全 文 ：达到高峰。东亚钳蝎的频次分布为负二项分布，在
野外为聚集分布，且密度越高，呈现出聚集度越大的
趋势。分析聚集度因素表明，东亚钳蝎的聚集原因
是由其自身和环境共同的作用结果。蝎子喜温热，
怕水，畏强光，喜暗，胆小易惊，对噪音敏感。此外，蝎
子还喜欢群居，好静不好动，并有识窝识群习性，多在
固定的窝穴结伴定居，蝎子对环境污染特别敏感，遇
到农药、化肥、生石灰和柴油等就会远避〔8〕。以上研
究结果对东亚钳蝎的保护工作有一定的指导作用，为
东亚钳蝎的资源保护提供了依据。
参 考 文 献
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·资源·
蕺菜植株间的蛋白质多样性研究
张喜利1，贺福元1，2，王海琴1，杨岩涛1，2，石继连1，2，刘文龙1，2，3* ，李顺祥4*
(1. 湖南中医药大学药学院 /中药现代化教育厅重点实验室，湖南 长沙 410208;2. 中药药性与药效国家中
医药管理局重点实验室，湖南 长沙 410208;3. 湖南师范大学生命科学学院，湖南 长沙 410081;4. 湖南省
中医药研究院中药新药研究与开发省重点实验室，湖南 长沙 410013)
摘要 目的:揭示同一 GAP产地同一批次的鲜蕺菜植株间的蛋白质多样性，为蕺菜“节点代谢网络”的构建奠
定基础。方法:采用 3 种方法从 3 个角度对蕺菜植株间的蛋白质进行多样性研究，即采用 Ｒamagli 改进的 Bradford
法、SDS-PAGE凝胶电泳法和双波长薄层扫描法分别研究其总蛋白含量多样性、蛋白种类差异性及各种类的含量变
异性。结果:53 株蕺菜蛋白条带分子量大多集中在 6. 5 ～ 97. 2 kDa范围内，蛋白种类差异性不明显，主要表现为条
带颜色深浅不一 ;蛋白电泳条带扫描图的总量统计矩零阶矩(AUCT)、一阶矩(MCＲTT)和二阶矩(VCＲTT)的 ＲSD
分别为 40. 92%、6. 01%和 18. 57%。结论:同一 GAP产地不同植株鲜蕺菜个体间蛋白质具有丰富的多样性，为后
续关键蛋白酶的寻找、“节点代谢网络”的构建奠定基础，也进一步拓展了中药质量的稳定性研究。
关键词 蕺菜;蛋白质;多样性;TLC;中药质量
中图分类号:Ｒ282. 6 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-1917-05
收稿日期:2012-12-17
基金项目:国家自然科学基金青年基金(30901971，81270055，81073142);湖南省教育厅“十二五”中药学重点学科(湘教通［2011］76 号)
作者简介:张喜利(1977-)，女，在读硕士研究生，专业方向:中药化学;Tel:0731-85552623，E-mail:xiaoli610@ 126. com。
* 通讯作者:刘文龙，Tel:0731-88458249，E-mail:dragon5240@ 126. com;李顺祥，E-mail:lishunxg@ yahoo. com. cn。
Study on Diversity of Protein Between Houttuynia cordata Plant
ZHANG Xi-li1，HE Fu-yuan1，2，WANG Hai-qin1，YANG Yan-tao1，2，SHI Ji-lian1，2，LIU Wen-long1，2，3，LI Shun-xiang4
(1. Key Lab of Modernization of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Chi-
na;2. Key Lab of TCMM，State Administration of TCM，Changsha 410208，China;3. College of Life and Science，Hunan Normal Uni-
versity，Changsha 410081，China;4. Key Lab of Chinese Materia Medica Ｒesearch and Development，Hunan Academy of Chinese Medi-
cine，Changsha 410013，China)
Abstract Objective:To reveal protein diversity between the same batch of fresh Houttuynia cordata in the same GAP base，and to
lay the foundation construction for“node metabolic network”. Methods:Three methods including the Ｒamagli improved Bradford law，
SDS-PAGE gel electrophoresis method and double wavelength thin-layer scanning method were used to study the total protein content di-
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.12.016
versity，protein species diversity and various kinds of content variability. Ｒesults:The molecular weight of 53 plant protein mostly con-
centrated in the range of 6. 5 ～ 97. 2 kDa，the species diversity was not obvious with main performance for banding color shades;The
ＲSD of zero moment (AUCT)，first moment (MCＲTT)and second moment (VCＲTT)in protein electrophoresis banding was 40. 92%，
6. 01% and 18. 57%，respectively. Conclusion:There is rich diversity in different Houttuynia cordata plant in the same GAP base，
which provides basis for the foundation of subsequent key protease search，“node metabolic network”construction，and study on the Chi-
nese medicine quality stability.
