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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):143-147
抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物体内具
有免疫屏障作用的一类多肽，是天然免疫系统中不
可缺少的重要组成部分［1］。自 20 世纪 70 年代末
Boman 等［2］首次在惜古天蚕（Hyalopbora cecropia）
中发现抗菌肽天蚕素（Cecropin）以来，迄今已有
1 000 多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定，且来源
于昆虫的抗菌肽就有 200 多种。由于抗菌肽一般都
具有抗细菌的活性，有的还具有抗病毒、抗原虫及
抑制和杀伤肿瘤细胞等活性，并且具有热稳定性好、
对正常细胞没有损害、不易产生耐药性等特点，已
成为人们关注的热点。
家蝇能够在恶劣的环境中生存，在其长期抵御
微生物的侵袭中形成了独特的免疫系统，人们对于
家蝇抗菌肽的研究越来越多，其中研究较详细的有
attacin、defensin、cecropin，而对双翅肽 diptericin 的
研究较少。从昆虫体内提取天然抗菌肽的得率少，
生产成本高，因此，构建基因工程菌来实现抗菌肽
的高效表达成为人们研究的热点。本研究从家蝇幼
收稿日期：2015-09-02
基金项目：河南省科技攻关项目（142102110069），国家现代农业产业技术体系项目（CARS-42）
作者简介：卢敏，女，博士研究生，研究方向：动物营养与饲料科学；E-mail ：453808792@qq.com
通讯作者：李绍钰，男，研究员，研究方向：动物营养调控与饲料高效利用；E-mail ：lsy9617@aliyun.com
家蝇抗菌肽 diptericin 基因在大肠杆菌中的表达
卢敏1，2  白杰1  魏凤仙1  王琳燚1  徐彬1  尹清强2  李绍钰1
（1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州  450002 ；2. 河南农业大学牧医工程学院，郑州  450002）
摘 要 ： 为了实现原核表达的途径高效获取抗菌肽蛋白，以 RT-PCR 的方法反转录合成家蝇的抗菌肽 diptericin 基因，并克
隆至 pGEX-4T-1 载体上，转化至大肠杆菌 BL21 宿主菌进行表达。测序结果显示，RT-PCR 克隆到长 345 bp 的家蝇 diptericin 基因，
重组菌经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，通过 SDS-PAGE 电泳和 Western-blot 检测到目的蛋白的融合表达，结果表明
带有 GST 标签的融合蛋白大小约为 37 kD，并且通过 GST 纯化柱纯化得到了目的蛋白。
关键词 ： 家蝇 ；抗菌肽 ；diptericin ；原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.020
Expression of diptericin Gene from Musca domestica in
Escherichia coli
LU Min1，2  BAI Jie1  WEI Feng-xian1  WANG Lin-yi1  XU Bin1  YIN Qing-qiang2  LI Shao-yu1
（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002 ；2. College of Animal
Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）
Abstract:  In order to efficiently acquire the antibacterial peptide by prokaryotic expression，diptericin gene for the antibacterial peptide 
in housefly was reversely synthesized by RT-PCR method. Then，diptericin gene was cloned to pGEX-4T-1 expression vector and transformed 
into Escherichia coli BL21 for protein expression. Sequencing result showed that housefly’s diptericin gene was 345 nucleotides  in  length. 
Recombinant pGEX-4T-1 was induced by IPTG，and the expression of diptericin  fusion protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis 
and Western blot. The result showed that diptericin fusion protein with GST-tag was about 37 kD，and the target protein was purified by GST 
purification column.
