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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):143-150
收稿日期 ：2015-09-16
基金项目 ：海南省星火产业带专项资金项目（HNXH201532），农业部热带作物种质资源保护项目（15RZZY-23）
作者简介 ：周海兰，女，硕士研究生，研究方向 ：种质资源，E-mail ：398803451@qq.com ；李绍鹏为本文并列第一作者
通讯作者 ：李茂富，男，硕士，副教授，研究方向 ：果树栽培生理 ；E-mail ：hafu98022@126.com
油梨基因组 DNA 提取、SSR-PCR 反应体系优化及
引物筛选
周海兰1  李绍鹏1  李卫亮1  贺军虎2  包冬红1  李茂富1
（1. 海南大学园艺园林学院 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室（海南大学），海口 570228 ；
2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，儋州 571737）
摘 要 ： 旨在建立稳定可靠的油梨（Persea americana Mill）叶片 DNA 的提取方法和 SSR-PCR 反应体系及筛选出稳定的油梨
SSR 多态性引物，为开展油梨种质 SSR 分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材，比较 3 种油梨叶片 DNA 提取方法 ；利
用 L16（4
5）正交实验设计对油梨 SSR-PCR 反应体系进行优化 ；利用优化的反应体系筛选引物 ；同时，选取 5 对多态性引物对 45
份油梨种质进行 PCR 扩增，进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明，常规 2×CTAB 法、改良 2×CTAB 法和植物 DNA 提取试
剂盒法等 3 种 DNA 提取方法中，改良 2×CTAB 法对油梨基因组 DNA 的提取效果最佳；获得最优反应体系为：20 μL 总反应体系中，
含约 40 ng DNA 模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA 聚合酶、0.5 μmol/L 引物；以此体系为基础进行引物筛选，
从 73 对油梨 SSR 引物中筛选出了 30 对扩增条带清晰的多态性引物，说明该反应体系可用于油梨 SSR 标记的进一步研究 ；稳定性
检测获得的谱带清晰，表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见，改良的 2×CTAB 法可用于油梨叶片 DNA 的大量样本提取，
优化后的 SSR-PCR 反应体系及筛选出的 30 对多态性引物可用于油梨 SSR 标记的进一步研究。
关键词 ： 油梨 ；DNA 提取 ；SSR 标记 ；体系优化 ；引物筛选
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.019
DNA Extraction，Optimization of SSR-PCR Reaction System and
Primer Screening of Persea americana
ZHOU Hai-lan1 LI Shao-peng1 LI Wei-liang1 HE Jun-hu2 BAO Dong-hong1 LI Mao-fu 1
（1. Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of
Education / College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Tropic Crops Genetic Resources
Institute，Chinese Academy of Tropic Agricultural Sciences，Danzhou 571737）
Abstract: This study is to establish a stable and reliable DNA extraction method，optimize the SSR-PCR reaction system，and screen
the stable polymorphism primers for avocado（Persea americana Mill）SSR for providing the genetic foundation to conduct the SSR molecular
marker of germplasm in avocados. Taking avocado’ leaves as the study material，3 avocado DNA extraction methods were compared，based on
the L16（4
5）orthogonal experiment design，the SSR-PCR reaction system in avocados was optimized，and then by optimized reaction system
the SSR primers were screened. To further test the stability of the optimized SSR-PCR system，the germplasms in 45 pieces of avocados were
amplified by PCR using 5 pairs of polymorphism primers. The results showed that ：among 3 DNA extraction methods of conventional 2×CTAB
method，improved 2×CTAB method，and plant DNA kit method，the improved 2×CTAB method was the best regarding the extraction effect