Key words Houttuynia cordata Thunb. ;Protein;Diversity;TLC;Quality of traditional Chinese medicine
中药质量及稳定性研究是中药现代化进程中不
可或缺的内容。国内外许多专家学者进行了大量研
究，主要集中在采用化学药质量控制标准的“5P”模
式、生物效应模式等对中药形成各个环节中可控因
素(外部因素)进行全面控制，取得了可喜的成效。
本课题组作了相关研究，认为中药质量受两方面的
因素控制，一是内因，即药用植物在生长过程中遵循
的自然规律———遗传与变异;二是外因，即种质资
源、种植生产流通等可控因素。应首先从中药动植
物的生长自然规律———“遗传与变异”角度探索中
药质控问题，然后结合西药质控的“5P”模式，最终
铸成适宜中药质控体系的控制模式。本文研究同一
种源同一 GAP产地同一批次的蕺菜 Houttuynia cor-
data Thunb．在生长过程中各植株间蛋白质变异情
况，从蕺菜植株间蛋白质的种类及相对量进行多样
性研究，为后续关键蛋白酶的寻找与“节点代谢网
络”的构建奠定基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 CS-9301 型双波长薄层色谱扫描仪
(日本岛津公司);DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪
器厂);WD-9405B 型水平摇床(北京市六一仪器
厂);GZS-1000B型凝胶图像处理系统(上海天能科
技有限公司);移液器、数码相机等。
1. 2 药材 一批鲜蕺菜采自湖南省怀化 GAP 种
植基地，经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯
教授鉴定为三白草科植物蕺菜 Houttuynia cordata
Thunb．，去枯、黄、斑叶及尘土，自来水洗净后阴干;
按株于分析天平称重分装于封口袋中，并分别标记样
品号及其重量;最后得53株蕺菜样品，置 －40 ℃冰箱
冻存备用。
1. 3 试剂
1. 3. 1 常规试剂:氨水，无水乙醇，甲醇，甲醛溶
液，冰醋酸，戊二醛 50%水溶液，氢氧化钠。甘氨
酸;Acry:丙烯酰胺、Bis:N，N-亚甲基双丙烯酰胺为
进口分装;Tris:三羟甲基氨基甲烷(合肥博美生物
科技有限责任公司);丙烯酰胺凝胶 SDS(Sigma 公
司);TEMED(Sigma 公司);过硫酸铵(天津市化学
试剂研究所);甘油、溴酚蓝(广州化学试剂厂);蛋
白 Marker(分子量范围为 6. 5 ～ 200 kDa，TaKaＲa Bi-
otechnology)。
1. 3. 2 需临时配制的试剂:(1)分离胶储备液
(30% Acry /Bis液):取 Acry 29. 2 g，Bis 0. 8 g，加适
量(约 60 mL)超纯水溶解，再定容至 100 mL，过滤
后，于 4 ℃ 保存，备用。(2)浓缩胶缓冲液(0. 5
mol /L Tris-HCl，pH 6. 8)取:Tris 6. 0 g溶解于 40 mL
超纯水中，用 1 mol /L HCl调节 pH至 6. 8，再加超纯
水定容至 100 mL，于 4 ℃保存，备用(注:严格控制
pH值)。(3)分离胶缓冲液(1. 5 mol /L Tris-HCl 溶
液，pH 8. 8):取 Tris 18. 16 g 溶解于 40 mL 超纯水
中，用 1 mol /L HCl调节 pH至 8. 8，再加超纯水定容
至 100 mL，于 4 ℃ 保存，备用(注:严格控制 pH
值)。(4)电极缓冲液(pH 8. 3):取 Tris 3. 03 g，甘
氨酸 14. 4 g，SDS 1. 0 g，加适量超纯水溶解，再定容
至 1 000 mL，室温保存。(5)6 ×样品缓冲液:取分
离胶缓冲液 1. 0 mL、50% 甘油 0. 8 mL，10% SDS
1. 6 mL、β-巯基乙醇 0. 4 mL、0. 05% 溴酚蓝 0. 2
mL、超纯水 4. 0 mL 混合均匀后，－ 20 ℃分装冻存，
备用。(6)50%甘油:取丙三醇 50 mL，加 50 mL 超
纯水，配成 100 mL溶液，室温保存，备用。(7)10%
SDS:取 SDS 10 g，溶于 80 mL超纯水中，加热搅拌至
完全溶解后，定容至 100 mL，室温保存，备用。(8)
