全 文 ：李其雨, 李爱芬, 张成武. 真眼点藻类色素的提取与测定方法[J]. 生态科学, 2012, 31(3): 278-283.
LI Qi-yu, LI Ai-fen, ZHANG Cheng-wu. The method of extraction and determination of pigment in Eustigmatophyceae[J]. Ecological
Science, 2012, 31(3): 278-283.
真眼点藻类色素的提取与测定方法
李其雨，李爱芬*，张成武
暨南大学水生生物研究中心， 广州 510632

【摘要】分别采用甲醇、乙醇和丙酮 3 种有机溶剂提取 7 种真眼点藻的色素，比较 3 种有机溶剂提取色素的效果，测定 3 种有
机溶剂色素提取液的吸收光谱，利用分光光度法计算藻的叶绿素 a 和类胡萝卜素的含量，并比较甲醇和乙醇色素提取液在 A470
和 A666的最大吸收峰。结果表明：使用乙醇比甲醇和 90%丙酮操作更简便、快捷并且毒害低。3 种有机溶剂色素提取液的叶绿
素 a 和类胡萝卜素的含量均无显著性差异（P>0.05），提取率基本一致。色素在 3 种有机溶剂中的吸收光谱相似，甲醇和乙醇的
色素提取液在 A470和 A666的最大吸收峰并无显著性差异（P>0.05）。乙醇色素提取液可使用 Lichtenthaler 的公式计算色素含量。

关键词：真眼点藻；色素；甲醇；乙醇；丙酮；分光光度法

doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2012.03.009 中图分类号：Q945.11 标识码：A 文章编号：1008-8873(2012)03-278-06

The method of extraction and determination of pigment in Eustigmatophyceae
LI Qi-yu, LI Ai-fen*, ZHANG Cheng-wu
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Abstract：The methanol, ethanol and 90% acetone were used to extract seven strains of Eustigmatophyceae pigments respectively.
Extracting efficiency of three kinds of organic solvents on pigments was detected, the absorption spectrum of three organic solvent
pigment extractions was measured, then, content of chlorophyll a and carotenoid were evaluated with spectrophotometric method.
Moreover, the maximum absorption peaks of methanol pigment extraction and ethanol pigment extraction on A470 and A666 was
compared. The results showed: extracting with ethanol had higher efficiency while lower toxicity compared with methanol and 90%
acetone. Content of chlorophyll a and carotenoid extracted by three kinds of organic solvent had no significant differences, while
extracting rates in three kinds of organic solvent was similar (P>0.05). Also, the absorption spectrum of pigments extracted by three
kinds of organic solvent were similar, and the maximum absorption peaks of methanol pigment extraction and ethanol pigment
extractionin at 666 nm and 470 nm showed no significant differences (P>0.05). Content of pigment extracted by ethanol could be
calculated by the Lichtenthaler equation.

Key words：Eustigmatophyceae; pigment extraction; methanol; ethanol; acetone; spectrophotometric method



