全 文 :[作者简介]朱丽,女,主管药师,电话:15327415161 [通讯作者]卢金清,男,教授,电话:027-68890101,E-mail:ljq59169@sohu.com
香荚兰豆药材指纹图谱的研究
朱丽1,卢化1,李肖爽2,卢金清2 (1.武汉市第三医院药剂科,湖北 武汉430060;2.湖北中医药大学/湖北省药用植物研
发中心,湖北 武汉430065)
[摘要] 目的:建立香荚兰豆的HPLC指纹图谱。方法:色谱柱:ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:以甲醇-
水为流动相梯度洗脱;流速为0.8 ml·min-1;检测波长为254 nm;柱温为30℃;结果:在选定的色谱条件下,通过中药色谱指
纹图谱相似度评价系统(2004A),确定香荚兰豆 HPLC指纹图谱共有模式,标定了4个共有峰。结论:该方法简便、准确、重复
性好,为香荚兰豆的鉴别、品质评价和质量控制标准的制定提供科学依据。
[关键词] 香荚兰豆;高效液相色谱法;指纹图谱
[中图分类号]R927.2 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)04-0300-03 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.04.14
Study on HPLC Fingerprint of flavonoids in Vanila planifoli Andrews
ZHU Li 1,LU Hua1,LI Xiao-shuang2,LU Jin-qing2(1.Department of Pharmacy,The Third Hospital in WuHan
430060;Hubei University of Chinese Medicine/Medicinal Plant Research and Development Center of Hubei Province,Wuhan
430065,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To develop an HPLC fingerprint method for quality control of Vanila planifoli Andrews.METHODS
An HPLC analysis was carried out on a Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6 mm,5μm)with the mobile phase consisting
methanol-water in gradient mode.The flow rate was 0.8 ml·min-1and the detection wavelength was 254nm with the column
temperature wa set at 25℃.RESULTS Under the above chromatographic conditions the characteristic peak of fingerprint of
Vanila planifoli Andrews was composed of 4 chromatographic peaks through similarity analysis.CONCLUSION The method is
simple,accurate and has a good repeatability.This study provides scientific foundation for identification,quality evaluation and
quality control standards of Vanila planifoli Andrews.
KEY WORDS:Vanila planifoli Andrews;HPLC;Fingerprint
香荚兰豆为兰科香荚兰属植物香荚兰 Vanila
planifoli Andrews的成熟果实,具有息风止痉、镇静抗
惊等功效。现代研究表明,其主要化学成分为香兰
素,具有镇静和抗惊厥的作用,临床上用于治疗癫痫
痛疗效显著[1-4]。不仅如此,香荚兰豆还是重要的香
原料,其独特的香型使其成为食品、饮料、化妆品等产
品中的主要配香原料,国内使用的香荚兰豆药材原料
主要来源于马达加斯加[5-7],但香荚兰豆尚未被中国
药典收载,国内外有关文献对香荚兰豆原料质量标准
方面的研究报道较少。本实验采用高效液相色谱法
对香荚兰豆指纹图谱进行了研究,并通过《中药指纹
图谱相似度计算软件》计算分析比较,为完善香荚兰
豆原料的评价体系和质量标准提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器 Dionex-Ultimate 3000高效液相色谱
仪,Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5
μm)色谱柱;UP5200H 超声波清洗器(熊猫集团南
京电子计量有限公司);Sartorius CP225D电子分析
天平(d=0.01 mg,北京赛多利斯天平有限公司)。
1.2 试药 香荚兰豆由武汉黄鹤楼香精香料有限
公司提供,药材来源于马达加斯加阿诺那香荚兰公