10% APS:取过硫酸铵(APS)1. 0 g，加 10 mL 超纯
水溶解，－ 20 ℃分装冻存。(9)固定液:取冰醋酸
10 mL、甲醇 40 mL、超纯水 50 mL 混匀，现配现用。
(10)增敏液:取 50%戊二醛溶液 30 mL，超纯水 30
mL，混匀，现配现用。(11)染色液:20% AgNO3 0. 4
mL、氨水 0. 4 mL、4% NaOH 2 mL、20%乙醇 37. 2
mL，按顺序加，现配现用，配制过程避光。(12)显影
液:20%乙醇 40 mL、甲醛溶液 0. 04 mL、饱和柠檬酸
0. 01 mL混匀，现配现用。(13)终止液(5%醋酸):
取冰醋酸 5 mL，加超纯水 95 mL，混匀，现配现用。
2 方法与结果
2. 1 蕺菜植株间蛋白质总量的多样性研究 分别
精密称取各株所制得的蛋白质干粉〔1〕约 40. 0 mg于
·8191· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
1. 5 mL离心管中。用 6 ×样品缓冲液按 1∶ 20(w /v)
溶解，涡旋振荡 30 s，置水浴锅 37 ℃水浴 1. 5 h，4
℃下 13 000 r /min离心 25 min，取上清液置 0. 5 mL
的灭菌离心管中再次离心，取上清液，合并 2 次上清
液。依次分装于灭菌 EP 管并编号，于 － 40 ℃冰箱
储存，得待测蛋白样品液。取待测蛋白样品溶液
15. 0 μL，用去离子水稀释至 100 μL，加入 5. 0 mL
Bradford 工作液，涡旋混匀 3 ～ 5 min后，待测。采用
Ｒamagli改进的 Bradford 法〔2，3〕，以标准牛血清白蛋
白(BSA)作蛋白标准曲线，取待测的蛋白样品溶液
于考马斯亮兰 G-250 显色液中，测其 A595值，计算得
蛋白 样 品 液 中 总 蛋 白 的 浓 度 为 1. 766% ～
2. 334%〔1〕。
2. 2 SDS-PAGE电泳法对蕺菜植株间蛋白质种类
的多样性研究
2. 2. 1 SDS-PAGE电泳法制胶与配胶:① 将成套
的 2 块玻璃板用超纯水洗净，喷 75%酒精清洗，烘
干，安装于玻璃板架。② 按表 1 顺序依次添加制备
分离胶所需的各种溶液，将其用 1 000 μL 微量移液
器注入玻璃板之间，加胶距玻璃板顶端约 3 cm 停
止，立即用异丙醇封满，垂直静置 60 min，完全聚合
后倾去异丙醇，用超纯水洗净并用滤纸吸干。③ 按
表 1 顺序添加制备浓缩胶所需各种溶液，加满玻璃
板之间空隙后，均匀地用力插入梳子，聚合 50 min
后小心拔梳(注:避免产生气泡)。④ 将聚合完全后
的凝胶板与电泳槽连接安装，并于电泳仪连接好，在
电泳槽中加入电极缓冲液至没过加样孔(注:孔形
扭曲不规则的，可用 1. 0 mL 注射器小心矫正，并标
记分离胶的界线)。
表 1 分离胶和浓缩胶配制所需试剂一览表
试剂 分离胶
(T = 10 %，
10. 0 mL)/mL
浓缩胶(T = 5 %，
5. 0 mL)/mL
超纯水 4. 0 3. 4
30% Acry /Bis液 3. 3 0. 83
超纯水 4. 0 3. 4
30% Acry /Bis液 3. 3 0. 83
分离胶缓冲液 2. 5 －
浓缩胶缓冲液 － 0. 63
10% SDS 0. 1 0. 05
10% APS 0. 1 0. 05
TEMED 0. 004 0. 003
2. 2. 2 SDS-PAGE电泳法检测:将“2. 1”项下制备
好的待测蛋白样品液解冻，置沸水浴 5 min，使蛋白
质变性，按蛋白质样品溶液每孔点样约 5 μg，Marker
每孔点样 6. 0 μL。点样完毕后置电压 100 V 的电
泳仪预电泳，待指示带下移至分离胶时，再设置电压
为 150 V，电泳 60 min(注:指示带至下沿约 1. 5 cm
处停止电泳)。电泳结束后，取出玻璃板，切去凝胶
上层的浓缩胶，分离胶放入培养皿内，置摇床上用超
纯水漂洗 2 次，之后在摇床上的培养皿内进行改良
银染法:① 用固定液固定 10 min，再用超纯水漂洗 5
min，弃超纯水;② 迅速加入增敏液增敏 7 min，再用
超纯水漂洗 3 次，3 min /次，弃超纯水;③ 迅速加入
染色液染色 7 min，再用 20%乙醇溶液漂洗 3 次，每
次 3 min，弃乙醇液(染色过程应避光);④ 加入显影
