全 文 ：· 25 ·
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期 生物工程
雪里蕻(Brassica juncea var.multiceps)属于十
字花科芸薹属芥菜种，是分蘖芥的一个变种。发
酵主要利用乳酸菌产生乳酸、醋酸、丙酸等有机
酸，这些产物赋予发酵果蔬柔和酸味；发酵过程
产生酸性环境可抑制腐败菌与病原菌生长。发酵
收稿日期：2013-03-06 *通讯作者
基金项目：贵州省重点实验室建设项目(黔科合计Z字[2012]4001)；贵州省农业攻关项目(黔科合NY字[2011]3100号)。
作者简介：谢国芳(1987—)，男，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏。
能改善产品营养价值，赋予特殊风味[1]。用于发酵
果蔬的乳酸菌主要有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、
肠膜明串珠菌等[4]。
目前雪里蕻发酵制品的研究多是成熟的乳酸
菌，研究方向多在降低亚硝酸盐规律方面，强化
谢国芳1,2，谭书明3*，桂 峰3
(1.贵州大学化学与化工学院，贵阳 550025；2.贵阳学院食品与制药工程学院，贵阳
550005；3.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025)
摘要：从5种优质雪里蕻腌制品中分离纯化出产酸微生物37株，通过试验确认发酵雪里蕻中优
势微生物为乳酸菌。从产香能力、降解亚硝酸盐试验、氨基酸脱羧酶试验3方面考虑，最终筛
选出3个菌株，分别为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)、
希腊魏斯氏菌(Weissella.hellenica)。
关键词：雪里蕻；腌菜；乳酸菌；分离鉴定
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)10-0025-05
Screening and indentifi cation of the fi ne strain in producing
potherb mustard pickle
XIE Guo-fang1,2, TAN Shu-ming3*, GUI Feng3
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025;
2.Food and Pharmaceutical Engineering Institute, Guiyang University, Guiyang 550005;
3.College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025)
Abstract: The 37 kinds of microbes that can produce acid were isolated from 5 potherb mustard samples
pickle. Assays proved that the microbes that can produce acid were the predominant microbes in the
zymolytic potherb mustard. 3 strains were screened with 3 factors including ability of different strains
producing acetaldehyde and degradation of nitrite and amino acid decarboxylases assay, 3 kinds of
microorganism are found which are Lactobacillus. curvatus, Lactobacillus. plantarum and Weissalla.
hellenica.
Key words: potherb mustard; pickle; lactic acid bacteria; isolation and identifi cation
雪里蕻腌菜优良菌株分离、筛选
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.10.026
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2013年 第38卷 第10期生物工程
