ∶
10 ∶ 0． 03 ∶ 0． 06) ，该条件下指标成分齐墩果酸和熊果酸峰与
杂质峰分离良好，保留时间合适。检测波长的选择上，对一
定浓度的混合对照品溶液进行紫外扫描，结果在 210 nm 处
齐墩果酸和熊果酸均有较大吸收，故选择选择 210 nm 作为
检测波长［7，8］。
供试品溶液制备方法的选择，本文考察了甲醇回流、超
声两种提取方法，结果回流与超声效果相当，故选择超声方
法;又考察了超声 15，30，45 min 的结果，发现超声 30min 后
含量不再增加;溶剂用量考察了 15，25，50 ml，结果表明 25
ml比 15 ml提取的含量高，而与 50 ml 提取的效果相近，因
此最终确定供试品溶液制备方法为加 25 ml 甲醇超声处理
30 min。
参 考 文 献
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(2016-04-06 收稿 2016-05-13 修回)
0871
www． zgys． org 研究报告