Key words:  housefly ；antibacterial peptide ；diptericin ；prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6144
虫体内克隆得到 diptericin 基因，与 pGEX-4T-1 载体
连接后，在大肠杆菌 BL21 中进行表达，旨为后续
筛选可以高效表达 diptericin 蛋白的基因工程菌提供
参考。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  实验菌株  家蝇 Musca domestica 种蝇由河南
省疾病预防控制中心惠赠，幼虫由本实验室饲养，
饲养温度 25℃，相对湿度 50%-70%；大肠杆菌
DH5α、BL21 购自天根生物生化科技有限公司，克
隆质粒 pMD19-T 购自宝生物工程有限公司；大肠杆
菌 ATCC-25922 和表达质粒 pGEX-4T-1 由本实验室
保存。
1.1.2  试剂  GSTrap HP，1 mL 购自 GE Healthcare 
Life Sciences，RNAiso Plus、M-MLV 反转录酶、Taq
DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase、蛋白质分子量标准、
限制性内切酶 EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ和 DNA Marker 为
TaKaRa 公司产品，质粒提取和 DNA 纯化回收试剂
盒购自天根生物科技有限公司，其它试剂为国产和
进口分析纯。PCR引物合成及 DNA序列测定由上海
生物工程技术服务有限公司完成。
1.2  方法
1.2.1  家蝇幼虫总 RNA 的提取  微生物刺激家蝇：
培 养 大 肠 杆 菌 ATCC-25922 至 OD600=0.6-0.8， 离
心收集菌体，用生理盐水洗涤两次后重悬，最终
OD600=1.8-2.0。选取大小均一、活动能力强的家蝇
3 日龄幼虫，用带有大肠杆菌的针刺破家蝇幼虫后 
1/3，饲养 6 h 后收集幼虫于液氮保存。总 RNA 提
取：将幼虫于液氮研磨后，加入 RNAiso Plus，提取
总 RNA（具体步骤按照 RNAiso Plus 试剂盒说明书），
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性，并测定
RNA浓度及纯度。
1.2.2  RT-PCR 克隆家蝇抗菌肽 diptericin 基因  从
GenBank 中 查 到 家 蝇 diptericin 基 因 mRNA 序 列
（GenBank ID ：FJ795370.1），在其编码区设计引物，
上游引物引入 EcoR Ⅰ酶切位点，下游引物引入
Xho Ⅰ酶切位点（下划线），并加入 27 个碱基的HA
标签序列（斜体）。
P1 ：5-TTAGAATTCAACAAAATGAAATATCTC
TGGGCCATTGTTC-3；P2：5-TATCTCGAGTCAAGCG
TAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCATCTGTAGGTAT
AAC-3。
以提取的总 RNA为模板，用随机引物进行反转
录合成 cDNA 第一链，反转录过程严格参照 M-MLV
反转录酶 1st-strand cDNA 合成的操作方法。以
cDNA 为模板，P1、P2 为引物，扩增家蝇 diptericin
基因。PCR 产物经纯化回收后，在 T4 DNA 连接酶
作用下与 pMD19-T 载体连接，转化大肠杆菌 DH5α，
利用蓝白斑筛选方法筛选阳性克隆，具体方法参照
《分子克隆实验指南》［3］第 15 章。挑选阳性克隆进
行菌落 PCR 鉴定、EcoR Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定，
鉴定后的阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司
测序。
1.2.3  pGEX-4T-1-diptericin 重 组 表 达 质 粒 的 构
建  将重组克隆 pMD19-T-diptericin 质粒和表达载
体质粒 pGEX-4T-1 同时进行 EcoR Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶
切，并纯化回收 diptericin 基因和 pGEX-4T-1 质粒，
回收产物经 T4 DNA 连接酶连接后，转化大肠杆菌
BL21，利用转化子的 Amp 抗性在 LB 平板上进行筛
选，阳性克隆进行质粒 PCR 鉴定及双酶切鉴定，并
进行测序，确定有正确的阅读框，无碱基突变后进
行下步实验。
1.2.4  diptericin 基因的融合表达  从平板上挑取
pGEX-4T-1-diptericin-BL21 的单克隆菌落，接种于 3 
mL 含有 Amp 的 LB 培养基中，37℃培养过夜，第 2
天按照 1∶100 接种于 100 mL LB 培养基中，培养至