液显色，最后立刻加终止液(5%醋酸)终止显色;⑤
采用数码相机拍照及凝胶成像系统成像。
2. 2. 3 53 株蕺菜蛋白样品 SDS-PAGE 电泳结果:
见图 1。
2. 3 TLC扫描法对蕺菜植株间蛋白质种类的多样
性研究
2. 3. 1 扫描条件:光谱:狭缝:0. 4 mm × 0. 4 mm;
灵敏度:中度;扫描范围:300 ～ 700 nm;定点原位光
谱扫描。色谱:狭缝:0. 4 mm × 0. 4 mm;灵敏度:中
度;扫描宽度(△X):6 mm;扫描截距(△Y):0. 1
mm;测定波长:510 nm;单波长反射锯齿扫描;检测
信号:峰面积;扫描距离:以点样位置为起点，以蕺菜
蛋白电泳区带展开距离定终点作通道扫描。
2. 3. 2 操作步骤:电泳分析结束后立即将蛋白凝胶
用滤纸吸干，放在玻璃板上轻轻压平后，于薄层扫描
仪内进行定量扫描，并借鉴本实验室所建的总量统计
矩原理〔4，5〕来进行蕺菜株间蛋白质的多态性分析。
2. 3. 3 样品测定〔4〕:将电泳分离、染色后的样品按
“2. 3. 2 ”项下方法进行定量检测，根据总量统计矩
原理进行数据处理，结果见表 2 和图 2。
3 讨论与结论
在前期研究中从遗传基因多态性角度揭示了同
一种源同一 GAP 种植基地同一批次的蕺菜植株间
的遗传基因 DNA也具有丰富的多态性〔4〕，这就揭示
了在“5P”质控模式下的中药(材)质量也屡屡出现
不稳定的现象的内在原因。再者，基因控制生物性
状的表达，而蛋白质又是生物性状的体现者，基因通
过一系列传递(中心法则)将自己的遗传信息通过
蛋白质表达出来。那么，基因的多态性必将引起蛋
白质的多样性，而蛋白质是生物代谢酶的重要组成
部分，这种蛋白质(酶)的多样性在参与植物中药的
代谢过程时使得“中药成分”的变异性最终体现为
中药质量的不稳定性。因此，研究中药的蛋白质
(酶)的多样性是基因多态性研究的升华，其在中药
质控研究中显得更重要、更直观、更确切。
·9191·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
图 1 53 株蕺菜蛋白质电泳图谱
表 2 53 株蕺菜蛋白质指纹图谱总量统计矩参数
编号 N AUCT/(μV·mm)
MCＲTT
/mm
VCＲTT
/mm2 编号 N
AUCT
/(μV·mm)
MCＲTT
/mm
VCＲTT
/mm2
1 16 86950. 91 70. 64 106. 2 29 27 64452. 12 67. 94 129. 9
2 16 50163. 03 66. 40 89. 38 30 20 60410. 31 71. 24 146. 5
3 20 62081. 15 65. 58 101. 9 31 21 35660. 09 62. 49 130. 4
4 25 52100. 38 66. 16 154. 3 32 18 35997. 65 69. 58 126. 0
5 17 51293. 45 68. 04 125. 9 33 18 29028. 97 67. 06 182. 3
6 19 56256. 77 67. 13 123. 7 34 15 24800. 27 61. 65 138. 4
7 16 77422. 51 72. 51 128. 5 35 23 39219. 46 71. 49 176. 7
8 19 60057. 35 65. 14 127. 9 36 17 30575. 62 68. 78 185. 1
9 19 53562. 44 66. 14 103. 6 37 18 72866. 62 63. 52 128. 9
10 18 40454. 29 64. 724 177. 5 38 16 66940. 37 74. 64 110. 6
11 18 44844. 34 63. 54 128. 3 39 21 58743. 04 69. 42 109. 6
12 18 42914. 11 66. 81 109. 6 40 25 122921. 5 72. 48 115. 3
13 18 46974. 14 72. 85 112. 9 41 25 65892. 68 75. 62 164. 8
14 17 54158. 73 68. 23 105. 6 42 17 60266. 90 71. 26 113. 8
15 16 32224. 72 71. 42 107. 8 43 18 109733. 3 77. 10 112. 4