· 26 ·
发酵与自然发酵在风味比较方面研究较少。为研
究菌种强化发酵对雪里蕻品质及风味的影响，本
研究从5种雪里蕻腌制品中分离纯化出适合雪里蕻
发酵的菌株，通过形态学、生理生化及分子生物
学相结合对纯化菌株进行鉴定，为生产及发酵腌
菜风味和营养价值评定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
使用传统腌制方法自制雪里蕻腌菜：分别添
加6%、10%的食盐腌制雪里蕻(新鲜雪里蕻自然风
干至水分70%)；市售腌制雪里蕻、大池腌制雪里
蕻：金沙县雄泰绿色食品发展有限公司；金沙县
农户自制雪里蕻腌菜。分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ、Ⅴ。
MRS培养基、CaMRS(MRS培养基添加碳酸钙
8 g)、PY基础培养基、PYG培养基(在PY培养基中
加入1.0 g葡萄糖)、葡聚糖产生培养基、硫化氢产
生培养基、TSB肉汤培养基、营养琼脂培养基、
PDA培养基、孟加拉红培养基、细菌计数培养
基、氨基酸脱羧酶试验用培养基；盐溶液配制参
照文献[5]；雪里蕻菜汁培养基：雪里蕻菜汁1000
g、葡萄糖20 g、柠檬酸三铵2 g；糖、醇类发酵生
化鉴定管：青岛海博生物有限公司。
1.2 仪器与设备
TGLL-18G型高速冷冻离心机：江苏省太仓
市仪器厂；TC-25/H型PCR自动扩增仪；PYX-
DHS型隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器
械厂；ZF-401型可见紫外光检测仪：上海光点仪
器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 腌制雪里蕻微生物区系调查 计数方法参考
GB/T 4789.2—2008的测定方法。在无菌条件下，
取待测样品25 g，剪碎放于含有225 mL生理盐水
的三角瓶中浸泡1 h，震荡混匀。做系列10倍梯度
稀释，取合适浓度的稀释液涂布于细菌计数培养
基、CaMRS培养基和孟加拉红培养基平板进行分
离、培养。
1.3.2 产酸细菌的分离、纯化 取1 mL雪里蕻腌
菜加入9 mL已灭菌的生理盐水中，浸泡1 h，震荡
混匀。依次做梯度稀释试验，筛选合适的梯度稀
释均匀涂布于CaMRS固体培养基上32 ℃培养24 h
后，挑取有溶钙圈的单菌落，在MRS固体培养基
上反复划线分离，结合菌株细胞的显微形态和革
兰染色结果，判断菌株的纯度，纯化后编号，保
存备用。
1.3.3 优良菌株的筛选 将分离得到的产酸菌株通
过芽孢染色，选择其中不产芽孢的菌株，通过产
香能力、亚硝酸盐降解能力、氨基酸脱羧酶反应
为指标对菌株进行筛选。
1.3.3.1 产香能力测定 以乙醛产量衡量乳酸菌
产香能力。将分离、纯化菌株接入已经灭菌的5
mL MRS液体培养基，于32 ℃条件下培养24 h，测
OD600值，用无菌水稀释至相同值，取此菌悬液4
mL接入200 mL雪里蕻蔬菜汁培养基后，32 ℃培养
72 h。测定培养基中乙醛含量。
1.3.3.2 亚硝酸盐降解能力 将分离、纯化菌株接
入已经灭菌的5 mL MRS液体培养基中，于32 ℃条
件下培养24 h，测OD600值，用无菌水稀释至相同
量，取此菌悬液0.2 mL接入10 mL已灭菌的亚硝酸
盐浓度为0.25 mg/mL的MRS液体培养基中，32 ℃
条件下培养72 h，盐酸萘乙二胺法测定其培养液
中OD458值，计算降解率。
降解率(%)=(接种后培养基OD458值/未接种培
养基中OD458值)×100
1.3.3.3 氨基酸脱羧酶试验 将分离、纯化菌株分
别接入氨基酸脱羧酶试验培养基内，混匀，并在
其上层加盖无菌的石蜡矿物油。放置在35 ℃下，
培养72 h，观察结果，培养基转变为黄色，表示
分解葡萄糖产酸，为阴性反应。培养基内pH指示
剂显示紫色，表明氨基酸经乳酸菌酶解，释放有
碱性产物，为阳性反应。
1.3.4 优良发酵菌株的鉴定
1.3.4.1 菌落及菌体形态观察 将初步筛选的菌株
接种至MRS固体培养基上，划线分离得到单个菌
落，32 ℃培养1~2 d，观察菌落形态，进行革兰染
色，镜检。观察各菌株革兰染色结果和菌体在光
学显微镜下的形态。
1.3.4.2 生理生化特性鉴定 石蕊牛乳试验、过
氧化氢酶试验、产生吲哚试验、葡聚糖的产生试
验、运动性试验、V-P试验、葡萄糖产气试验、
葡聚糖的产生试验参照文献[2-3]进行。
1.3.4.3 菌株的16S rRNA分子学鉴定 染色体DNA
