全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:1441-1443，1347
文章编号:1001-6880(2012)10-1441-04
收稿日期:2012-01-10 接受日期:2012-06-20
基金项目:海南省社会发展专项(2010SF007) ;海口市重点科技计
划(2010-086) ;海南师范大学科技成果转化项目
(JJCG1101) ;海南师范大学实验室开放性项目
(KFSY11007)
* 通讯作者 E-mail:lhyd123@ sohu． com
神秘果种子蛋白质的提取与降糖效用研究
黄巨波，刘 红* ，卢圣楼，张 浩
海南师范大学 化学与化工学院，海口 571127
摘 要:本文研究神秘果种子蛋白质(SDSP)的提取条件及其降糖效用，通过考察固液比、pH 值、时间和温度等
因素对 SDSP提取率的影响来优化提取蛋白质的条件，并利用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型分析神秘果种子蛋
白质的降糖效果。实验方法如下:将实验组小鼠分为正常对照组、糖尿病模型组、SDSP实验组(200 mg /kg)和阳
性对照组(80 mg /kg二甲双胍) ，灌胃 14 d后测量空腹血糖值(FBG) ，胰岛素含量和体重。实验结果表明 SDSP
的最佳提取工艺条件为固液比 1∶ 20、pH 8． 5、时间 120 min、温度 50 ℃。测定 SDSP组的 FBG含量比模型组降低
46%，而胰岛素含量则增加约 4 倍。实验表明 SDSP显著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促进胰岛素的分泌。
关键词:神秘果;蛋白质;四氧嘧啶;降糖效用
中图分类号:R914 文献标识码:A
Study on Hypoglycemic Activity and Extraction of
Synsepalum Dulcificum Seed Protein
HUANG Ju-bo，LIU Hong* ，LU Sheng-lou，ZHANG Hao
College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571127，China
Abstract:To investigate the extraction efficiency and hypoglycemic activity of Synsepalum Dulcificum seed protein (SD-
SP) ，conditions are investigated by the ratio of solid to liquid，pH，time and temperature to get better extract rate，the hy-
poglycemic activity in diabetic mice induced by intraperitoneal injection of alloxan (180 mg /kg)were done as follows．
All the mice were divided into four groups randomly，including normal control group，model group，SDSP group (200 mg /
kg) ，metfomin group (80 mg /kg) ，weight and fluid intake were monitored every week，fasting blood glucose (FBG)and
insulin were measured after 2 weeks． The optimum extracting conditions:ratio of solid to liquid (w∶ v)1∶ 30，pH 8． 5，
time 120 min，temperature 50 ℃ ． Compared with diabetic model group，the levels of FBG were decreased remarkably to
46% and insulin was increased 4 times in the SDSP group． It demonstrated that the SDSP could significantly lower blood
glucose and promote the secretion of insulin of diabetic mice．
Key words:Synsepalum Dulcificum;protein;alloxan;hypoglycemic
神秘果为山榄科(Sapotaceae)神秘属(Synsepa-
lum)常绿灌木，是一种稀有的种植资源，原产于西
非，自然分布在西非刚果一带，在印度尼西亚的丛林
中也有发现，自 20 世纪 60 年代起先后引入我国海
南、广东、广西、福建等省区种植［1，2］。近期研究发
现，果实中含有的神秘果素除了能够改变味觉
外［3，5］，还具有改善胰岛素抵抗的功能［4］，说明神秘
果可作为糖尿病人的辅助治疗药物进行开发利用，
