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凉粉草药材生产质量的指纹图谱评价研究



全 文 :书·研究论文·
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(编号:U0732004) ;广东省科技厅中药现代化专项(编号:K5080016)
通讯作者:黄松 Tel:(020)32503212 E-mail:hsl318@ yahoo. com. cn
凉粉草药材生产质量的指纹图谱评价研究
章怀奋1 丁婕2 黄松2 赖小平2 (1.岳阳市一人民医院 湖南岳阳 414000;2.广州中医药大学新药开发研究中心)
摘 要 目的:运用指纹图谱技术,对不同采收月份、采收时间和不同加工方法的凉粉草进行质量评价,确定最佳采收时间和
适宜的加工方法。方法:采用高效液相色谱法测定,色谱柱为 Dikma Diamonsil(2)C18柱(250 mm × 4. 6 mm,5 μm) ;流动相为
乙腈-2%甲酸(梯度洗脱) ;检测波长为 320 nm;流速为0. 8 ml·min -1;柱温为 25℃。结果:凉粉草最佳采收月份为 9 ~ 10 月,
最佳采收时间为午后 16:00 左右;加工方法可根据用途作相应的加工。结论:该法准确可靠,重复性好,为凉粉草药材生产质
量控制提供了依据。
关键词 凉粉草;高效液相色谱法;指纹图谱
中图分类号:TQ460. 7 + 2 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2012)04-0439-04
Quality Evaluation of Mesona chinensis Benth. by HPLC Fingerprints
Zhang Huaifen1,Ding Jie2,Huang Song2,Lai Xiaoping2(1. The No. 1 Pepole's Hospital of Yueyang,Hunan Yueyang 414000,China;
2. Dept. of New Drug R&D,Guangzhou University of Chinese Medicine)
ABSTRACT Objective:To study the quality of Mesona chinensis Benth with different collecting time and processing method by
HPLC fingerprints to provide scientific basis for the construction of GAP base.Method:HPLC with Dikma Diamonsil(2)C18 column
(250 mm ×4. 6 mm,5 μm)was applied. The chromatographic conditions were as follows:the mobile phase of acetonitrile-2. 0% meth-
ane acid with gradient elution,the detection wavelength of 320 nm,the flow rate of 0. 8 ml·min -1 and the column temperature of
25℃ . Result:The suitable harvest time was from 12:00 to 17:00 in the afternoon of September and October,and the best time was a-
bout 16:00pm. The processing methods should be adjusted according to the pharmacological applications. Conclusion:The method is
repeatable and can be used for the quality control of Mesona chinensis Benth.
KEY WORDS Mesona chinensis Benth;HPLC;Fingerprints
凉粉草(Mesona chinensis Benth.) ,又名仙人草、
仙人冻、仙草、薪草等,为唇形科一年生草本植物,是
一种重要的药食两用的东方植物资源[1]。中医认
为其性凉寒,味甘淡涩,嚼之有胶性,具有清热利湿、
凉血解暑,解渴利水和除热毒之功效[2]。文献报道
称[3,4],凉粉草中主要含有黄酮类、酚类、萜类、鞣
质、氨基酸及多糖等成分,并从中分离出槲皮素、山
奈酚和高山黄芩素等黄酮类化合物。
在我国制定的“中药材生产质量管理规范”
(GAP)中,中药材采收是一个重要环节,并具体要
求必须明确中药材的最佳采收期。确定中药材的最
佳采收期,必须将药材的有效成分含量和药用部位
的生物量积累两方面因素结合起来加以综合考虑。
然而,迄今针对凉粉草药材采收期和加工方法尚无
具体的科学研究依据,本文以期通过高效液相指纹
图谱技术,评价不同采收期和不同加工方法的药材
质量,为凉粉草药材生产质量控制提供依据,也为后
期的凉粉草的开发利用奠定基础。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
戴安 P580 高效液相色谱仪:P580 Pump、ASI-
100 Automated Sample Injector、PDA-100 Photodiode
Array Detector) ,万分之一电子天平 (Sartorius