of avocado genomic DNA. The optimal SSR-PCR reaction system in avocados was：a total volume of 20 μL containing 40 ng of genomic DNA，1.5
mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTPs，0.5 U Taq DNA polymerase，0.5 μmol/L primer. Based on the above optimized reaction system，30 pairs
of polymorphism primers with clear bands were screened from 73 SSR primers of avocados，indicating that the reaction system can be used for
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4144
油梨（Persea americana Mill），又名鳄梨、酪梨、
牛油果等，原产于热带美洲，为樟科（Lauraceae）
油梨属（Persea）乔木果树，是一种著名的热带水果，
也是木本油料树种之一［1］，同时，因其四季常绿、
树姿优美，还可作为一种优良的绿化树种［2］。近年
来，随着世界油梨生产发展迅速，产量与消费量与
日俱增，已成为引人瞩目的热带亚热带新兴水果，
现已广泛应用于食用、医药和化妆工业［3］，具有较
高的经济效益，经济潜力巨大。我国于 1918 年就已
引进油梨品种［2，4］，在广东、广西、云南、福建、
四川、台湾、海南等省（区）试种成功［5］，但由于
我国油梨资源研究匮乏、适栽品种较少及消费市场
的有限性导致油梨生产发展十分缓慢，尚未形成大
规模商品性生产。故研究油梨树种的多样性，深入
开发利用油梨资源成为目前研究的热点［4］。
简单序列重复（Simple sequence repeats，SSR），
又名微卫星 DNA，是以 1-6 个碱基为基本单元的串
联重复序列，广泛分布于植物基因组中［6，7］。SSR
标记具有通用性、高可变性、共显性遗传、重复性
好［6-9］等优点，且数量丰富，分布广，覆盖整个基
因组［10-14］，并能检测出丰富多样性。目前，该技
术已广泛用于遗传多样性检测［15-19］、遗传图谱构
建［20］、目标基因的标定［21］、指纹图的绘制［19，22］、
种质鉴定［17，23］、分子标记辅助选育［24］、品种纯度
鉴定［25］及杂种优势利用［26］等研究中。在国外，分
子标记已被证明在阐明油梨种质个体间的遗传关系
方面非常有用，其中小卫星技术［27-31］和微卫星技
术［32-34］已经被应用于油梨品种的指纹分析、鉴定
和分类 ；此外，种质资源鉴定、遗传图谱已经利用
分子标记构建［35-37］，但与其他作物相比，分子标记
技术在油梨方面的应用仍然不足，仍需要学者继续
利用分子标记对油梨种质进行研究。目前，在中国
RAPD、SSR 已分别用于油梨的品种分类及授粉研
究［38，39］，但油梨的发展仍然处于不成熟阶段，尤其
是油梨分子标记的研究相对滞后，在一定程度上限
制了油梨遗传改良和育种工作的进行。
SSR 标记虽然有许多优点，但其反应条件易受
各种因素干扰，从而影响整个实验结果。因此，建
立适合的 SSR 检测体系至关重要，而油梨 SSR-PCR
体系优化尚未见报道。本研究对油梨基因组 DNA 提
取方法、SSR 反应体系形成及引物筛选进行摸索，
以期建立一套适合油梨的 SSR 反应体系，为油梨种
质资源遗传多样性及亲缘关系的分析提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用的油梨叶片取自于海南大学园艺园林
学院油梨种质资源圃。DNA 提取的实验材料选取 10
个品种 ；引物筛选的实验材料选取差异明显的哈斯、
大岭 7 号、福尔特及巴康品种为 DNA 模板 ；体系优
化选用哈斯品种。
引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，
PCR 所用 dNTPs、Taq 酶、DNA Marker 和植物基因
组 DNA 提取试剂盒均购自 TaKaRa 公司。PCR 仪为
Eppendorf Mastercycler Pro S，琼脂糖凝胶电泳仪为
Biometro Standard Power Pack P25，变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳仪为北京六一仪器厂 DYY-10C 型。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取与检测 以油梨叶片为
材料，比较 2×CTAB 法、改良 2×CTAB 法、植物
DNA 提取试剂盒法等 3 种方法的优劣 ；采用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳，以 DL2000 Marker 为标准，在琼
脂糖凝胶电泳仪 120 V 恒压下检查 DNA 的完整性检
测 DNA 的纯度和浓度 ；提取原液 -20℃保存。
1.2.1.1 2×CTAB 法 取 0.1 g 新 鲜 叶 片 放 入 研 钵
中，在液氮中研磨成粉末，转入预冷的 2 mL 离心
管，加入 850 μL 65℃预热的 2×CTAB 提取缓冲液
（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，
2 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇，pH8.0），摇匀，65℃
水浴 1 h，期间翻动几次 ；取出，加入等体积的氯
the further study of SSR markers in avocados. The bands of stability test were clear，showing that the optimized system was stable and reliable.