司(批号分别为100101,100302,100403,100604,
100705,100906,101107,101208,110109,110310),
经湖北中医药大学生药学教研室鉴定为兰科香荚兰
属植物香荚兰Vanila planifolia Andrews的成熟果
实;香兰素对照品(中国食品药品检定研究院,批号
100491-200901,纯度99.0%);对羟基苯甲酸、香草
酸、对羟基苯甲醛对照品(迈舒上海ELISA生物技
术研究所,批号分别为583-43-8,530-57-4,641-73-
7,纯度分别为99.0%,98.5%,99.0%);甲醇为色谱
纯(美国天地公司);其他所用试剂均为分析纯;水为
纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18
(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水为流动相梯
度洗脱;流速为0.8 ml·min-1;柱温为30℃;检测波
长为254 nm;供试品进样量10μl;参照物进样量10
·003· 中国医院药学杂志2014年2月第34卷第4期Chin Hosp Pharm J,Feb 2014,Vol 34,No.4
μl;分析时间:45 min。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Tab 1 Gradient elution procedure
时间/min 流动相A甲醇/% 流动相B水/%
0~5 20 80
5~7 20~35 80~65
7~30 35 65
30~45 20 80
2.2 对照品溶液的制备 分别取香兰素,对羟基苯
甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛对照品适量,精密称定,
加75%乙醇溶液制成每1 ml含50μg的溶液,即得
对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取香荚兰豆原料约1 g,
剪碎,精密称定,精密加入8倍量的75%乙醇溶液,
闭塞,称定质量,超声提取,再称定质量,用75%乙
醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液0.5 ml至
100 ml量瓶中,加75%乙醇定容至刻度,摇匀,用微
孔滤膜(0.45μm)过滤,即得供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶
液10μl,按“2.1”项下的色谱条件连续进样5次,以
香兰素峰作为参照峰,计算各峰的相对保留时间及
相对峰面积。结果表明对羟基苯甲酸,香草酸,对羟
基苯甲醛各色谱峰的相对保留时间 RSD分别为
0.14%,0.23%,0.25%,均小于1%。相对峰面积
RSD分别为1.16%,1.03%,1.15%,均小于1.5%,
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评
价系统”进行评价,相似度大于0.95,结果表明,仪器
的精密度良好。
2.4.2 稳定性试验 取同一香荚兰豆供试品溶液,
按“2.1”项下的色谱条件,分别在0,2,4,8,16,24,
36 h进行检测,以香兰素峰作为参照峰,计算各峰
的相对保留时间及相对峰面积。结果表明各色谱峰
的相对保留时间RSD为0.37%,0.25%,0.34%,均
小于1%。相对峰面积 RSD 为1.34%,1.01%,
1.15%,均小于1.5%。采用国家药典委员会“中药
色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价,相似度大
于0.95,结果表明,供试品溶液在36 h内基本稳定。
2.4.3 重复性试验 取同一批香荚兰豆原料样品5
份,每份约1 g,精密称定,按“2.3”项下方法的方法制
备供试品溶液,按“2.1”项下的色谱条件进样分析,结
果表明各色谱峰的相对保留时间 RSD为0.33%,
0.27%,0.33%,均小于1%。相对峰面积 RSD为
0.91%,0.56%,1.27%,均小于1.5%。采用国家药
典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行
评价,相似度大于0.93,表明本方法重复性良好。
2.5 指纹图谱的建立与特征峰的标定 取10批香
荚兰豆原料,按“2.3”项下的方法分别制备供试品溶
液,按拟定的测定方法,在同一分析条件下测定10
批次香荚兰豆的高效液相色谱图,根据测定结果显
示的峰数、峰面积(积分值)和峰位(相对保留时间)
等相关参数,通过分析比较制定出优化的高效液相
指纹图谱,见图1。
图1 香荚兰豆指纹图谱
Fig 1 Vanilae Fructus on fingerprints
2.6 指纹图谱的分析与评价
2.6.1 共有指纹峰的标定 根据10批次样品的测
定结果来标定共有指纹峰。经过与对照品比对可知
香荚兰豆高效液相指纹图谱中,已标定出共有指纹
峰4个。1~4号共有峰的保留时间(min)/峰面积
(mAU*min)依次分别为:14.160/0.804,15.297/
1.025,16.197/1.015,18.010/4.437。与4号峰(香
兰素参照物)相比,其他3个共有指纹峰的相对保留
时间依次为:0.786,0.850,0.900。见图2~6。