的提取：取活化后的待测菌株，MRS液体培养基
培养24 h，取1 mL菌悬液，15000 r/min离心，去
上清液，无菌水洗涤，离心，去上清液，反复
几次。获得菌体沉淀。使用天根公司生产的细菌
DNA提取试剂盒提取DNA。
· 27 ·
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期 生物工程
PCR扩增于检测：建立25 μL PCR扩增反应
体系：2×Taq PCR Master Mix(含染料)12.5 μL，
上下游引物(引物浓度10 μmol/L)各1.0 μL，模
板DNA1.0 μL，用无菌ddH2O补足25 μL体系。
PCR反应的循环条件为94 ℃预变性5 min，30个循
环(94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5
min)，72 ℃延伸7 min后终止反应，4 ℃保存。扩
增产物经2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后用凝胶成
像系统观察并拍照保存，送生工生物工程(上海)有
限公司测序。
2 结果与分析
2.1 雪里蕻腌制品微生物区系调查
菌体形态，并且尽可能多地选择菌落用以纯化，
以保证分离的全面性。初步分离纯化得到有溶钙
圈的菌株共37株，革兰染色结果均为阳性，芽孢
染色结果均为阴性。其中球菌有9株，杆菌7株，
短杆菌21株。杆菌和短杆菌有的有单生现象，有
的成对出现，有的呈链状，也有的呈弯曲状；球
菌呈球状或卵状，有单生也有成对生长。
由于菌落形态会随着培养基的成分、培养
时间与温度等条件的变化而发生变化，因此，仅
仅通过菌落观察并不能保证菌种鉴定的准确性。
另外，某些菌种在菌落形态方面存在很大的相似
性，所以，不能仅从形态学上对菌株进行分类，
认为形态相近的就是同一种属的菌株，还需要利
用一些生理生化以及基因方面的鉴定方法来进一
步确定其归属问题。形态学仅仅是通过一些宏观
和微观的观察，来初步了解菌落的形态特征。
2.3 优良菌株的筛选
2.3.1 产香能力试验结果
表1 不同菌株产乙醛能力
菌株编号 乙醛含量/(μg/mL) 菌株编号 乙醛含量/(μg/mL)
1 8.35 20 7.05
2 7.05 21 6.81
3 9.50 22 7.15
4 7.50 23 8.53
5 10.00 24 7.42
6 8.34 25 7.45
7 7.80 26 9.35
8 8.70 27 6.87
9 8.45 28 8.10
10 7.41 29 6.25
11 7.55 30 5.55
12 9.15 31 8.15
13 7.00 32 6.05
14 6.50 33 6.75
15 8.47 34 6.85
16 7.50 35 7.71
17 8.30 36 5.32
18 9.65 37 5.67
19 7.95
产香能力试验结果见表1。由表1可知：乙
醛是乳酸菌产生的主要香味成分之一，是乳酸菌
发酵碳水化合物、蛋白质、脂类等代谢过程中的
重要中间产物。在发酵过程中，当pH值降到5.0
时，乳酸菌开始产生乙醛；当pH值为4.3~4.4时，
乳酸菌乙醛产量最大，之后逐渐减少；当pH值为
注：图中柱形从左至右为产酸细菌，酵母菌，细菌，霉菌。
图1 样品中菌株分布状况
由图1可见，5个样品的微生物区系有较大
区别。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ号样品中产酸细菌数量最
高，细菌和霉菌的数量均高于酵母菌含量；Ⅲ号
样品中细菌、霉菌、酵母菌的含量较多，产酸细
菌数量为零，可能与Ⅲ号样品经商业灭菌且该样
品为散装产品有关；Ⅳ号样品中没有分离出产酸
细菌，且酵母菌、细菌、霉菌数量均较少，可能
与Ⅳ号样品为高盐盐渍并且存放在坛子中一年之
久，致使各类微生物严重失活有关。
2.2 产酸细菌分离
在产酸细菌分离过程中，观察在MRS固体培
养基上分离出的单菌落，菌落形态总体状态为：
呈圆形且边缘规则，菌落表面光滑湿润，中央有
凸起或微凹陷，菌落颜色呈乳白色或半透明，菌
落大小均为3 mm以下。由此可见，本试验分离出
的产酸细菌菌落在菌落形态方面的差异不大，可
以用来区分是否为不同种的指标较少，单纯通过
比较单菌落的菌落形态的差异来区分是否为不同
菌种，将不能保证分离结果的全面性。因此在分
离过程中选用了CaMRS固体培养基，将溶钙圈的
大小作为一个新的判断指标引入，结合显微观察