16 22 53432. 41 68. 63 111. 9 44 15 90743. 86 75. 92 120. 6
17 16 37876. 62 62. 48 96. 54 45 19 66095. 14 68. 93 136. 7
18 22 40758. 43 68. 71 101. 1 46 15 79702. 52 73. 17 121. 6
19 18 51576. 57 74. 39 112. 1 47 17 57079. 08 73. 81 126. 6
20 19 56117. 42 67. 79 109. 4 48 18 37840. 89 66. 88 116. 8
21 25 40173. 75 65. 06 104. 4 49 17 71880. 33 72. 85 119. 3
22 19 93854. 82 75. 50 99. 08 50 18 124394. 3 76. 48 103. 9
23 18 41226. 01 65. 46 111. 3 51 19 143599. 8 74. 26 96. 80
24 15 73383. 01 67. 74 103. 6 52 16 84080. 97 73. 59 106. 1
25 22 38374. 65 61. 37 114. 8 53 20 78757. 23 72. 64 100. 5
26 19 74548. 01 67. 41 111. 4 平均值 18. 8 60743. 2 69. 10 120. 9
27 18 53107. 66 64. 29 92. 30 标准差 2. 88 25090. 9 4. 190 22. 66
28 16 41818. 84 65. 15 115. 9 ＲSD /% 15. 35 41. 31 6. 064 18. 74
注:N为峰数(peak number);AUCT 为零阶矩;MCＲTT 为蛋白指纹图谱的平均截距(Ｒf)，亦为一阶矩;VCＲTT 为蛋白质指纹图谱的方差，亦
为二阶矩
·0291· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
图 2 3 号蕺菜样品色谱扫描图
3. 1 蕺菜植株间蛋白质总量的多样性研究 蕺菜
各植株蛋白浓度在 1. 766% ～ 2. 334%范围间变化，
证实了同一种源同一 GAP 种植基地产出的同一批
次的蕺菜植株间蛋白质总含量存在较大的差异。也
就是说总蛋白的株间总蛋白含量具有多样性特征，
而具体是蛋白酶种类上的差异，还是数量上的差异，
还需进一步探讨。
3. 2 SDS-PAGE 电泳蛋白质的种类多态性研究
SDS-PAGE电泳是根据蛋白质分子量大小来分离蛋
白质的。因此，蛋白条带分辨率高、条带形状规则及
条带数丰富则表示电泳效果理想。从图 1 结果可
知，SDS-PAGE 电泳的单株蕺菜总蛋白谱带丰富，凝
胶背景清晰，且条带分子量大部分集中在 6. 5 ～
97. 2 kDa范围内。对比观察后不难发现 53 株蕺菜
总蛋白各条带的分辨率较差，多数相邻条带出现重
叠，说明蛋白种类丰富;各样品总蛋白电泳图在相应
位置似乎都出现了条带，这预示了各植株间的蛋白
种类的差异性较小，但颜色深浅不一，这说明了株间
蛋白多样性主要体现在各种类蛋白的含量差异性方
面，可以通过对电泳图进行薄层扫描来进一步研究。
3. 3 TLC扫描法对蕺菜植株间蛋白质种类的多样
性研究 薄层色谱扫描法则是以蛋白条带颜色深浅
与蛋白区带含量成正比来定量分析研究，从蛋白质
指纹图谱角度并借鉴本实验室所创建的总量统计矩
原理，通过峰面积相对百分含量分析其蛋白多样性，
弥补 SDS-PAGE电泳分析的不足之处。从表 2 结果
可以看出:53 株蕺菜的蛋白质指纹图谱中的峰数及
总量统计矩参数零阶矩、一阶矩和二阶矩均有较大
的差异，其 ＲSD 分别为 15. 35%、41. 31%、6. 064%
和 18. 74%。说明蕺菜蛋白质株间在种类上存在一
定的多样性，但在各蛋白种类的含量上差异较大，引
起各植株质量不稳定。而这种蛋白质的差异性与其
成分间的关联性，有待进一步研究探讨。
参 考 文 献
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·1291·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月