收稿日期：2012-02-20 收稿，2012-04-20 接受
基金项目：国家高技术研究发展计划“863”(2009AA06440)；国家重点基础研究发展计划“973”(2011CB2009001)；广东省教育部产学研结
合项目(2010A090200008)
作者简介：李其雨，女（1985—），硕士研究生，主要从事藻类生理生化研究
*通讯作者：李爱芬，E-mail：tiger@jnu.edu.cn
第 31 卷 第 3 期 生 态 科 学 31(3): 278-283
2012 年 5 月 Ecological Science May 2012
1 引言 (Introduction)
真眼点藻（Eustigmatos sp.）是一类生活于淡水、
海水或土壤表面的单细胞藻类。在 70年代初，Hibberd
和 Leedale[1-3]基于黄藻纲中 15 种藻的细胞超微结构
研究，提出将这类藻另立为真眼点藻纲。后来的研究
证实，真眼点藻类的色素组成也不同于黄藻纲[4-5]，
只有叶绿素 a，另外还含有独特的类胡萝卜素，如：
堇菜黄素(violaxanthin)、无隔藻黄素(vaucheriaxanthin)
等[6-9]。此外，真眼点藻类富含多不饱和脂肪酸，尤
其是二十碳五烯酸（EPA）、蛋白质、多种维生素和
矿物质，具有很高的应用开发价值[10-15]。
色素组成与含量是浮游植物的重要指征，可作为
水生态调查和生长测定等的参考和依据。目前，用于
测定色素含量的方法主要有分光光度法和高效液相
色谱法（HPLC），其中分光光度法设备和操作简便
被广泛应用。藻类的门类多，在细胞结构和色素组成
方面具有多样性。文献报道的藻类色素提取方法有直
接提取法和研磨、超声破碎以及反复冻融等提取法，
使用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、N，
N-二甲基甲酞胺（DMF）、二甲基亚矾(DMSO)和一
些混合有机溶剂，如：DMSO-丙酮、乙醇-丙酮、氯
仿-乙醇等[16-19]。目前，丙酮是最常用的色素提取溶
剂，但对于某些藻类情况不尽相同。有研究表明，对
于绿藻和甲藻使用乙醇明显优于丙酮，对于其他藻如
硅藻使用甲醇效果更佳。Sartory 等[20]研究证实在提
取绿藻叶绿素时乙醇或甲醇的效果明显优于丙酮和
丙酮-DMSO 等体积混合溶液。而陈宇炜[21]亦认为乙
醇提取效果优于丙酮。Jespersen 等[22]报道使用乙醇
提取浮游植物中叶绿素 a 的效率和甲醇相似。与此同
时，Moed 等[23]的研究亦表明乙醇与甲醇的提取效率
相近。
基于真眼点藻色素组成的特殊性，本文以 7
种真眼点藻为材料，对比甲醇、乙醇和丙酮 3 种有机
溶剂对叶绿素和类胡萝卜素的提取效率，并采用分光
光度法测定其含量，旨在为进一步研究真眼点藻的光
合生理等提供可靠的实验手段。
2 材料与方法 (Materials and methods)
2.1 藻种来源
实验用 7 种真眼点藻,分别为真眼点藻
（Eustigmatos sp.）、魏氏真眼点藻（Eustigmatos
vischeri）、大真眼点藻（Eustigmatos magnus）、波
氏真眼点藻（Eustigmatos polyphem）、点状魏氏藻
（Vischeria punctata）、斧形魏氏藻（Vischeria
helvetica ）、眼点拟微绿球藻（ Nannochloropsis
oculata），均由暨南大学水生生物研究中心微藻生物
能源与生物技术实验室保藏。
2.2 藻种培养
眼点拟微绿球藻用海水培养基，其余 6 种微藻用
BG-11 培养基。初始接种 OD750 为 0.6，微藻培养采
用 3 cm 柱状光合生物反应器，通入 1%的 CO2，培养
温度为(25±1) ℃，光照强度 300 μmol photons/m2·s，
24 h 持续光照。
2.3 实验设计
各取 7 种真眼点藻第 6天的藻液，分别采用甲醇
法、乙醇法和丙酮法提取色素，分别对使用不同方法
的提取效果进行比较，通过公式计算叶绿素 a 和类胡
萝卜素的含量，并测定 3种有机溶剂的色素提取液的
吸收光谱。采用乙醇法提取色素，将色素提取液分为
2 组，用氮气吹干，各加入甲醇和乙醇，各设 4个平
行，以此比较相同浓度下，甲醇和乙醇色素提取液在
A470和 A666的最大吸收峰值。
2.4 色素的提取与测定
甲醇法：取1 mL藻液，3 500 r/min离心10 min，
弃上清，用5 mL甲醇振荡藻细胞沉淀于室温黑暗中
提取，每隔30 min离心一次，直至沉淀为灰白色。取
1 mL上清液加入4 mL甲醇稀释，测定色素提取液在
665 nm、470 nm和666 nm处的吸光度，用Mackinney[24]
和Lichtenthaler[25-26]的公式分别计算叶绿素a和类胡
萝卜素的含量（表1）。
乙醇法：色素提取方法如上所述，测定乙醇提取
液在 663 nm、645 nm、630 nm、470 nm 和 666 nm
处的吸光度，利用 Kaczmar[27]的公式计算叶绿素 a 含
量，参照 Lichtenthaler[25]的公式计算类胡萝卜素的含
量（表 1）。
丙酮法：取 1 mL 藻液，3 500 r/min 离心 10 min，
弃上清，藻细胞用 5 mL 90%丙酮振荡混匀，于室温
黑暗中提取，每隔 30 min 离心一次，48 h 后将沉淀
转入研钵中充分研磨，测定 90%丙酮提取液在 664
nm、647 nm、630 nm 和 450 nm 处的吸光度，用
Jefferey 和 Humphrey[28]的公式计算叶绿素 a 的浓度，
3期 李其雨，等. 真眼点藻类色素的提取与测定方法 279
并用消光系数 E1cm1 %= 2 500 mM-1 计算胡萝卜素