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2013年 第38卷 第10期生物工程
· 28 ·
4.0时，不再产生乙醛。由表1可知，乙醛产量在9
μg/mL以上的菌株有5株，乙醛产量在8~9 μg/mL
之间的菌株有9株，乙醛产量在7~8 μg/mL之间的
菌株有13株，乙醛产量在7 μg/mL以下的菌株有
10株。综合考虑乙醛产量大小与试验对菌株样本
数量的要求，选择乙醛产量在8 μg/mL以上的菌
株共14株做进一步降解亚硝酸盐能力试验。
2.3.2 亚硝酸盐降解能力试验结果 对上述产香能
力较强的14株菌，测定其在MRS液体培养基中对
NaNO2(0.25 mg/mL)的降解率，结果见表2。
表2 不同菌株亚硝酸盐降解率
菌株编号 降解率/% 菌株编号 降解率/%
1 52.59 15 38.77
3 34.69 17 81.63
5 48.79 18 22.45
6 36.93 23 53.06
8 36.73 26 30.61
9 24.69 28 65.30
12 32.65 31 26.53
腌菜中亚硝酸盐的含量是腌菜质量安全性的
一个非常重要的指标，不同种类的乳酸菌对亚硝
酸盐的降解能力是不一样的，所以筛选降解亚硝
酸盐能力强的菌株，对保证腌菜质量安全性是十
分必要的。由表2可知，所有菌株均能降解亚硝酸
盐，但是降解能力不同。总体来说降解率最高的
菌株为17号，亚硝酸盐降解率达到了81.63%；1
号、23号、28号菌株对亚硝酸盐的降解率均达到
了50%以上；18号、31号亚硝酸盐降解率在30%以
下；因此除去9号、18号、31号，保留其余11株菌
株做后续筛选试验。
2.3.3 氨基酸脱羧酶试验结果 通过产香能力试
验、产酸能力试验、亚硝酸盐降解能力试验，最
终选择11株菌株进行氨基酸脱羧酶试验。以验证
这11株是否产生生物胺，试验结果见表3。由表3
可知，以上菌株中除3号、17号、28号菌株能酶解
氨基酸产生碱性物质外，其余菌株菌均不产。通
过产香能力、产酸能力、氨基酸脱羧酶试验，综
合考虑以上试验结果，最终确认8株乳酸菌为优良
菌株，它们分别是1号、5号、6号、8号、12号、
15号、23号、26号。
2.4 优良发酵细菌的鉴定结果
2.4.1 细菌形态学观察
表4 形态学观察结果
菌株编号 菌落形态 菌体形态
1、5 直径2~3 mm，乳白色，凸起，光滑圆整，质地湿润
G＋，杆状，
单个或呈对生
8、15、
23、26
直径2~3 mm，乳白色，凸起，
光滑圆整，质地湿润
G＋，球状，
单个或呈对生
6、12 直径1~2 mm，乳白色，凸起，光滑圆整，质地湿润
G＋，短杆状，
单个或呈对生
细菌形态学观察结果见表4，在分离纯化产
酸细菌过程中，发现本试验划线分离出的单菌落
菌落形态方面的差异并不大，3菌种显微图片见
图2。
图2 3菌种细胞结构图
表3 氨基酸脱羧酶试验结果
氨基酸
菌株编号
1 3 5 6 8 12 15 17 23 26 28
精氨酸 - - - - - - - ＋ - - ＋
赖氨酸 - ＋ - - - - - - - - -
鸟氨酸 - - - - - - - - - - -
2.4.2 生理生化试验 通过对上述8株菌株进行石
蕊牛乳试验、过氧化氢酶试验、产生吲哚试验、
葡聚糖产生试验、运动性试验以及一系列糖醇发
表5 各菌株生理生化特性
项目
菌株编号
1 5 6 8 12 15 23 26
七叶灵 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
甘露醇 ＋ ＋ - ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
果糖 ＋ ＋ ＋ - - - - -
阿拉伯糖 ＋ - ＋ ＋ - ＋ ＋ ＋
纤维二糖 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
鼠李糖 - - - ＋ - - - ＋
麦芽糖 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋
淀粉 - - - - - - - -
甘露糖 ＋ ＋ - ＋ ＋ - ＋ ＋
D-核糖 ＋ ＋ - - - - - -
海藻糖 - - - - - - - -
半乳糖 ＋ ＋ ＋ - - - - -
水杨素 - - - ＋ - - - -
松三糖 - ＋ - - - - - -
· 29 ·
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期 生物工程
