免费文献传递   相关文献

基于HPLC法的黄芩和粘毛黄芩药用活性成分相似性、多样性评价



全 文 :http://XBYZ.cbpt.cnki.net
基于HPLC法的黄芩和粘毛黄芩药用活性成分相似性、多样性评价
郭 玲1,雷成康2,杨范莉3,段重阳1,白成科1*(1.陕西师范大学生命科学学院,西安 710119;2.西安市食品药品检验
所,西安 710054;3.西安交通大学药学院,西安 710061)
摘要:目的 评价黄芩及粘毛黄芩中活性成分的相似性及多样性,研究不同干燥方法对两者的影响。方法 在资源调查、收集的
基础上,经不同干燥方法处理后,以 HPLC法测定活性成分含量,并进行对比分析。结果 60℃烘干提高了黄芩中的黄芩素含
量,对其他成分没有显著影响;但对粘毛黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷的含量有一定程度的降低。另外,粘毛黄芩中未检出野黄芩
苷;粘毛黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷的含量(分别为9.89%和2.27%)与黄芩(分别为10.23%和2.33%)相比无显著差异(P>
0.05),但黄芩素和汉黄芩素的含量(分别为0.21%和0.08%)均显著低于黄芩(分别为0.40%和0.16%)(P<0.05)。结论 不
同干燥方法对活性成分有一定影响,粘毛黄芩与黄芩活性成分有差异。
关键词:黄芩;粘毛黄芩;活性成分;相似性;多样性;高效液相色谱法
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.002
中图分类号:R284   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2016)02-0115-04
Similarity and diversity evaluation of bioactive ingredients in S.baicalensis and S.
viscidulaby HPLC
GUO Ling1,LEI Chengkang2,YANG Fanli 3,DUAN Chongyang1,BAI Chengke1*(1.Colege of Life Science,Shaanxi Normal U-
niversity,Xi′an 710119,China;2.Xi′an Municipal Institute for Food and Drug Control,Xi′an 710054,China;3.School of Pharma-
cy,Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China)
Abstract:Objective It is aimed to evaluate the similarity and diversity of bioactive components in Scutellaria baicalensis and those
in S.viscidula,and to study the effects of drying method on their components.Methods The roots of these medicinal plants were
dried at room temperature or in oven at 60℃.The content of bioactive components in dried S.baicalensis and S.viscidula were
simultaneously determined and analyzed by HPLC.Results The content of baicalein was increased in S.baicalensis roots dried by
oven at 60℃compared with those dried at room temperature,while no significant effect was observed on the other components.In
contrast,the contents of baicalin and wogonoside were decreased in S.viscidularoots dried by oven at 60℃.In addition,the com-
ponent scutelarin was not detected in S.viscidula,there is no significant difference between the contents of baicalin and wogono-
side in S.baicalens(10.23%and 2.33%)and S.viscidula(9.89%and 2.27%)(P>0.05),but there is significant diference be-
tween the contents of baicalein and wogonin in S.viscidula(0.21%and 0.08%)and those in S.baicalensis(0.40%and 0.16%)(P<0.05).
Conclusion It is indicated that the different drying method of S.viscidulaand S.baicalensis showed significant effects on the bio-
active components including their type and content.
