全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 21(2):149 ～ 153 , 2009
雪里蕻高效再生体系的建立
高乃波 ,刘晓光 ,施曼玲
(杭州师范大学 生命与环境科学学院 ,浙江 杭州 310036)
摘　要:以雪里蕻(Brassica juncea Coss.var.multiceps Tsen et Lee)子叶 、带柄子叶 、子叶柄和下胚轴为外植体 ,
在添加不同植物生长调节剂的MS 培养基上进行分化培养。结果表明:在 4 种外植体中 ,带柄子叶不定芽分
化能力最强。子叶和带柄子叶不定芽分化的最适培养基分别为 MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/ L NAA+5 mg/ L
AgNO3 和MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/ L NAA+5 mg/ L AgNO3。带柄子叶和子叶不定芽分化的最佳苗龄都为 5
d。AgNO3能显著地促进带柄子叶不定芽的分化 , 以 5 mg/L的浓度为最佳。不同基因型对带柄子叶不定芽分
化影响不大 ,但对子叶影响较明显。不定根诱导的最佳培养基为MS+0.2 mg/L NAA 。
关键词:雪里蕻;带柄子叶;子叶;植株再生
中图分类号:S637.2　　　　　　文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2009)02-0149-05
Establishment of efficient regeneration system of Brassica juncea var.multiceps
GAO Nai-bo , LIU Xiao-guang , SHI Man-ling
(College of Life and Environment Science , Hangzhou Normal University , Hangzhou 310036 , China)
Abstract:A regeneration system was established with sessile cotyledon , cotyledon , petiole and hypocotyl of Brassica juncea
var.multiceps as explants in the different mediums.The experimental results showed cotyledon had the highest shoot regen-
eration ratio among the 4 explants.The optimum differentiation mediums for sessile cotyledon and cotyledon were MS+2
mg/ L 6-BA+0.4 mg/ L NAA+5 mg/ LAgNO3 and MS+2 mg/ L 6-BA+0.2 mg/L NAA+5 mg/ L AgNO3 , respectively.
The best seedling ages of sessile cotyledon and cotyledon were 5 d.AgNO3 could significantly increase the percentage of
shoot regeneration , and 5 mg/ L AgNO3 was the optimal concentration.Different genotypes had inconspicuous effects on
cotyledon regeneration , but they had obvious effects on sessile coty ledon differentiation.The best medium for root regenera-
tion was MS+0.2 mg/L NAA.
Key words:Brassica juncea var.multiceps;sessile cotyledon;cotyledon;plant regeneration
　　雪里蕻(Brassica juncea Coss.var.multiceps