酵试验，结果见表5。
根据表4和表5的试验结果，参考《伯杰氏鉴
定细菌学手册》(第8版)，根据生理生化试验结果
与菌体形态观察初步判断1号、5号、6号、12号
菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)，8号、15号、23
号、26号菌株未能鉴定出结果。
2.4.3 菌株的16S rRNA分子生物学鉴定 琼脂糖
凝胶电泳检测结果见图3。由图3可知，在约1500
bp处所有菌株都有单一明亮的条带，与预期大小
一致。
分离得到的菌株与所属种的代表株之间的序列同
源性均超过99%，其中1号、5号菌株是植物乳杆
菌(Lactobacillus.plantarum)，编号B1；6号、12号
菌株是弯曲乳杆菌(Lactobacillus.curvatus)，编号
B2；8号、15号、23号、26号菌株是希腊魏斯氏菌
(Weissella.hellenica)，编号B3。其中植物乳杆菌是
发酵食品中常见的乳酸菌，也是重要的工业用菌
和益生菌，安全性好，生长迅速，产酸能力强。
从腌菜中分离得到弯曲乳杆菌、植物乳杆菌有较
多报道，但从腌菜中分离出希腊魏斯氏菌的报道
不多。
3 结论
从5份雪里蕻腌菜样品中分离出37株产酸细
菌，从产香能力、亚硝酸盐降解能力、是否产生
物胺3个角度考虑最终确定8株菌为优良菌株。通
过生理生化特性试验和16S rRNA测序试验，最终
确认该8株菌种分别为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.
curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)、希
腊魏斯氏菌(Weissella.hellenica)。
参考文献：
[1]　吴浪,徐俐.乳酸菌发酵对雪里蕻挥发性物质及品质的影
响[J].食品科学,2011,32(23):250-255
[2]　杨性民,刘青梅,奚李峰,等.腌渍雪里麒亚硝酸盐含量控
制研究[J].中国食品学报,2004,4(1):48-51
[3]　杨海英,张振宇,佐玉梅,等.腌菜中乳酸菌的分离及产
酸菌筛选研究[J].安徽农业科学 ,2012,40(13):7909-
7910,7915
[4]　R P R Raya, Maria Cristina, Manca De Nadra. Acetaldehyde
metabolism in lactic acid bacteria[J]. MiLchwess-
enschaft,1986,41(7):397-399
[5]　刘景,孙克杰,郭本恒.成品发酵乳主要风味物质与风味
指标的相关性研究[J].中国乳品工业,2011,(12):15-19
[6]　李勇,董翠芳,欧国兵.乳酸菌产香机理和特性的研究[J].
新疆畜牧业,2008,(04):55-61
[7]　东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出
版社,2001:353-398
[8]　Buchanan RE, Gibbons N E. Bergeys Manual of Determinate
Bacteriology[M]. 北京:科学出版社,1984
图3 8株菌株16SrDNA凝胶电泳图片
葡萄糖 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
乳糖 ＋ ＋ ＋ - - - - -
木糖 - ＋ - - - - - -
水杨苷 ＋ ＋ - - - - ＋ -
明胶 - - - - - - - -
运动性 - - - - - - - -
产气 - - - - - - ＋ -
革兰染色 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
芽孢染色 - - - - - - - -
过氧化氢酶
试验 - - - - - - - -
淀粉水解 - - - - - - - -
V-P试验 - - - - - - - -
石蕊牛乳 产酸未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
产酸
未凝
葡聚糖产生 否 否 否 否 否 否 否 否
注：＋，90%或以上为阳性，－，90%或以上为菌株阴性。
续表
《食品科技》2014年每册25元，全年300元
订阅热线：010-67913893
项目
菌株编号
1 5 6 8 12 15 23 26
将所测序列与Genebank中序列进行比对，