BP110s,德国 sartorius 公司) ,十万分之一电子天平
(Sartorius CP225D,德国 sartorius公司) ,KQ-250B型
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ,电热恒
温水浴锅 DK-98-11A,FEJ-200 电子称 (d = 0. 1 g) ,
实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有
限公司)。
1. 2 试药
咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所,批
号:110885-200102,供含量测定用) ;凉粉草药材均
由广东南台药业有限公司提供,经广州中医药大学
新药开发与研究中心陈建南研究员鉴定为唇形科
(Labiatae)凉粉草属(Mesona BI.)植物凉粉草(Mes-
ona chinensis Benth.) ,标本(见表 1)存放于广州中
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中国药师 2012 年第 15 卷第 4 期 China Pharmacist 2012,Vol. 15 No. 4
表 1 凉粉草的药材信息
编号 采收时间 采收地点 加工方法 批号
S1 2010 年 7 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100701-20100710
S2 2010 年 8 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100801-20100810
S3 2010 年 9 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100901-20100910
S4 2010 年 10 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20101001-20101010
S5 2010 年 11 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20101101-20101110
S6 2010 年 9 月 08:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100911-20100920
S7 2010 年 9 月 10:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100921-20100930
S8 2010 年 9 月 12:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100931-20100940
S9 2010 年 9 月 14:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100941-20100950
S10 2010 年 9 月 16:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100951-20100960
S11 2010 年 9 月 18:00 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100961-20100970
S12 2010 年 9 月 广东平远 晒至六成干后再阴干 20100971-20100980
S13 2010 年 9 月 广东平远 直接晒干 20100981-20100990
医药大学新药开发研究中心;乙腈为色谱纯(德国
MERCK试剂公司) ,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
采用 Dikma Diamonsil(2)C18色谱柱(250 mm ×
4. 6 mm,5 μm) ;流速为0. 8 ml·min -1,柱温:25℃,
检测波长:320 nm,进样量:20 μl,流动相:乙腈-2. 0%
甲酸溶液。梯度洗脱程序:0 ~ 18 min 乙腈由 10%增
至16. 5%;18 ~ 25 min 乙腈-2. 0%甲酸溶液(16. 5 ∶
83. 5)等度洗脱;25 ~60 min 乙腈由16. 5%增至 24%;
60 ~65 min 乙腈由 24%增至 34%;65 ~ 80 min 乙腈
由 34%增至45%;80 ~90 min 乙腈由45%增至60%;
90 ~95 min 乙腈由 60%增至 10%。分析时间为 90
min,理论塔板数(以咖啡酸计)大于 5 000。
2. 2 对照品溶液的制备
精密称取咖啡酸对照品适量,加甲醇制成每 1
ml含咖啡酸 56 μg的溶液。
2. 3 供试品溶液的制备
精密称取凉粉草药材粗粉1. 00 g,置于具塞锥
形瓶中,精密加入 50%乙醇 50 ml,密塞,称定重量,
于 100℃水浴中回流 1 h,放冷,再称定重量,用 50%
乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液适量,以
0. 22 μm微孔滤膜滤过,即得。
2. 4 对照图谱的生成
选取其中 10 批次的凉粉草药材,按照“2. 1”项
下色谱条件,进样并记录色谱图,并将其色谱图数据
导出* . cdf 格式文件,采用国家药典委员会的中药