Key words:S.baicalensis;S.viscidula;bioactive components;similarity;diversity;HPLC
基金项目:中央高校基本科研业务费资助项目(编号:
GK261001269);秦巴山区可持续发展协同创新资
助项目(编号:CIC-QBRSD)
作者简介:郭玲,女,在读博士研究生,实验师
*通信作者:白成科,男,博士,副教授,硕士研究生导师
  黄芩(Radix Scutelariae)为唇形科(Labiatae)黄
芩属植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干
燥根;性寒、味苦,具有清热燥湿、泻火解毒和安胎之
功,为常用中药,用量在中药材市场上位居前10[1-2]。
黄芩的化学成分有黄酮类、酚酸类、苯乙醇、氨基酸、
甾醇、精油、微量元素等[3],其中黄酮类是其最主要的
有效成分,目前鉴定出结构的黄酮类成分已超过40
种[4]。现代药理学研究表明,黄芩起主要作用的药用
活性成分为黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、汉
黄芩苷(wogonoside)、汉黄芩素(wogonin)等,具有
抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤[5]、神经保护[6]、
心血管保护和抗高血糖等生物活性[1,7-9]。
黄芩属植物达360多种,我国有98种43个变
种,广泛分布,南北均有,多为野生[2]。除《中国药典》
收载的正品黄芩(S.baicalensis Georgi)外,在部分地
区,与黄芩同属的其他近缘植物的根也可代黄芩药
用,如在吉林、河北、内蒙和山东等地常用粘毛黄芩
(S.viscidula Bge.)的根作为黄芩的代用品[1,10]。
黄芩和粘毛黄芩同为黄芩亚属狭叶黄芩亚组的黄芩
系,分类上种间存在较近的亲缘关系[11]。
笔者所在课题组前期对黄芩属药用植物资源实
地调查和标本信息查询发现,黄芩野生资源分布在
N25°~50°、E100°~130°范围内,主要分布在我国东
511西北药学杂志 2016年3月 第31卷 第2期
http://XBYZ.cbpt.cnki.net
北地区(吉林和辽宁)、华北地区(内蒙古、河北和山
西)和西北地区(陕西和甘肃),其中内蒙古东南部、河
北、山西大部分地区和陕西的秦岭以北地区是黄芩野
生资源主要集中分布区。前期资源普查结果表明:黄
芩最适宜生长在海拔约1 000m、中性或偏碱性的土
壤、年平均温度范围在-1.1~21.3℃、年降雨量在
487mm的环境。由于黄芩市场需求量大幅增加,野
生资源已难以满足市场需求。粘毛黄芩野生资源主
要分布在黄河流域和黄土高原地区,内蒙古大部分地
区、河北的南部、山西的中北部和陕西的北部都是粘
毛黄芩的集中分布区。其中内蒙古境内大部分地区
均有分布,分布面积最多,野生资源储量也最大。粘
毛黄芩一般适宜生长在土壤pH值为8.0左右、海拔
1 300m左右、年降雨量在400mm的沙质土壤中。粘
毛黄芩野生资源采挖和破坏较轻,野生资源储量丰富。
综合国内外相关文献发现,对黄芩属药用植物的
研究主要集中在药用活性成分的提取分离[12-13]、结
构鉴定、药理药效和种质资源收集方面[5-7,14-16],缺乏
深入探讨和揭示黄芩属种间主要药用活性成分的多
样性及其含量方面的研究。本文在黄芩属药用植物
种质资源调查、收集和保存鉴定的基础上,采集种质
圃同一生态条件下黄芩和粘毛黄芩的根,采用室内自
然晾干和烘箱恒温烘干的方法,应用高效液相色谱法
测定黄芩及粘毛黄芩中6种药用活性成分含量,旨在
通过揭示黄芩和粘毛黄芩种间药用活性成分的差异,
为进一步综合开发利用和合理保护黄芩属药用植物资
源提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器 高效液相色谱仪(Thermo Fisher Ulti-
Mate 3000型);Chromeleon 7.2.1色谱工作站;十万
分之一电子天平(赛多利斯BT25S型);超声波清洗
机(昆山市超声仪器有限公司KQ-300V型)。
1.2 试药 野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄
芩素和汉黄芩素对照品均购于中国药品生物制品检
定研究院。
课题组在2011年7月进行的黄芩属植物种质资
源调查时,分别在河北承德市兴隆县(N40°25′,E117°
29′)和内蒙古赤峰市翁牛特旗(N42°25′,E119°04′)
收集黄芩和粘毛黄芩种质资源,扦插芦头栽培在陕西