Tsen et Lee)属于十字花科芸苔属芥菜种 ,是分蘖
芥的一个变种 。雪里蕻在我国长江流域普遍栽
培 ,在浙江省种植面积已超过 2.3 万 hm2。雪里
蕻精加工后制成咸菜或霉干菜 ,产品畅销国内十
多个省市 ,是浙江农业开发的一个重要项目 。但
收稿日期:2008-03-11
基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y305090)
作者简介:高乃波(1983-),女 ,浙江慈溪人 ,硕士研究生 ,从事植
物病毒与分子生物学研究。 E-mail:gaonaibo@163.com
＊通讯作者 , 施曼玲 , E-mail:smiling1969@163.com;Tel:86-571-
28869790
近年来由于生产上的栽培品种抗病性差且复种
指数提高 ,使得雪里蕻病害逐年加重 ,严重阻碍
雪里蕻产业的持续发展[ 1] 。目前芥菜的离体培
养已有一些报道 ,但再生频率都偏低 ,而且主要
是有关茎瘤芥的再生培养研究[ 2 ,3] 。本试验以雪
里蕻宁波 18号品种为材料 ,通过不同外植体和
不同浓度的植物生长调节剂组合的筛选 ,建立一
个高效的植株再生体系 ,旨在为雪里蕻遗传转化
提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料
雪里蕻品种(宁波 18号 ,宁波 12 号)由宁波
鄞州区雪里蕻研究中心提供。
MS:基本培养基;MS1:不定芽分化培养基
(MS +6-BA +NAA +AgNO3);MS2:生根培养基
(MS+NAA)。
1.2　无菌苗的获得
种子用75%的酒精表面消毒 50 s后 ,用无菌
水洗涤 3 次;再用 0.1%的升汞溶液浸泡 6 ～ 7
min ,随后用无菌水洗涤 4 ～ 5次;将消毒好的种子
播种于 MS上 ,在温度为 25℃,光周期为 16 h光
照/8 h黑暗 ,光照强度 4 000 lx ,湿度 65%的条件
下培养。
1.3　不定芽的诱导
1.3.1　外植体类型 、植物生长调节剂配比对不
定芽分化的影响
取5 d苗龄的宁波 18 号雪里蕻无菌苗的带
柄子叶 、子叶 、子叶柄和下胚轴 4种外植体 ,分别
接种到不同植物生长调节剂配比的 MS1 培养基
上 ,6-BA分别为 1 , 2和 3 mg/L ,NAA为 0.2 , 0.4
和0.6 mg/L ,AgNO3为 5 mg/L。带柄子叶插入培
养基中 ,子叶 、子叶柄和下胚轴平放 ,并轻轻压入
培养基 。培养 15 d 后观察并记录 4种外植体不
定芽分化的情况。本试验所有处理均 3次重复 ,
每次重复外植体不少于 30个 。
1.3.2　苗龄对不定芽分化的影响
以苗龄 4 , 5 , 6 ,7 d 宁波 18号雪里蕻无菌苗
的带柄子叶接种不定芽分化培养基 MS+2 mg/L
6-BA+0.2 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3 ,子叶接种
于 MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+5 mg/L
AgNO3培养基 。培养条件同上 ,培养 15 d后观察
并记录结果。
1.3.3　AgNO3对不定芽分化的影响
取5 d苗龄宁波 18 号雪里蕻无菌苗的带柄
子叶 ,接种于培养基 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/
L NAA ,再分别加入 0 ,2.5 ,5和 10 mg/L AgNO3培
养15 d后观察并记录结果。
1.3.4　基因型对不定芽分化的影响
分别取宁波 18号和宁波 12号雪里蕻品种 ,
比较在6-BA 为 2 mg/L ,NAA为 0.2 , 0.4 和 0.6
mg/L的植物生长调节剂组合条件下 ,外植体带
柄子叶和子叶不定芽诱导的差异 。培养 15 d后
观察并记录结果 。
1.4　不定根的诱导
取长约 2 ～ 3 cm 的不定芽 ,接种到不同植物
生长调节剂配比的MS2 培养基上进行根的诱导 ,
其中NAA浓度分别为 0 ,0.1和 0.2 mg/L。
1.5　组培苗的移载
将生根后的组培苗去掉封口膜 ,炼苗 2 ～ 3 d
后 ,再移植于营养钵中 ,保湿 5 ～ 6 d左右。
2　结果与分析
2.1　不定芽的诱导
2.1.1　外植体类型对不定芽分化的影响
4种外植体不定芽分化时间早晚有差异 ,大