OD600=0.6-0.8，加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导
4 h。离心收集菌体，在冰上进行超声破碎，条件：
300 W，超声 4 s，间隔 4 s，10 min。破碎之后离心
收集上清液。将上清液与等体积的 2×SDS 上样缓
冲液混合，沸水浴 3-5 min，取 8 μL 进行 SDS-PAGE
电泳检测，以转化有空质粒 pGEX-4T-1 的大肠杆菌
BL21 为对照。SDS-PAGE 蛋白电泳参照《分子克隆
实验指南》第 5 章，蛋白质用考马斯亮蓝 R-250 染 
色，使用的分离胶浓度为 12%。
1.2.5  Western-blot 检测  目的蛋白中引入了 HA 标
签，用此标签进行Western-blot 检测目的蛋白，一抗：
小鼠源 Anti-HA antibody，二抗：荧光素标记羊抗鼠
IgG。经过 SDS-PAGE 电泳后，去除浓缩胶，按照分
2016,32(6) 145卢敏等：家蝇抗菌肽 diptericin基因在大肠杆菌中的表达
离胶尺寸剪好滤纸和硝酸纤维素膜（NC 膜），并将
其与电转移装置配套的海绵垫置于转移缓冲液平衡
10 min。安装好电转移装置后，冰浴条件下 3 W 转
移 110 min。将 NC 膜用封闭液封闭 2 h，一抗在室
温下孵育 1-2 h，二抗室温孵育 1 h，用 Odessey 荧
光WB检测系统扫描图片。
1.2.6  diptericin-GST 融 合 蛋 白 的 纯 化  将 重 组
pGEX-4T-1-diptericin-BL21 大肠杆菌诱导表达后，离
心取菌体沉淀进行超声破碎，取上清液用 0.45 μm
的过滤器进行过滤。按照 GSTrap HP 1 mL 纯化柱操
作方法进行纯化，并进行 SDS-PAGE 电泳检测。
2 结果
2.1  家蝇幼虫总RNA的提取与RT-PCR扩增dipter-
icin基因
本实验用 RNAiso Plus 试剂提取家蝇幼虫总
RNA，经电泳检测条带清晰完整性好，OD260/OD280
在 1.8-2.0 之间纯度好，为后续实验顺利进行奠定
了基础。RT-PCR 扩增 diptericin 基因，结果（图 1）
显示，扩增产物大小在 350 bp 左右，与预计的结果 
相符。
因长为 345 bp，diptericin 基因与 GenBank 中已公布
diptericin 序列的同源性最高达到 99.9%，对其编码
蛋白进行分析，diptericin 基因编码 99 个氨基酸，分
子量约为 10.796 kD。
1 2 3 4 M
600
450
300
150
bp
1200
900
750
M：DNA Marker ；1-4 ：diptericin 基因
图 1 RT-PCR 扩增 diptericin 基因
2.2  重组菌pGEX-4T-1-diptericin-BL21的鉴定
提取阳性克隆质粒，进行 EcoR Ⅰ和 Xho Ⅰ双
酶切，出现了大小约为 4.9 kb 和 350 bp 的两条带，
表明重组质粒 pGEX-4T-1-diptericin 构建成功（图
2）。将通过鉴定的质粒送至上海生物技术服务有限
公司测序，分析测序结果，选取插入方向正确，具
有正确的阅读框，无碱基突变的重组菌。测序结果
显示，含有酶切位点及 HA 标签序列的 diptericin 基
1 2M
600
450
300
150
bp
M：DNA Marker ；1，2 ：重组质粒 pGEX-4T-1-diptericin 双酶切
图 2 重组质粒 pGEX-4T-1-diptericin 双酶切鉴定
2.3  家蝇diptericin融合蛋白诱导表达及检测
挑选重组 pGEX-4T-1-diptericin-BL21 的单菌落
进行诱导表达，细胞破碎后提取上清，经过 SDS-
PAGE 电泳，同时将大肠杆菌 BL21 和含有空质粒的
大肠杆菌 pGEX-4T-1-BL21 作为对照，结果（图 3）
显示，目的蛋白为带有 GST 标签的 diptericin 蛋白，
约为 37 kD，与理论大小相符，而对照组此位置均无
条带，pGEX-4T-1-BL21 经诱导后在大小约为 26 kD
处有明显条带，应为 GST 标签蛋白条带。
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
1 2 3 4 5 M
ⴞⲴᶑᑖ
M：蛋白分子质量标准；1：大肠杆菌 BL21；2：大肠杆菌 pGEX-4T-1-BL21； 
3 ：大肠杆菌 pGEX-4T-1-BL21 诱导上清；4：pGEX-4T-1-diptericin-BL21 未
诱导上清；5：pGEX-4T-1-BL21 诱导表达破碎上清
图 3 重组 diptericin 基因表达产物 SDS-PAGE 电泳
2.4  Western-blot检测
通过HA抗体进行Western-blot 检测，结果（图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6146