色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A 版对其进行
相似度分析。选择图谱中稳定出现的 10 个共有峰,
采用中位数法生成对照指纹图谱,并标定参照峰
“S”,作为以下试验结果的参照图谱。结果见图 1。
2. 5 不同采收月份的凉粉草指纹图谱测定
根据凉粉草药材主要是夏季采收的传统,本文考
察了 7月、8月、9月、10月和 11月凉粉草药材的化学
图 1 凉粉草指纹图谱的对照图谱
成分变化情况,其中每月分别收集 10 批次样品。按
照“2. 1”项下色谱条件,进样并记录色谱图,并将其
色谱图数据导出* . cdf格式文件,采用计算机辅助的
相似度评价。结果见表 2及图 2、图 3。
图 2 不同采收月份的凉粉草特征
指纹图谱各峰的峰面积
图 3 不同采收月份的凉粉草特征指纹图谱
结果表明,采用国家药典委员会的中药色谱指
纹图谱相似度评价系统 2004A 版对其进行相似度
分析,相似度结果分别是 0. 963、0. 971、0. 985、
0. 943、0. 968,均在0. 900以上,说明不同采收月份下
凉粉草的化学成分组成基本一致。从图谱各峰的峰
面积上可以看出,7 月和 8 月的化学成分含量明显
低于 9 月和 10 月的,因此,凉粉草的采收时间需在
显花蕾时开花前进行,即 9 ~ 10 月期间采收是具有
一定科学依据的。在此期间,凉粉草药材各化学成
分的含量积累一定的程度,同时凉粉草原植物枝叶
茂盛,产量达到峰值,兼顾到采收时药用部位生物量
积累的多少、药材的产量和种植的经济利益。
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2. 6 不同采收时间的凉粉草指纹图谱测定
本试验于 9 月采收不同时间点的凉粉草药材,
8:00 ~ 18:00,每隔 2 h采收一次,共 6 个时间点,绘
制各化学成分含量变化曲线,其中每个时间点分别
收集 10 批次样品。按照“2. 1”项下色谱条件,进样
并记录色谱图,并将其色谱图数据导出* . cdf 格式
文件,采用计算机辅助的相似度评价。结果见表 3
及图 4、图 5。
表 2 不同采收月份的凉粉草特征指纹图谱各峰的保留时间和峰面积
峰号 保留时间(min)
采收月份
7 月 8 月 9 月 10 月 11 月
保留时间
RSD(%)
峰面积
RSD(%)
1 15. 36 374. 554 332. 637 855. 442 410. 369 382. 341 0. 00 49. 37
2 27. 24 315. 580 247. 588 1085. 959 1540. 445 324. 249 0. 00 78. 31
3 28. 84 82. 290 46. 819 233. 786 87. 864 81. 326 0. 09 73. 43
4 34. 23 53. 780 69. 739 1087. 158 686. 545 57. 353 0. 00 106. 20
5 38. 27 682. 458 421. 603 769. 215 504. 972 593. 425 0. 00 26. 80
6 43. 15 656. 994 480. 602 2594. 945 2291. 570 645. 538 0. 21 72. 49
7 47. 40 1914. 449 1182. 370 3556. 649 9706. 599 2012. 326 0. 00 94. 71
8 50. 42 324. 388 238. 295 732. 649 1698. 096 304. 408 0. 06 89. 38
9 57. 59 299. 012 256. 352 1147. 694 545. 208 324. 934 0. 00 73. 06
10 69. 82 209. 751 186. 003 412. 683 872. 455 193. 458 0. 00 75. 72
表 3 不同采收时间的凉粉草特征指纹图谱各峰的保留时间和峰面积
峰号 保留时间(min)
采收时间
08:00 10:00 12:00 14:00 16:00 18:00
保留时间
RSD(%)
峰面积
RSD(%)
1 15. 42 436. 171 423. 922 379. 349 422. 675 478. 778 220. 184 0. 00 23. 05
2 27. 41 385. 759 283. 929 563. 277 554. 287 719. 113 298. 246 0. 00 42. 75
3 29. 06 219. 862 91. 440 80. 059 85. 564 128. 469 24. 193 0. 10 61. 57
4 34. 53 36. 358 21. 846 88. 676 74. 651 218. 790 28. 848 0. 14 94. 41
5 38. 58 704. 552 721. 596 621. 880 654. 356 1244. 393 100. 018 0. 00 57. 88
6 43. 53 1171. 096 959. 452 1323. 193 1034. 861 2329. 843 643. 460 0. 14 52. 08
7 47. 74 1475. 649 1946. 189 2230. 028 1992. 902 3127. 049 995. 622 0. 00 36. 91
8 50. 76 220. 653 329. 810 794. 872 574. 505 590. 992 404. 534 0. 04 47. 36
9 57. 98 485. 512 363. 454 701. 210 684. 351 828. 032 385. 112 0. 00 38. 00