约培养 1周左右 ,带柄子叶和子叶都开始分化出
不定芽;第 15 d 时 ,带柄子叶和子叶都已产生大
量的不定芽 ,而子叶柄与下胚轴才开始形成愈伤
组织 ,没有不定芽的分化 ,直到 25 d左右才有不
定芽的出现 。结果表明(表 1),不同外植体不定
芽分化频率差异很大 ,第 15 d时带柄子叶不定芽
分化率最高 ,高达 96.67%;其次是子叶 ,其不定
芽最高分化率为 93.33%;下胚轴与柄不定芽分
化率都为零 。运用统计软件 Statistica 5.0对表 1
中的带柄子叶和子叶不定芽分化率进行统计分
析 ,双因子分析结果显示 , F4 , 18 = 65.67 P <
0.0001 不同植物生长调节剂配比对雪里蕻带柄
子叶芽分化率的影响差异极显著;F4 ,18 =4.16 P
=0.014 <0.05不同植物生长调节剂配比对子叶
芽分化率的影响差异显著 。
4种外植体培养 60 d左右观察 ,发现带柄子
叶和子叶不定芽分化快 ,基本上不形成愈伤或愈
伤不明显;子叶柄和下胚轴分化慢 ,形成愈伤后
才形成不定芽。4种外植体中带柄子叶不定芽分
化能力最强 ,其次是子叶 ,然后是子叶柄 ,下胚轴
芽分化率最低。
2.1.2　植物生长调节剂配比对不定芽分化的影
响
不同植物生长调节剂配比对外植体不定芽
分化频率的影响显著(表 1)。当 NAA 取 3个固
定的浓度 0.2 ,0.4 ,0.6 mg/L , 6-BA为 1 mg/L 时 ,
带柄子叶的不定芽分化率随NAA 浓度升高而下
降 ,而子叶的不定芽分化率随之上升;当 6-BA为
·150· 浙江农业学报　第 21卷　第 2期(2009年 3月)
2 mg/L 时 ,带柄子叶的不定芽分化率是先下降再
上升 ,而子叶的不定芽分化率是先上升再下降;
当6-BA为 3 mg/L时 ,带柄子叶和子叶的不定芽
分化频率变化的规律都相同 ,都是随NAA浓度升
高而上升。当 NAA浓度固定时 ,随 6-BA浓度升
高 ,带柄子叶的不定芽分化频率有增加的趋势 ,
同时玻璃芽也在增加。6-BA 3 mg/L , NAA 0.6
mg/L时 ,带柄子叶的不定芽分化频率最高 ,但芽
的玻璃化也严重。由此 ,我们认为 6-BA 2 mg/L ,
NAA 0.2 mg/L 为带柄子叶的最佳分化浓度。当
NAA浓度固定时 ,随 6-BA浓度从 1 mg/L 上升至
3 mg/L ,子叶的不定芽分化率明显呈现出先上升
再下降的趋势 ,试验结果显示子叶不定芽的最佳
分化浓度是6-BA 2 mg/L ,NAA 0.4 mg/L。
表1　不同植物生长调节剂配比对雪里蕻不同外植体不
定芽分化的影响
Table 1　Effects of the combinations of different plant hormones
on shoot regeneration from different explants of Brassica juncea
var.multiceps
6-BA
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
不定芽分化频率/ %
带柄子叶 子叶 子叶柄 下胚轴
1.0 0.2 63.33 16.67 0.00 0.00
1.0 0.4 60.00 20.00 0.00 0.00
1.0 0.6 26.67 30.00 0.00 0.00
2.0 0.2 88.89 61.11 0.00 0.00
2.0 0.4 72.22 93.33 0.00 0.00
2.0 0.6 85.56 83.33 0.00 0.00
3.0 0.2 72.43 20.33 0.00 0.00
3.0 0.4 82.33 33.33 0.00 0.00
3.0 0.6 96.67 40.00 0.00 0.00
2.1.3　苗龄对不定芽分化的影响
试验表明苗龄也是影响不定芽分化的重要
因素之一。在MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA
+5 mg/L AgNO3培养基上 ,带柄子叶分化不定芽
的最适苗龄为 5 d ,分化频率达到 88.89%。在
MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+5 mg/L Ag-
NO3培养基上 ,子叶分化不定芽的最适苗龄也是
5 d ,其分化能力最强 ,高达 93.33%(表 2)。对表