为进一步考察神秘果对糖尿病的治疗作用［6］，本文
从神秘果种子中提取蛋白质，确定最佳工艺条件，并
用提取出的蛋白质对小鼠进行实验，研究其对糖尿
病小鼠的降血糖效用［7-9］，为糖尿病治疗进一步提供
理论依据。
1 材料与方法
1． 1 主要药品和仪器
新鲜神秘果(海南本地)由海南师范大学生命
科学院钟琼芯副教授鉴定
昆明种♂小鼠由广州中医药大学实验动物中心
提供，生产许可证号:SCXK(粤)2008-0020
血糖仪(三诺安稳)小鼠胰岛素试剂盒(南京
建成生物工程研究所)四氧嘧啶和牛血清白蛋白
(Sigma公司)二甲双胍(石家庄普力制药)其余试
剂均为分析纯
1． 2 神秘果种子蛋白质(SDSP)的提取
将新鲜的神秘果去除果肉得种子，冷冻干燥、研
磨，得神秘果种子粉，用凯氏定氮法测其蛋白质含
量［10］。准确称取神秘果种子粉(2 g 左右)于消化
瓶中，加入催化剂(K2SO4 和 CuSO4) ，浓 H2SO420
mL，消化至呈绿色，冷却加水定容，用硼酸作吸收
液，反应室内加入浓 NaOH，用 0． 05N HCl 滴定。在
神秘果种子粉中加入石油醚或环己烷搅拌脱去其油
脂部分，抽滤分离，在去除油脂的种子粉中加入磷酸
盐的缓冲溶液(并加入少量的巯基乙醇和氯化钠，
以防止蛋白质变性和有利于蛋白质的溶解) ，室温
搅拌过夜，抽提得到蛋白质提取液。取抽提液样品
稀释至适当的倍数，用考马斯亮蓝法(即 Bradford
法)测定粗提液中蛋白质含量［11］，计算提取率(粗蛋
白提取率 =粗提液中蛋白质质量 /种子粉中蛋白质
质量)。
1． 3 正交实验
为确定 SDSP 的最佳提取条件，设计以固液比、
pH值、时间和温度为条件的 L9(3
4)正交优化实验，
各因素所取条件见表 1 所示。
表 1 SDSP提取正交实验因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of extrac-
tion of SDSP
A B C D
固液比 pH值 时间(min) 温度(℃)
1∶ 10 8． 5 60 40
1∶ 15 9． 0 90 50
1∶ 20 9． 5 120 60
1． 4 降糖活性研究
1． 4． 1 建立糖尿病模型
预选健康♂小鼠 40 只(20 g 左右) ，先适应性
饲养一周，禁食 12 h，腹腔注射四氧嘧啶 180 mg /
kg，72 h后空腹血糖值 12 mmol /L 以上为高血糖小
鼠，造型成功。
1． 4． 2 神秘果蛋白对糖尿病小鼠的降血糖研究
取 10 只正常小鼠作为(1)空白对照组，和上述
造型成功的高血糖值小鼠 30 只，按血糖值、体重随
机分为(2)模型组(蒸馏水) ，(3)实验组(200 mg /kg
SDSP) ，(4)阳性对照组(80 mg /kg 二甲双胍) ，每组
10 只。小鼠分笼饲养，按剂量灌胃一次 /天，空白对
照组和模型组灌蒸馏水，实验组灌胃 SDSP 200 mg /
kg，阳性对照组灌胃二甲双胍 80 mg /kg，自由进食、
饮水，记录饮水量，测体重、血糖值 /周。实验第 14
天，禁食 12 h，腹腔注射 500 mg /kg 葡萄糖，90 min
后测量血液中胰岛素含量。
1． 5 数据处理方法
所得实验数据以平均数和标准方差表示(x ±
s) ，组间差异则采用 T-test，P ＜ 0． 05 为显著性差
异，P ＜ 0． 01 为高度显著性差异。．
2 实验结果
2． 1 神秘果提取条件优化
以牛血清蛋白(BSA)作为标准，以蛋白质浓度
为横坐标，A595为纵坐标作蛋白质浓度标准曲线，如
图 1，由此可测得各粗提取液中蛋白质含量。
图 1 蛋白质标准曲线
Fig. 1 Standard curve of protein
各组试验神秘果种子蛋白质提取率和极差分析
结果见表 2，方差分析见表 3。对表 2 数据进行直观
分析可知，以蛋白质提取率为评价指标，各因素的影
响顺序为:固液比 ＞温度 ＞ pH ＞时间，最佳工艺条
件为 A3B1C3D2。方差分析结果显示:固液比 F =
1. 549 和温度 F = 1． 56 ＜ F(2，8)0． 05 = 4． 46，说明固液
比和温度对蛋白质提取率都没有显著性影响，即表
明在实验操作条件下温度 40 ～ 60 ℃以及固液比 10
∶ 1 ～ 20∶ 1 条件下对蛋白质提取率的影响不显著。
综合以上情况考虑，选取 A3B1C3D2，即温度 50 ℃、
pH值 8． 5、固液比 1∶ 20、时间 120 min为最佳提取工
艺条件提取 SDSP，提取率可达到 80． 3%。
为考察上述最佳提取工艺的可操作性和稳定
性，严格按照工艺条件要求提取 SDSP 3 次，进行验
证试验。结果表明:按优选的最佳工艺条件提取
SDSP，提取率较高，且工艺稳定。
2441 天然产物研究与开发 Vol. 24
表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment of extraction rate
试验号
No
A
固液比
Solid /Liquid
B
pH值
pH value
C
时间
Time
D
温度
Temperature
提取率 /%
Extraciton
ratio
1 1 1 1 1 66． 9
2 1 2 2 2 72． 4
3 1 3 3 3 66． 7