图2 10批次香荚兰豆指纹图谱叠加图
Fig 2 The 10 batches Vanilae Fructus on fingerprints overlay
图3 香草酸对照品的 HPLC图谱
Fig 3 The HPLC chromatogram of vanilic acid reference substance
图4 对羟基苯甲酸对照品的 HPLC图谱
Fig 4 The HPLC chromatogram of 4-Hydroxybenzoic acid refer-
ence substance
·103·中国医院药学杂志2014年2月第34卷第4期Chin Hosp Pharm J,Feb 2014,Vol 34,No.4
图5 对羟基苯甲醛对照品的 HPLC图谱
Fig 5 The HPLC chromatogram of Hygroxybenzaldehyde reference
substance
图6 香兰素对照品的 HPLC图谱
Fig 6 The HPLC chromatogram of Vanilin reference substance
2.6.2 共有指纹峰面积比 4个共有峰的总面积
占整个峰面积的90%以上。
2.6.3 相似度评价 将测定数据导入中药指纹图
谱相似度计算软件,经过选峰,设定其匹配模板,将
谱峰进行自动匹配;设定标准模板,进行谱峰整体相
似性评价和差异性评价;通过中药指纹图谱相似度
计算软件得到香荚兰豆药材 HPLC指纹图谱共有
模式,经过与共有模式比较,来源马达加斯加的10
批香荚兰豆的共有峰的相对保留时间、共有峰相对
峰面积的RSD差别均较小。结论:10批香荚兰豆
药材的相似度大于0.90,说明10批次药材的相关性
良好,结果见表2,3。
表2 10批香荚兰豆指纹图谱4个共有峰的相对保留时间
Tab 2 The 4 peaks relative retention time in the 10 batches
of Vanilae Fructus fingerprints
批号 峰1 峰2 峰3 峰4(S)
100101 0.786 0.855 0.906 1
100302 0.783 0.861 0.911 1
100403 0.785 0.857 0.905 1
100604 0.787 0.854 0.909 1
100705 0.784 0.859 0.903 1
100906 0.789 0.858 0.907 1
101107 0.787 0.859 0.909 1
101208 0.791 0.855 0.907 1
110109 0.784 0.856 0.905 1
110310 0.782 0.858 0.909 1
均值 0.786 0.857 0.907 1
RSD% 0.34 0.24 0.25 0
3 讨论
3.1 提取方法的选择 香荚兰豆中的主要特征性
成分为香兰素。本试验通过对不同提取溶媒、提取
方法进行试验考察,结果表明75%乙醇提取率最
高,超声法比冷浸法的提取方法简便、且提取效率
高。按拟定的供试品溶液的制备方法操作,测定的
指纹图谱色谱峰分离度大于1.5。
表3 10批香荚兰豆指纹图谱4个共有峰的相对峰面积
Tab 3 The 4 peaks relative peak area in the 10 batches of
Vanilae Fructus fingerprints
批号 峰1 峰2 峰3 峰4(S)
100101 0.183 0.235 0.229 1
100302 0.185 0.234 0.223 1
100403 0.186 0.235 0.225 1
100604 0.188 0.236 0.227 1
100705 0.189 0.234 0.228 1
100906 0.184 0.239 0.225 1
101107 0.186 0.238 0.225 1
101208 0.192 0.238 0.233 1
110109 0.185 0.242 0.229 1
110310 0.189 0.239 0.231 1
均值 0.187 0.237 0.228 1
RSD/% 1.40 1.05 1.29 0
3.2 流动相选择 根据参考文献2的色谱条件,对
样品进行分离,分离效果不佳。在此基础上调整梯
度,最终确定了文中所述流动相,可以在保证分离效
果的基础上,较大程度缩短分析时间。在此色谱条
件下,羟基苯甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛、香兰素分
离效果良好。本文通过 DAD检测器在190~400
nm波长范围内进行光谱扫描,考察所测物质紫外
吸收,根据4种成分的紫外吸收特性,选取275 nm
作为检测波长,保证各成分在选定流动相体系中均
有较大吸收。
3.3 香荚兰豆高效液相指纹图谱中,目前用对照品
共标定出共有指纹峰有4个,它们分别是对羟基苯
甲酸、香草酸、对羟基苯甲醛、香草醛。4个共有峰
明显且分离度较好,构成了香荚兰豆药材的指纹图
谱。本文以共有模式对香荚兰豆药材进行真伪鉴
别,能提供更为全面的质量控制信息,可为后续建立
更完善香荚兰豆药材的质量评价体系提供科学参
考。
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[收稿日期]2013-08-15
·203· 中国医院药学杂志2014年2月第34卷第4期Chin Hosp Pharm J,Feb 2014,Vol 34,No.4