Thus，improved 2×CTAB method can be used in DNA extraction of plentiful samples，and the optimized SSR-PCR reaction system and the 30
polymorphism primers can be utilized for the further study of SSR markers in avocados.
Key words: Persea americana Mill ；DNA extraction ；SSR marker ；system optimization ；primer screening
2016,32(4) 145周海兰等：油梨基因组 DNA提取、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选
仿∶异戊醇（24∶1，V/V），混匀并上下颠倒数次，
12 000 r/min，4℃离心 10 min，将上清液转入另一干
净的 2 mL 离心管中，重复此操作 1 或 2 次 ；再将上
清液转到另一个 1.5 mL 的离心管中，加入 80 μL 的
NaAc（5 mol/L）和 2/3 体积的异丙醇，缓慢翻转，
混匀放置 -20℃冰箱 20 min 或以上 ；12 000 r/min，
4℃离心 10 min，弃上清，用 500 μL 的 70% 乙醇洗
涤沉淀两次，放于超净工作台吹干，然后加 100 μL
的 TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）
充 分 溶 解 ；再 加 RNaseA 酶 37℃ 水 浴 30 min， 取
出，-20℃保存待用。
1.2.1.2 改良 2×CTAB 法 取 0.1 g 新鲜叶片放入
研钵中，加少许 PVP 在液氮中研磨成粉末，转入
预冷的 2 mL 离心管，加入 850 μL STE 缓冲液（200
mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，
2% PVP，1% β-巯基乙醇，pH8.0），摇匀，置于冰上
5 min ；4℃条件下 5 000 r/min 离心 8 min，弃上清后
继续加入 850 μL STE 缓冲液清洗，再次 4℃条件下
5 000 r/min 离心 8 min，弃上清 ；加入 850 μL 65℃
预热的 2×CTAB 提取缓冲液，用振荡器振荡 1 min，
充分混匀，放入水浴锅中水浴约 1 h，期间来回轻缓
颠倒几次 ；取出至于冰上，加入 150 μL NH4AC 混
匀，静置 5 min，4℃下 12 000 r/min 离心 10 min ；取
上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V），
放入脱色摇床上来回摇荡 10 min，放入离心机，4℃
条件下 12 000 r/min 离心 10 min ；将上清液转入另一
干净的 2 mL 离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇
（24∶1，V/V），放入脱色摇床上来回摇荡 5 min，放
入离心机，4℃下 12 000 r/min 离心 10 min，根据上
清液情况，选择是否继续重复抽提一次 ；将上清液
转到另一个 1.5 mL 的离心管中，加入 80 μL 的 NaAc
（5 mol/L）和 2/3 体积的异丙醇沉淀，缓慢翻转，混
匀放置 -20℃冰箱 20 min 或以上 ；12 000 r/min，4℃
离心 10 min，弃上清，用 500 μL 的 70% 乙醇洗涤
沉淀两次，放于超净工作台吹干，然后加 100 μL 的
TE 缓冲液充分溶解 ；再加 1 μL RNaseA 酶 37℃水浴
30 min，取出，-20℃保存待用。
1.2.1.3 植物基因组 DNA 提取试剂盒法 TaKaRa
MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 步骤参照
说明书去多糖多酚的 Protocol- Ⅱ步骤进行。
1.2.2 PCR 扩 增 及 体 系 优 化 PCR 扩 增 结 果 会 因
Mg2+、dNTP、Taq 酶、 引 物 浓 度 及 模 板 DNA 量 等
因素而受到影响，为了得到清晰、客观、准确的结
果，需对反应条件进行优化后再进行大量样本扩
增。针对影响 PCR 扩增反应体系的 5 个因素（Mg2+、
dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物及模板 DNA 量），结