4 2 1 2 3 70． 6
5 2 2 3 1 72． 1
6 2 3 1 2 75． 7
7 3 1 3 2 80． 3
8 3 2 1 3 78． 2
9 3 3 2 1 68． 5
K1 206． 0 217． 8 220． 8 207． 5
K2 218． 4 224． 8 211． 5 228． 4
K3 227． 0 210． 9 219． 1 215． 5
R 21 13． 9 9． 3 20． 9
表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
因素
Factor
离差平方和
Sum of deviation
square
均方
Mean square
F值
F value
固液比 74． 302 37． 151 1． 579
pH值 23． 429 11． 715 0． 498
时间 16． 349 8． 175 0． 347
温度 74． 136 37． 068 1． 576
注:自由度 f = 2，F(2，8)0． 05 = 4． 46。
2． 2 降血糖实验
模型组小鼠“三多一少”症状明显，并逐渐加
重;而实验组和阳性对照组小鼠症状较轻，且逐渐缓
解。表 4 中各项实验数据表明，喂食 SDSP 的糖尿
病实验组小鼠空腹血糖值较模型组降低，差异显著(P
＜0． 01)，阳性对照组小鼠血糖值也明显降低(P ＜ 0．
01)。实验结束时，实验组和阳性对照组小鼠的血糖值
趋近于正常值，实验组小鼠腹腔注射葡萄糖后胰岛素
含量高于模型组，差异显著(P ＜0． 01)。较模型组，正
常对照组小鼠体重增加，差异显著(P ＜0． 01)，实验组
和阳性对照组小鼠体重增加，差异不显著。
表 4 SDSP对糖尿病小鼠血糖值、胰岛素含量和体重的影响(x ± s，n = 10)
Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(x ± s，n = 10)
组别
Group
剂量(mg·kg －1)
Dosage
血糖值(mmol /L)
Blood glucose level
胰岛素含量(mU /L)
Insulin content
体重(g)
Weight
0 d 7 d 14 d 14 d 0 d 14 d
正常对照组 － 5． 8 ± 0． 4＊＊ 5． 6 ± 0． 3＊＊ 5． 6 ± 0． 2＊＊ 18． 3 ± 2． 6 21． 4 ± 0． 5 28． 4 ± 0． 8＊＊
模型组 － 16． 5 ± 2． 6 15． 6 ± 2． 9 15． 2 ± 3． 0 20． 6 ± 7． 8 20． 1 ± 1． 1 20． 8 ± 1． 8
实验组 200 16． 2 ± 2． 2 13． 5 ± 2． 6* 8． 1 ± 2． 4＊＊ 79． 5 ± 6． 1＊＊ 20． 7 ± 0． 9 23． 2 ± 3． 4*
阳性对照组 80 16． 8 ± 1． 8 14． 3 ± 2． 1* 7． 5 ± 2． 4＊＊ 25． 3 ± 6． 6 21． 7 ± 1． 5 22． 2 ± 2． 9*
与模型组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
Compared with model group:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
3 讨论
现有治疗糖尿病的药物一般是通过刺激残存 β
细胞的胰岛素分泌［12］，或是抑制胰高血糖素分泌，
来降低和控制患者的血糖值，而四氧嘧啶是一种特
异性的 β细胞毒剂，可选择性地损坏多种动物的胰
岛 β细胞，引起实验性糖尿病。研究糖尿病治疗药
物疗效的常用动物模型为四氧嘧啶糖尿病小鼠。
本实验通过设计正交实验，优选出提取 SDSP
的最佳工艺条件为温度为 50 ℃、pH 值为 8． 5、固液
比为 1∶ 20、时间为 120 min。在降血糖实验中，实验
组小鼠血糖值较模型组降低(P ＜ 0． 01) ，空腹注射
葡萄糖后胰岛素含量高于模型组(P ＜ 0． 01) ，说明
SDSP能有效地降低糖尿病小鼠空腹血糖值和促进
胰岛素的分泌，但其分离纯化、降糖机理等还需进一
步研究证明。
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(下转第 1347 页)
3441Vol. 24 黄巨波等:神秘果种子蛋白质的提取与降糖效用研究
tant component was not detected in sample 7 and 8．
Conclusion
A method has been established for estimation of five
components in fourteen different species of Rhodiola．
Chemical polymorphism was found in the fourteen spe-
cies belonging to the Rhodiola L． Genus in the Qinghai-
Tibetan Plateau．
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