2中不同苗龄下的带柄子叶和子叶不定芽分化频
率 ,利用用统计软件 Statistica 5.0进行分析 ,单因
子分析结果显示 , F 3 ,8 =270.77 P <0.0001不同
苗龄的带柄子叶芽分化率的差异极显著;F3 ,8 =
111.07 P <0.0001不同苗龄子叶芽分化率的差
异极显著。随着苗龄的增加 ,无论子叶还是带柄
子叶不定芽分化频率都明显降低。所以外植体
子叶和带柄子叶分化不定芽的最佳苗龄都为 5
d。
表 2　苗龄对雪里蕻不定芽分化的影响
Table 2 　Effects of seedling age on shoot regeneration of
Brassica juncea var.multiceps
苗龄/d 不定芽分化频率/ %
带柄子叶 子叶
4 66.67 86.67
5 88.89 93.33
6 30.00 56.67
7 10.00 10.00
2.1.4　AgNO3 对不定芽分化的影响
AgNO3对促进雪里蕻带柄子叶不定芽的分化
有明显效果(表 3),在加入 5 mg/L AgNO3 的培养
基中带柄子叶不定芽分化频率最高 ,为 80.00%,
而未加AgNO3 的分化频率为 63.33%,而且不定
芽玻璃化严重 ,甚至畸形 。但随着 AgNO3 浓度的
提高 ,对不定芽的分化反而起了抑制作用 ,在加
入 10 mg/L AgNO3的培养基中带柄子叶不定芽分
化频率为零 ,没有诱导出芽 ,而且带柄子叶枯黄 、
白化。利用统计软件 Statistica 5.0对表 3中不同
AgNO3浓度下的带柄子叶不定芽分化率作进一步
的统计分析 , 单因子分析结果显示 , F 3 ,8 =
141.63 P <0.0001 AgNO3 浓度对带柄子叶芽分
化率的影响差异极显著。
表 3　AgNO3对雪里蕻不定芽分化的影响
Table 3 　Effects of AgNO3 on shoot regeneration of Brassica
juncea var.multiceps
AgNO3/mg·L-1 不定芽分化频率/ %
0 63.33
2.5 70.00
5.0 80.00
10.0 0.00
2.1.5　基因型对不定芽分化的影响
在 6-BA为 2 mg/L ,NAA 为 0.2 , 0.4 和 0.6
mg/L 的植物生长调节剂配比组合条件下 ,以宁
波 18号和宁波 12号两雪里蕻品种为材料 ,比较
·151·高乃波等:雪里蕻高效再生体系的建立
不同基因型雪里蕻的外植体子叶和带柄子叶不
定芽分化的差异 。两种外植体不定芽分化的时
间在不同基因型间差别不明显 ,均在接种后 8 ～
10 d出现绿色芽点。两基因型雪里蕻的带柄子
叶不定芽分化的最高频率差异也不大(表 4),宁
波18 号和宁波 12 号不定芽最高分化频率都
90%左右。但获得最高分化频率的最适合植物
生长调节剂配比存在差异 ,宁波 18 号为 6-BA 2
mg/L 和 NAA 0.2 mg/L ,而宁波 12 号为 6-BA 2
mg/L和 NAA 0.6 mg/L。子叶不定芽分化过程
中 ,两基因型间差异明显 ,宁波 18号不定芽分化
效率高 ,分化频率最高达到 93.33 %;而宁波 12
号子叶分化效率低 ,绿色的愈伤点较多 ,诱导出
的不定芽较少 ,最高分化频率只有 20.00%;但是
宁波 12号雪里蕻分化出的不定芽几乎没有玻璃
化 ,而宁波 18号的雪里蕻分化出的不定芽容易
出现玻璃化。
对表 4中不同植物生长调节剂配比 、不同基
因型雪里蕻的带柄子叶和子叶不定芽分化率作
进一步的统计分析 ,运用统计软件 Statistica 5.0
双因子分析结果表明 , F2 , 12 = 159.23 P <
0.0001带柄子叶芽分化率的差异极显著;F2 , 12 =
3.13 p <0.0001 =0.08 >0.05子叶芽分化率的
差异显著 。
表 4　基因型对雪里蕻不定芽分化的影响
Table 4　Effects of genotype on shoot regeneration of Brassica
juncea var.multiceps
6-BA
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
宁波 18号不定芽
分化频率/ %
带柄子叶 子叶
宁波 12号不定芽
分化频率/ %
带柄子叶 子叶
2.0 0.2 88.89 61.11 16.67 0.00