合相关文献报道，选用 L16（4
5）正交实验设计，共
16 个处理组合，每个组合 3 次重复，探讨正交实验
因素水平和正交设计见表 1 和表 2。
体系优化所用引物 AVAG21，反应体积为 20
μL。PCR 反应程序为 ：94℃预变性 3 min ；94℃变
性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个循环；
72℃延伸 10 min。检测用 2% 琼脂糖凝胶，120 V 恒
电压，电泳约 40 min，凝胶成像系统观察并拍照。
1.2.3 引物筛选 实验选用的 SSR 引物共 73 对，其
中 48 对参考 Sharon 等［35］的油梨 SSR 引物序列，25
对参考 Ashworth 等［40］的油梨 SSR 引物序列。根据
公式 ƞ=1-（1-1/2）n（n 为样品数，ƞ 为有多态性引
物的选中概率）计算选中的有多态性引物的概率，
本研究利用 4 个 DNA 样品进行测试，则有多态性引
物的选中概率为 93.75%。选取稳定性高、重复性好、
有多态性产物的引物对模板 DNA 进行 PCR 扩增。
由于引物的最佳退火温度不同，利用 TD-PCR
进行大量引物多态性筛选，反应程序为 ：94℃预变
性 3 min ；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸
1 min，其后每个循环退火温度下降 1℃，13 个循环；
94℃变性 30 s，45℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，27
个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 产物检测用 2% 琼
脂糖凝胶，120 V 恒电压电泳约 40 min ；PCR 产物
分离利用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶，60 W 恒定功率
电泳 1.5-2 h，参考杨珺的银染法［41］进行银染检测。
1.2.4 油梨 SSR-PCR 的多态性验证 选取较好的
方法大量提取的油梨基因组 DNA，选用筛选出的 5
对多态性引物、优化的 20 μL SSR-PCR 反应体系及
TD-PCR 程序对提取的 DNA 进行 PCR 扩增验证，检
测 DNA、优化体系及程序是否满足分子研究要求。
2 结果
2.1 基因组DNA的提取与检测
3 种方法提取的 DNA 比较 ：A260/A280 的比值常
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4146
用来表示 DNA 的纯度，核酸蛋白检测仪结果显示，
改良 2×CTAB 法产率最高 ；常规的 2×CTAB 法次
之，试剂盒法最低 ；常规的 2×CTAB 法 A260/A280 值
在 1.5-1.7 之间，部分 DNA 纯度符合 SSR 的要求，
改良 2×CTAB 法和 DNA 试剂盒法的该值在 1.7-2.0
之间，说明 DNA 的纯度都符合 SSR 的要求。DNA
电泳检测结果显示，常规 2×CTAB 法大部分泳道点
样孔有杂质，DNA 条带较暗，部分拖尾，有蛋白质
或者糖类杂质以及 RNA 污染（图 1-A）；改良 2×
CTAB 法提取的油梨叶片 DNA 条带亮度最大且各
条带较均匀清晰，稳定性高，杂质较少（图 1-B）；
DNA 试剂盒法提取的 DNA 条带最暗，亮度均匀几
乎无杂质，DNA 较纯，但成本高，不利于大批量样
品 DNA 的提取（图 1-C）。由此选用改良 2×CTAB
法提取大批量油梨植物基因组 DNA。
2.2 SSR-PCR体系优化
由图 2 可见，正交设计 SSR-PCR 反应体系的扩
增结果存在明显差异。在实验设计的 16 个组合、3
次重复中 ：组合 1、2、3、4、7、12、14 扩增条带
较弱或未扩增出条带，稳定性和重复性低 ；组合 5、
9、10、11、13、15、16 主带明显，但存在非特异
性带 ；组合 6、8 主带明显，无非特异性带，但两者
相对而言第 6 组合扩增条带亮度大、清晰，且稳定
性好、重复性高。综合比较分析，第 6 组合为油梨
的最优 SSR-PCR 反应体系，即 20 μL 总反应体系中，
含约 40 ng DNA 模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L
dNTP、0.5 U Taq DNA 聚合酶、0.5 μmol/L 引物。
2.3 引物筛选结果