10 69. 90 205. 743 155. 931 479. 070 503. 665 540. 438 230. 252 0. 00 57. 80
图 4 不同采收时间的凉粉草特征
指纹图谱各峰的峰面积
图 5 不同采收时间的凉粉草特征指纹图谱
结果表明,采用国家药典委员会的中药色谱指
纹图谱相似度评价系统 2004A 版对其进行相似度
的分析,相似度结果分别是0. 923、0. 972、0. 974、
0. 968、0. 971、0. 940,均在0. 900以上,说明不同采收
时间下凉粉草的化学成分组成基本一致。从指纹图
谱各峰的峰面积值变化上可以看出,各化学成分的
含量变化趋势基本一致,其中 5 号峰、6 号峰和 7 号
峰有明显的峰面积增加的趋势,在下午 16:00 时,三
个峰的含量达到峰值,其余 7 个峰的含量变化幅度
不大。因此,凉粉草的适宜采收时间段为下午,12:
00 ~ 17:00 时间段,其最佳采收时间为午后 16:00
左右。根据结果可以初步推断,凉粉草采收时间与
种植环境中的温度和阳光有一定的关联性,当然也
不排除水质、土壤或其他等环境因素,具体原因还有
待进一步探索。
2. 6 不同加工方法的凉粉草指纹图谱测定
传统上,凉粉草选取晴朗的天气采收后,直接晒
干(D1) ;或晒至半干,堆叠焖之使发酵变黑,再晒至
足干(D2)。本文分别收集两个不同加工方法制得
的十批次样品,通过指纹图谱技术分析评价加工方
法的可行性,按照“2. 1”项下色谱条件,进样并记录
色谱图,并将其色谱图数据导出* . cdf格式文件,采
用计算机辅助的相似度评价。结果见表 4 及图 6。
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中国药师 2012 年第 15 卷第 4 期 China Pharmacist 2012,Vol. 15 No. 4
表 4 不同加工方法的凉粉草特征指纹图谱各峰
的保留时间和峰面积
编号 保留时间 D1 D2 保留时间RSD(%)
峰面积
RSD(%)
1 14. 24 773. 049 650. 174 0. 00 12. 21
2 25. 55 882. 606 1157. 877 0. 00 19. 08
3 27. 03 806. 440 279. 541 0. 03 68. 62
4 32. 02 1098. 950 1146. 451 0. 01 2. 99
5 36. 16 3793. 333 802. 690 0. 00 92. 02
6 40. 92 4603. 130 2817. 670 0. 02 34. 03
7 45. 25 19618. 800 4020. 018 0. 00 93. 32
8 48. 35 374. 576 732. 507 0. 04 45. 72
9 55. 72 1311. 046 1214. 673 0. 00 5. 40
10 69. 53 670. 611 431. 771 0. 00 30. 64
图 6 不同加工方法的凉粉草指纹图谱
结果表明,采用国家药典委员会的中药色谱指
纹图谱相似度评价系统 2004A 版对其进行相似度
的分析,相似度结果分别是0. 926和0. 995,说明不同
的加工方法下凉粉草的化学成分组成基本一致;另
外从指纹图谱上可以看出,样品 D1 比样品 D2 多出
三个明显的峰 (见图 6)。通过紫外吸收光谱的比
对,可以初步推断峰 a 和峰 b 是与咖啡酸(1 号峰)
同类的酚酸类物质,而峰 c可以推断为黄酮类物质。
同时,凉粉草不同的加工方法造成指纹图谱的差异,
还体现在 5 号峰、6 号峰和 7 号峰的含量差异上,具
体原因可能是由于晒至半干的药材堆置发酵引起的
部分成分降解或分解。而影响药材药效的各成分最
优配比并不能通过数值比较予以确定,仍要通过药
理药效研究与临床实践得到进一步确证。因此,凉
粉草的加工方法可根据用途作相应的加工。
3 讨论
3. 1 确定中药材的最佳采收期,必须将药材的有效
成分含量和药用部位的生物量积累两方面因素结合
起来加以综合考虑,同时需要药理药效研究与临床
实践的进一步验证,才具有科学合理性。
3. 2 本文应用指纹图谱技术评价凉粉草药材生产
质量,初步确定:凉粉草药材的采收时间需在显花蕾
时开花前进行,即 9 ~ 10 月期间采收;适宜采收时间
段为下午,即 12:00 ~ 17:00 时间段,其最佳采收时
间为午后 16:00 左右。而凉粉草药材的加工方法暂
时确定为根据用途作相应的加工。
3. 3 评价中药产品质量的最终标准是安全与有效,
所以尚未与药效相结合的化学指纹图谱的作用仍然
是有限的。对中药指纹图谱的深入研究,应将中药
色谱指纹图谱中已知化学成分的变化与中药药效结
果从数量上联系起来,建立中药的“谱效学”,最终
完成指纹图谱对中药的质量控制。
参 考 文 献
1 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M]. 上海:上海人民出版社,
1977. 1915
2 谌国莲,孙远明,黄晓钰,等.中国凉粉草资源的研究与利用[J].
农牧产品开发,2000,7(5) :6-8
3 刘素莲.凉粉草化学成分的初步研究[J]. 中药材,1995,18(5) :
247-248
4 秦立红,郭晓字,范明,等.凉粉草中抗缺氧化学成分[J].沈阳药
科大学学报,2006,23(10) :633-636
(2011-11-13 收稿 2012-01-11 修回
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