师范大学药用植物种质资源圃(N34°09′,E108°54′)。
2014年10月分别采集其根,经陕西师范大学生命科学
学院植物学教研室鉴定为黄芩(S.baicalensis Georgi)、
粘毛黄芩(S.viscidula Bge.)的根。每个样品分2份,
每份0.4kg,一份经室内避光自然干燥(昼夜温度在
10~25℃),另一份经60℃烘箱恒温干燥,2份均干
燥至质量基本不再减少(连续2次称量质量差异在
1%以内),备用。
2 方法
2.1 色谱条件及测定法 色谱柱为C18柱(250mm×
4.6mm,5μm);流动相为甲醇-乙腈-10mL·L
-1甲酸溶
液,按照表1进行线性梯度洗脱;流速为1mL·min-1;
柱温为30℃;检测波长为278nm;进样体积为10μL。
每份样品重复测定3次,取结果的平均值计算。
表1 梯度洗脱程序
Tab.1Gradient elution program
时间/min 甲醇/% 乙腈/% 10mL·L-1甲酸/%
0  15  5  80
60  80  10  10
63  15  5  80
80  15  5  80
2.2 对照品溶液的制备 精密称取野黄芩苷、黄芩
苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素和汉黄芩素对照品各
10mg,分别置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释
至刻度,摇匀,即得各对照品储备液。根据供试品进
样后各成分峰面积大小及比例,精密量取相应对照品
储备液适量,置于25mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,
制成与样品中各成分比例接近的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取上述已干燥的黄芩和粘
毛黄芩样品,按照对角线四分法各取样100g,粉碎成
细粉。精密称取0.25g置于三角瓶中,加体积分数
为70%的甲醇100mL,称定质量,超声(45kHz,300W)
30min,放冷,用体积分数为70%的甲醇补足减失的
质量,摇匀,经0.45μm滤膜滤过,取续滤液作为供
试品溶液。
3 结果与分析
3.1 典型色谱图 按照2.3中色谱条件测定对照品
及样品的典型色谱图。见图1~2。
图1 对照品色谱图
1.野黄芩苷;2.黄芩苷;3.汉黄芩苷;4.芹菜素;5.黄芩素;6.汉黄
芩素
Fig.1HPLC chromatograms of the control
1.scutelarin;2.baicalin;3.wogonoside;4.apigenin;5.baica-
lein;6.wogonin
611 西北药学杂志 2016年3月 第31卷 第2期
http://XBYZ.cbpt.cnki.net
图2 不同处理方法的样品色谱图
a.黄芩(晾干);b.黄芩(烘干);c.粘毛黄芩(晾干);d.粘毛黄
芩(烘干)
Fig.2Chromatograms of samples with diferent processing methods
a.S.baicalensis(natural drying);b.S.baicalensis(oven dr-
ying);c.S.viscidula(natural drying);d.S.viscidula(oven
drying)
用Chromeleon 7.2.1色谱工作站对色谱图进行
适用性评价,结果显示:在既定的色谱条件下,6种成
分均能达到基线分离,分离度均大于1.5;各色谱峰
理论板数均在5 000以上;各峰拖尾因子均小于1.5。
证明1.5中色谱条件对黄芩及粘毛黄芩中6种成分
的测定是适合的,结果可信度较高。
3.2 不同干燥方法对黄芩和粘毛黄芩药用活性成分
含量的影响 黄芩和粘毛黄芩中6种成分不同干燥
方法的含量测定结果见表2。
表2 不同干燥方法的含量测定结果
Tab.2Determination results of different drying methods
成分名称
质量分数/%
自然晾干 烘干
黄芩   野黄芩苷 0.08±0.01  0.11±0.03
黄芩苷 10.23±0.17  10.35±0.14
汉黄芩苷 2.33±0.10  2.09±0.15
芹菜素 - -
黄芩素 0.40±0.03  1.01±0.07*
汉黄芩素 0.16±0.01  0.24±0.04
粘毛黄芩 野黄芩苷 - -
黄芩苷 9.89±0.16  7.32±0.09*
汉黄芩苷 2.27±0.08  1.64±0.03*