采用优化的 SSR-PCR 反应体系和 TD-PCR 程序
进行引物多态性筛选，扩增得到清晰且特异性强的
表 1 油梨 SSR 反应体系正交设计因素水平表
水平
因素
Mg2+/（mmol·L-1） dNTP/（mmol·L-1） rTaq/U Primer/（μmol·L-1） DNA/ng
1 1.0 0.10 0.50 0.2 20
2 1.5 0.15 0.75 0.3 30
3 2.0 0.20 1.00 0.4 40
4 2.5 0.25 1.25 0.5 50
表 2 SSR-PCR 正交设计表 L16（45）
处理
因素
Mg2+/（mmol·L-1） dNTP/（mmol·L-1） rTaq/U Primer/（μmol·L-1） DNA/ng
1 1.0 0.10 0.50 0.2 20
2 1.0 0.15 0.75 0.3 30
3 1.0 0.20 1.00 0.4 40
4 1.0 0.25 1.25 0.5 50
5 1.5 0.10 0.75 0.4 50
6 1.5 0.15 0.50 0.5 40
7 1.5 0.20 1.25 0.2 30
8 1.5 0.25 1.00 0.3 20
9 2.0 0.10 1.00 0.5 30
10 2.0 0.15 1.25 0.4 20
11 2.0 0.20 0.50 0.3 50
12 2.0 0.25 0.75 0.2 40
13 2.5 0.10 1.25 0.3 40
14 2.5 0.15 1.00 0.2 50
15 2.5 0.20 0.75 0.5 20
16 2.5 0.25 0.50 0.4 30
2016,32(4) 147周海兰等：油梨基因组 DNA提取、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选
谱带（图 3）；结果表明该体系扩增不同引物时，条
带依然清晰稳定，重复性好，因此该体系适用于油
梨品种进行 SSR-PCR 扩增 ；对于大量引物的多态性
筛选，TD-PCR 省去了众多引物退火温度的摸索，可
以减少非特异性带的产生，有效提高筛选的特异性
和效率。73 对引物中，初步筛选出 30 条扩增较好
的多态性引物，多态性的引物达到 41%。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
bp
2000
bp
2000
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bp
2000
C
B
A ：常规 2×CTAB 法 ；B ：改良 2×CTAB 法 ；C ：DNA 提取试剂盒法
图 1 三种方法提取的 DNA 凝胶电泳图
M
bp
2000
250
100
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M
bp
2000
250
100
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M
bp
250
100
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1-16 ：16 个组合依次编号 ；M ：DL2000 Marker ；A、B、C ：16 个组合
的 3 次重复
图 2 SSR-PCR 正交实验结果
图 3 油梨多态性引物筛选
2.4 油梨的SSR多态性检测
选用已筛选出的 5 对多态性引物，利用优化的
SSR-PCR 反应体系和 TD-PCR 程序对 45 份油梨种质
的 DNA 进行扩增，所选用的 5 对多态性引物均得到
很好的扩增效果，获得了清晰稳定的谱带（图 4）。
电泳结果显示该反应体系进行大量 PCR 扩增时，条
带依然清晰稳定，重复性好，表明建立的 SSR 反应
体系稳定可靠，且筛选的引物多态性明显，适用于
油梨种质进行 SSR-PCR 扩增。
3 讨论
20 世纪 80 年代，CTAB 法开始在国内外广泛应
用，CTAB 是一种去污剂，既能裂解细胞又能有效沉
淀多糖，因此有其独到优点［42］。在 30 多年的发展
中，许多学者对 CTAB 法不断改进，除在技术上的
改进，大多是在 DNA 提取液成分配比上发生变化，
并针对不同物种形成独特的优化提取方法。许多报
道利用高盐缓冲条件下去除植物 DNA 中多糖［43-46］，
广泛采取 β-巯基乙醇、抗坏血酸或 PVP（聚乙烯毗
咯烷酮）等抗氧化剂来去除植物组织中的多酚类物
质［47，48］。樟科植物含有大量的多糖、鞣质、多酚、
单宁等次生代谢物，在 DNA 提取过程中经裂解液
处理后，细胞破碎，释放出次生代谢物，使提取液