4）显示，pGEX-4T-1-diptericin-BL21 诱导后有单一
条带的目的蛋白，而对照组 pGEX-4T-1-BL21 无条 
带，表明 diptericin 基因成功在大肠杆菌 BL21 中得
到了表达。
载体上，实现了其在大肠杆菌中的融合表达，切除
GST 标签后的 Cecropin 蛋白对大肠杆菌具有一定的
抑菌效果，李小波等［5］将家蝇抗菌肽 attacin 克隆至
酵母表达载体 pPIC9K 中，实现其在毕赤酵母 GS115
中的表达。双翅肽（diptericin）最早由 Dimarcq 等［6］
从经细菌诱导的新陆原伏蝇 Phormia terranovae 幼
虫的血淋巴中分离得到，并证实其参与昆虫的体液
免疫防御且发挥着十分重要作用。然而，对于家蝇
diptericin 基因的研究并不多。
抗菌肽对蛋白酶非常敏感，而且表达抗菌肽对
宿主菌可能具有毒性或者表达的抗菌肽无活性［7］，
以融合蛋白的形式表达抗菌肽目的基因，可以减少
抗菌肽本身对宿主菌的毒害作用，同时还能保护抗
菌肽蛋白避免蛋白酶的降解［8］。pGEX-4T-1 是目前
较多使用的表达载体，它利用谷胱甘肽 S-转移酶基
因和目的基因连接，能够在大肠杆菌中产生 GST 融
合蛋白，并且可以用凝血酶进行切割 GST 蛋白而
获得目的基因产物。徐建华等［9］将家蝇 Attacin 基
因分别克隆至原核表达载体 pET30a（+）和 pGEX-
4T-1，转化大肠埃希菌，从 pET30a（+）/Attacin 重
组质粒的表达宿主菌中未能获得 His-Attacin 融合蛋
白，而从 pGEX-4T-1/Attacin 重组质粒转化菌种获得
了 GST-Attacin 融合蛋白。舒梅等［10］将水生动物抗
菌肽 Y18 和 CEC1 分别克隆到 pGEX-4T-1 载体上，
构建了 pGEX-Y18 和 pGEX-CEC1 两个融合蛋白表达
载体，获得了抗菌肽 Y18 和 CEC1，并发现融合蛋
白 GST-Y18 和 GST-CEC1、抗菌肽 Y18 和 CEC1 都
能有效地抑制 E.coli DH5α、S. aureus、B. subtilis 和 S.
cerevisiae 的生长。
本研究将家蝇 diptericin 基因克隆至 pGEX-4T-1
载体中，对重组大肠杆菌进行 IPTG 诱导，SDS-
PAGE 蛋白电泳检测到大小约为 37 kD 的目的蛋白，
Western-blot 也检测到单一蛋白条带，说明 diptericin
基因在大肠杆菌中进行了融合表达。经过纯化，得
到了含有 GST 标签的 diptericin 融合蛋白，以融合蛋
白形式表达的 diptericin 蛋白对宿主菌没有明显的抑
制生长作用，后续实验将通过切除 GST 标签来检测
diptericin 蛋白的生物活性，并通过研究不同诱导时
间、温度等条件来改善目的基因的表达，以期筛选
到可以高效表达 diptericin 蛋白的重组基因工程菌。
75
kD
63
48
35
25
20
M 1 2
M：蛋白分子质量标准；1：大肠杆菌 pGEX-4T-1-BL21 ；2 ：pGEX-4T-1-
diptericin-BL21
图 4 重组 diptericin 蛋白 Western-blot 检测
2.5  重组蛋白纯化
收集 pGEX-4T-1-diptericin-BL21 诱导表达后的
菌体超声破碎上清，通过 GSTrap HP 1 mL 纯化柱纯
化目的蛋白，将洗脱缓冲液洗脱后的样品进行 SDS-
PAGE 电泳检测，结果（图 5）显示，通过 GST 纯
化柱纯化到了目的蛋白，显示为单一条带，大小约
为 37 kD。
M 1 2
97.2
kD
66.4
44.3
29.0
M：蛋白分子质量标准；1，2：diptericin-GST 融合蛋白纯化
图 5 重组 diptericin 蛋白的纯化
3 讨论
已有许多学者对构建基因工程菌来生产抗菌肽
进行了研究，包括原核表达和真核表达，如 Liang 
等［4］利用将家蝇 Cecropin 基因克隆到 pGEX-4T-1
2016,32(6) 147卢敏等：家蝇抗菌肽 diptericin基因在大肠杆菌中的表达
抗菌肽有不同的种类，通过将不同的抗菌肽
串联进行表达有望得到活性更高的杂合抗菌肽，如
陈玉海等［11］将非洲爪蟾皮肤分泌的两种抗菌肽
magainin Ⅱ和 PGLa 在毕赤酵母中进行杂合表达，
构建了杂合抗菌肽 magainin Ⅱ -PGLa 的分泌型毕赤
酵母表达载体，实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的
分泌表达。因此，今后可将不同的家蝇抗菌肽基因
进行串联表达，获得抗菌谱更广、活性更高的基因
工程抗菌肽蛋白。
4 结论
本研究成功构建了家蝇 diptericin 基因原核表达
载体 pGEX-4T-1-diptericin-BL21，在大肠杆菌 BL21
中获得了该蛋白的可溶性表达，经过 GST 标签纯化
柱纯化得到了 diptericin 蛋白。
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（责任编辑  马鑫）