芹菜素 - -
黄芩素 0.21±0.03  0.27±0.28
汉黄芩素 0.08±0.02  0.07±0.03
 注:-表示未检出;*P<0.05表示2种处理方法的含量有
显著性差异。
本实验中的黄芩、粘毛黄芩样品中均未检出芹菜
素,粘毛黄芩中未检出野黄芩苷。故仅对黄芩苷、汉
黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素4种成分的含量进行
对比。
对表2数据进行分析,结果显示:黄芩采后烘干
除黄芩素含量显著增加外,其他成分含量与自然晾干
无显著性差异。粘毛黄芩烘干后,黄芩苷含量由
9.89%降至7.32%,汉黄芩苷含量由2.27%降至
1.64%。经初步分析认为,烘干对粘毛黄芩活性成分
影响比黄芩大的原因,可能与黄芩根较粗大、粘毛黄
芩根较细小,烘干导致粘毛黄芩根迅速失水,从而影
响次生代谢产物的合成和积累有关。
3.3 黄芩和粘毛黄芩药用活性成分多样性及含量比
较分析 药用活性成分含量一直是衡量药材质量和
品质的重要依据,但用单一成分的含量不足以评价
和揭示药材的品质。通过高效液相色谱法分析了
黄芩和粘毛黄芩根中药用活性成分含量,结果表
明,自然晾干处理条件下,黄芩中黄芩苷含量
(10.23%)和汉黄芩苷含量(2.33%)与粘毛黄芩相
应成分含量(黄芩苷含量为9.89%、汉黄芩苷含量
为2.27%)无显著差异(P>0.05);除粘毛黄芩不
含野黄芩苷外,黄芩中黄芩素的含量(0.40%)和汉
黄芩素的含量(0.16%)均显著高于粘毛黄芩中相
应成分的含量(黄芩素的含量为0.21%、汉黄芩素
的含量为0.08%)。见图3。说明黄芩和粘毛黄芩在
主要成分上既有相似性又有多样性。
图3 黄芩和粘毛黄芩主要成分比较
Fig.3Comparison of main components in S.baicalensis and
S.viscidula
 注:*P<0.05二者存在显著性差异;**P<0.01二者存在
极显著性差异。
4 讨论
近年来,由于植物化学和药理学的快速发展,青
蒿素和紫杉醇等中医药活性成分对重大疾病的治疗
及其机制被逐渐揭示清楚,中医药开始走出国门并逐
渐受到世界关注和广泛接受[17-18]。黄芩作为清热燥
湿常用中药材,市场需求量一直居高不下,尤其是20
世纪90年代中后期,随着国内经济的快速发展和中
小型植物活性成分提取企业的增加,黄芩在市场上出
711西北药学杂志 2016年3月 第31卷 第2期
http://XBYZ.cbpt.cnki.net
现供不应求的局面,多年无节制的破坏性采挖,导致
黄芩野生资源急剧下降,甚至面临枯竭的境地[14-15]。
随着黄芩苷、黄芩素和汉黄芩苷等黄芩药用活性成分
在抗肿瘤、神经保护、心血管保护和抗高血糖等新功
效的发现[5-7],黄芩药用活性成分的医药及保健品逐
渐增多,从而促使植物提取企业广泛关注药用活性成
分的市场,导致黄芩药材需求量持续增加。同属植物
一般具有相似或相近的次生代谢产物,能否在同属植
物中找出新的药源植物,是研究者面临的新任务。
据文献记载,黄芩属7种植物均具有药用历史,
粘毛黄芩曾被称为小黄芩而长期被民间中医广泛使
用[11]。历版《中国药典》仅收录黄芩为正品药材,且
规定黄芩苷为其质量控制指标性成分[1]。现代药理
学研究表明,黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等
是黄芩中已知的黄酮类药用活性成分,其次生代谢合成
属于苯丙烷代谢途径的分支[4,19]。黄芩属其他6种药
用植物同样含有上述几种活性成分,只是在含量和种
类上存在不同程度的差异[20]。随着现代分析技术的
发展、开发和利用,同属药用植物的活性成分具有十
分广阔的应用前景。
笔者在前期黄芩属药用植物种质资源收集保存
和遗传多样性研究[14-15]的基础上,以 HPLC法探讨
了不同干燥方法对黄芩和粘毛黄芩药用活性成分含
量的影响。结果发现,不同品种的药用植物,采用适
当的初加工方法能避免药用活性成分的降低。进一
步的分析比较发现,粘毛黄芩除了黄芩苷和汉黄芩苷
含量与黄芩无显著差异外,未检出野黄芩苷,且黄芩
素和汉黄芩素的含量均显著低于黄芩。从提取药用
植物活性成分角度来看,物种差异并不影响具有相同
活性成分的药用植物资源的开发利用。因此,本文的
研究结果既为临床选用中药材品种提供参考,同时也
为提取药用活性成分从而扩大药用植物资源提供了
一定的理论依据。
参考文献:
[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京:
中国医药科技出版社,2010:282.