2.0 0.4 72.22 93.33 50.00 20.00
2.0 0.6 85.56 83.33 90.00 13.33
2.2　不定根的诱导
不定芽在MS+0 mg/L NAA的培养基上 11 d
后才开始生成不定根 ,不定根产生很慢 ,而且数
量少;在MS+0.1 mg/L的培养基上 8 d后开始生
成不定根 ,根毛较多;而在 MS+0.2 mg/L NAA的
培养基上不定根的生成最快 ,5 d就开始长根 ,且
根毛最多 。所以选择在MS+0.2 mg/L NAA的培
养基下诱导生根 。
3　讨论
本试验研究了外植体类型 、植物生长调节
剂 、苗龄 、AgNO3和基因型对雪里蕻不定芽分化的
影响。在MS+BA+NAA+AgNO3培养基上 ,培养
15 d时带柄子叶不定芽分化能力最强 ,其次是子
叶 ,两外植体不定芽最高分化频率分别达到
96.67%和 93.33%,而下胚轴与子叶柄才开始形
成愈伤组织 ,不定芽分化频率都为零。这与已报
道十字花科芸苔属另两个种油菜[ 4]和甘蓝[ 5]等
下胚轴的再生频率明显高于子叶的情况相反 ,这
可能是由于不同植物外植体的分化能力有差异 ,
或者是由于不同的外植体分化所需的条件不同
造成[ 2 ,6] 。下胚轴与子叶柄不定芽分化速度慢 ,
直到25 d左右才有芽的出现 ,而且分化频率低。
子叶柄在形成愈伤后是靠近子叶端诱导出芽 ,这
种分化的极性现象与余小林等[ 3] 报道的榨菜子
叶柄分化相似 ,可能是由于靠近子叶端积累的营
养物质和植物生长调节剂多于另一端 ,细胞的分
化能力相对较强。已有的研究表明外植体类型
是影响植物分化再生的重要因素之一 ,同一种植
物不同外植体 ,其分化再生能力不同 ,对再生频
率的影响很大 ,甚至有时其影响程度超过植物生
长调节剂组合[ 6] ,本试验结果也证实雪里蕻外植
体类型对不定芽分化频率的影响甚于植物生长
调节剂配比 。
培养基中的植物生长调节剂组成对不定芽
分化也有重要影响 ,十字花科芸苔属植物的再生
研究常选用 6-BA ,KT , IAA和 NAA等植物生长调
节剂组合进行[ 7～ 11] 。本试验选择 6-BA 和 NAA
组合进行雪里蕻不定芽和不定根的诱导 。试验
结果表明当 NAA浓度固定时 ,随 6-BA 植物生长
调节剂浓度升高 ,带柄子叶的不定芽分化率有增
加的趋势 ,而子叶的不定芽分化率是先上升然后
再下降 ,但是 6-BA 植物生长调节剂浓度的上升
会加重不定芽的玻璃化;过高NAA浓度则会诱导
出根 ,抑制了不定芽的分化;本试验带柄子叶和
子叶不定芽的最佳分化浓度分别为 6-BA 2 ,NAA
0.2和 6-BA 2 ,NAA 0.4 mg/L ,不定根诱导的最佳
浓度为 0.2 mg/L NAA。苗龄也是影响芽分化的
重要因素之一 ,一般认为苗龄越小 ,外植体的再
·152· 浙江农业学报　第 21卷　第 2期(2009年 3月)
生能力越强 ,从而不定芽的分化频率越高 。试验
中观察到 5 d苗龄雪里蕻带柄子叶和子叶的不定
芽分化频率最高 ,其次是 4 d苗龄 ,然后依次是 6
d和 7 d苗龄 。陈石头等[ 2]也曾报道 5 ～ 6 d苗龄
的榨菜带柄子叶其分化能力比 4 d苗龄的强 ,其
原因有待研究。
AgNO3对雪里蕻带柄子叶不定芽分化频率
起到促进作用 ,这与有些文献报道的结果相一
致[ 8 ,12-14] ,AgNO3 对芽的促进作用可能与它抑制
了外植体内源乙烯的生物合成有关。试验中还
发现AgNO3 对雪里蕻子叶不定芽分化也有促进
作用 ,但对子叶柄 、下胚轴的不定芽分化效果不
大或无效果。试验显示 AgNO3 能有效减轻雪里
蕻不定芽的玻璃化 ,减少畸形芽。张鹏等[ 13]认为
AgNO3处理时间的长短取决于原基形成的时间 ,
培养物一旦形成原基即可去掉 AgNO3 。本试验
AgNO3处理外植体时间为 10 d ,AgNO3 最适浓度
为5 mg/L。此外在培养过程中使用带有透气膜
的玻璃纸封口 ,适当增加培养箱的湿度 ,每 5 d更
换培养基 ,同时降低大量元素中NH4NO3 的用量 ,
这些措施和方法可以有效防止不定芽的玻璃化 ,
甚至可以使原来的玻璃苗恢复 。
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(责任编辑　袁醉敏)
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