变得异常黏稠，操作困难，导致提取的 DNA 质量
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4148
差，溶解困难［49］，对 PCR 产生影响，导致实验结
果不稳定和不可靠。本研究改良 2×CTAB 法所提
DNA 浓度及纯度均符合 SSR-PCR 扩增的要求，且该
法在 DNA 获得量上优于常规 2×CTAB 法和 DNA 试
剂盒法，原因主要在于其解决了黏稠、易氧化褐变
及 DNA 纯度低等问题。常规方法提取会使这些物
质与 DNA 发生不可逆的结合使 DNA 呈褐色、黏稠，
影响 DNA 质量，不能用于 PCR 扩增和酶切等分子
生物学研究 ；经多次实验发现与常规 2×CTAB 法
相比，改良 2×CTAB 法中样品中加入少许 PVP 研
磨，反复用 STE 缓冲液进行洗脱，同时在 65℃水浴
核裂解后加入 150 μL 7.5 mol/L 醋酸铵溶液可在很大
程度上解决黏稠问题，同时发现裂解后加入醋酸铵
溶液冰上静置 10 min 可以大量去除蛋白质杂质。抽
提时，与上下颠倒数次相比，放入脱色摇床上反复
摇荡几分钟，可获得较透明的上清液。在木本植物
DNA 提取中，提取液加入 β-琉基乙醇、PVP（聚乙
烯毗咯烷酮）等这几种抗氧化剂去除酚类物质是必
须的，这与闫桂琴等［50］的研究结果一致。故选用
改良 2×CTAB 法作为后期分子研究实验的油梨基因
组 DNA 提取方法对油梨大量样本进行提取。
SSR-PCR 反应涉及诸多因素，每个因素的反应
参数对反应体系有很大影响，确定合适的反应参数
是 SSR 分析的前提。SSR-PCR 反应体系中各组分均
可能影响扩增的特异性、敏感性和产量，采用多因
素联合优化的正交实验设计，借助合适的正交表，
利用正交表的均衡分散性和整齐可比性，可有效解
决理论与实际可行的实验次数的矛盾，以及实际所
做的有限量实验与要求全面掌握事物内在规律之间
的矛盾［51］。影响 PCR 扩增效率的因子主要有 5 个，
Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA 和引物的浓度
对 PCR 扩增效率都起着抑制或促进的作用。利用
正交设计优化油梨 SSR 反应体系是一种有效、适用
而且简便的方法，能较好地识别 SSR-PCR 反应体系
中的关键影响因素，并优化反应条件。本研究利用
正交实验设计方法建立了适合油梨 SSR-PCR 反应体
系的优化组合，即 20 μL 总反应体系中，含约 40 ng
DNA 模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5
U Taq 酶、0.5 μmol/L 引物，这与油松［52］、鸭茅［53］、
大豆［54］、东兴金花茶［55］、油葵［56］、冬瓜［57］、菊花［58］
等植物已报道的 SSR-PCR 优化体系都有所不同，说
明不同物种的 SSR-PCR 优化反应体系存在一定差异。
SSR-PCR 反应体系的优化、建立及引物的筛选
是 SSR 多态性标记应用的基础。影响 SSR 反应的主
要因子除了 Mg2+、dNTPs、Taq 酶、模板等外，SSR-
PCR 扩增时的退火温度也是一个关键要素，对扩增
条带有明显影响。本研究选用 TD-PCR 扩增程序进
行大量 SSR 引物多态性筛选，发现 TD-PCR 可以有
效避免退火温度过高或过低对 SSR-PCR 扩增反应造
成的影响，省去了众多引物退火温度的摸索，加快
了实验进程 ；可以减少非特异性带的产生，有效提
高筛选的特异性和效率 ；选用的 TD-PCR 引物筛选
程序为今后油梨 SSR 引物筛选提供一定的参考。
4 结论
本研究结果表明改良 2×CTAB 法对油梨基因组
DNA 的提取效果最佳；20 μL SSR-PCR 最优反应体系
含约 40 ng DNA 模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L
dNTPs、0.5 U Taq DNA 聚 合 酶、0.5 μmol/L 引 物 ；
以此体系为基础进行引物筛选，从 73 对油梨 SSR 引
物中筛选出了 30 对扩增条带清晰的多态性引物。
A
B
图 4 引物 AUCR418（A）和 AVD017（B）对 45 份油梨种质的扩增验证结果
2016,32(4) 149周海兰等：油梨基因组 DNA提取、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选
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（责任编辑 李楠）