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:六十
五卷第二分册[M].北京:科学出版社,1977:194-196.
[3] Li H B,Jiang Y,Chen F.Separation methods used for
Scutelaria baicalensis active components[J].J Chrom-
atogr B Analyl Technol Biomed Life Sci,2004,812:
277-290.
[4] Horvatha C R,Martos P A,Saxena P K.Identification
and quantification of eight flavones in root and shoot
tissues of the medicinal plant Huang-qin(Scutellaria
baicalensis Georgi)using high-performance liquid chro-
matography with diode array and mass spectrometric
detection [J].J Chromatogr A,2005,1062(2):
199-207.
[5] 李景松,张贵军,张智圆,等。黄芩药材中活性成分黄
芩苷的研究概况[J].世界中医药,2013,8(4):469-471.
[6] Weber M L.New therapeutic aspects of flavones:the
anticancer properties of Scutellariaand its main active
constituents wogonin,baicalein and baicalin[J].Canc-
er Treat Rev,2009,35(1):57-68.
[7] Shin J W,Kang H C,Shim J,et al.Scutellaria ba-
icalensis attenuates blood-brain barrier disruption after
intracerebral hemorrhage in rats[J].Am J Chin Med,
2012,40(1):85-96.
[8] Stavnichuk R,Drel V R,Shevalye H ,et al.Baicalein
aleviates diabetic peripheral neuropathy through inhi-
bition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK
activation[J].Exp Neurol,2011,230(1):106-113.
[9] 王雅芳,李婷,唐正海,等.中药黄芩的化学成分及药理
研究进展[J].中华中医药学刊,2015,33(1):1-6.
[10]任晓东,符伟,张晓芸,等.天然产物汉黄芩素的研究进
展[J].中国新药杂志,2011,20(9):777-784.
[11]何春年,彭勇,肖伟,等.中国黄芩属植物传统药物学初
步整理[J].中国现代中药,2012,14(1):16-20.
[12]李玉山.黄芩的化学成分及黄芩苷的提取方法[J].西
北药学杂志,2008,13(6):410-411.
[13]姚亚红,张立伟.黄芩素提取工艺研究[J].西北药学杂
志,2008,23(5):280-282.
[14]白成科,文苗苗,于凤,等.基于ISSR分子标记技术构
建黄芩核心种质的方法研究[J].中药材,2011,33
(11):1689-1694.
[15]文苗苗,李桂双,白成科.黄芩种质资源ISSR遗传多样
性的分析及评价[J].植物研究,2012,32(1):32-37.
[16]宋双红,张媛,王喆之.HPLC法测定不同产地黄芩中
黄酮化合物的含量[J].中国中药杂志,2006,31(7):
598-600.
[17]Tu Y Y.The discovery of artemisinin(qinghaosu)and
gifts from Chinese medicine[J].Nature,2011,408:
1217-1220.
[18]Gilbert N.Herbal medicine rule book[J].Nature,
2011,408:98-99.
[19]高中洪,黄开勋,徐辉碧.黄芩中黄酮类生物活性的研
究进展[J].中国药学杂志,1998,33(12):705-707.
[20]李作平,卫恒巧.黄芩属植物化学成分的研究概况[J].
国外医药·植物药分册,1994,9(4):147-156.
(收稿日期:2015-06-08)
811 西北药学杂志 2016年3月 第31卷 第2期