含量[29]（表 1）。
表1 甲醇、乙醇和丙酮作为有机溶剂提取色素的计算公式
Table 1 The equations to evaluate the concentration of
pigments extracted by methanol, ethanol and acetone
有机溶剂
Organic
solvent
叶绿素a (mg·L-1) 计
算公式
Chlorophyll a (mg·L-1)
calculation equation
类胡萝卜素 (mg·L-1)
计算公式
Carotenoids (mg·L-1)
calculation equation
甲 醇
Methanol
13.43A665v/(lV) [(1000A470-44.76A666)/
221] v/(lV)
乙 醇
Ethanol
(11.64A663-2.16A645-0.
10A630) v/(lV)
[(1000A470-44.76A666)/
221] v/(lV)
90% 丙酮
90%
Acetone
(11.85A664-1.54A647-0.
08A630) v/(lV)
(A450 ×104) / 2500
式中：v─有机溶剂体积（mL），V─藻液体积（mL），l─
测定池光程（cm）
In the equations: v ─ the volume of organic solvent (mL), V ─ the
volume of algae liquid (mL), l ─ the length of spectrophotometric
pool (cm)
2.4 甲醇和乙醇提取法测定结果的比较
取 1 mL Eustigmatos polyphem 藻液，3 500 r/min
离心 10 min，弃上清，藻细胞沉淀用 10 mL 乙醇于
室温黑暗中提取 12 h，3 500 r/min 离心 10 min，取 1
mL 色素提取液于玻璃管中，用氮气吹干后，加入 5
mL 甲醇或乙醇，各设 4 个平行，测定色素甲醇提取
液和乙醇提取液在 666 nm 和 470 nm 处的吸光度，以
上操作均在黑暗中进行。
2.5 吸收光谱的测定
采用 UV-1810 紫外可见双波长双光束自动记录
分光光度计，分别测定 7 种真眼点藻色素在甲醇、乙
醇和 90%丙酮提取液的吸收光谱，狭缝宽度 2 nm，
扫描速度 200 nm/min。
2.6 数据处理
以Origin 8.5制图并采用SPSS13.0对数据进行统
计分析，差异显著性水平为 P＜0.05。
3 结果与分析 (Results and analysis)
3.1 3 种有机溶剂提取真眼点藻色素的比较研究
采用甲醇、乙醇和 90%丙酮完全提取真眼点藻的
色素所需时间见表 2。从表 2 可以看出，利用 90%丙
酮作为有机溶剂提取真眼点藻的色素比较困难，48 h
内均不能使色素提取完全。对于 7 种真眼点藻，甲醇
和乙醇比 90%丙酮的提取时间明显短，完全提取的操
作过程相对简便。不同种类真眼点藻色素的提取效果
亦存在差异，利用甲醇或乙醇很容易提取眼点拟微绿
球藻色素，0.5 h 提取完全，另外 6 种微藻乙醇的提
取时间和效果明显优于甲醇提取。根据以上结果，眼
点拟微绿球藻可使用甲醇或乙醇提取色素，其余 6
种真眼点藻，乙醇是提取色素的良好有机溶剂。
3.2 3 种溶剂色素提取液的吸收光谱
3 种有机溶剂提取的真眼点藻色素的吸收光谱
完全一致。图 1 是 Eustigmatos polyphem 的吸收光谱，
在可见光区有三个吸收峰，434 nm 是叶绿素 a 在蓝
光区的吸收峰，666 nm 是叶绿素 a 在红光区的吸收
峰，470 nm 的吸收峰属于类胡萝卜素。
表2 不同有机溶剂完全提取7种真眼点藻色素的时间
Table 2 The time needed to extract total pigment of seven Eustigmatophyceae strains with different organic solvents
藻名
Algae
甲醇(h)
Methanol(h)
乙醇(h)
Ethanol(h)
90%丙酮(h)
90% Acetone(h)
Eustigmatos sp. 38 22 ＞48
Eustigmatos vischeri 24 18 ＞48
Eustigmatos magnus 28 18 ＞48
Eustigmatos polyphem 44 20 ＞48
Vischeria punctata 16 11 ＞48
Vischeria helvetica 18 11.5 ＞48
Nannochloropsis oculata 0.5 0.5 ＞48
280 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷

3期 李其雨，等. 真眼点藻类色素的提取与测定方法 281
杂，一方面样品研磨费时，另外研磨转移容易导致样
品的色素损耗，并且丙酮的挥发性极强，对人体有害。
甲醇法与乙醇法的操作较简便，样品不需要转移，无
损耗。但甲醇法耗时较长，且毒性大于乙醇。因此，
使用乙醇作为真眼点藻的色素提取溶剂操作更简便
快捷。
Stauffer[31]和 Moran[32]报道，采用 DMF 从海洋浮
游植物中提取的叶绿素溶液在 664 nm 处的摩尔消光
系数与相同浓度叶绿素在 90%丙酮溶液中的几乎相
同(相差小于 3%)。于志刚等[33] 用孔石莼、金膜藻
和海黍子作为实验材料，测定了相同浓度叶绿素的
DMF溶液和90%丙酮溶液在664 nm处的吸光度的比
值，A664DMF/A664 丙酮分别为 1.03，0.98 和 1.02，从而
证实 Stauffe 和 Mora 的报道，且两者的色素提取液吸
收光谱相似，提出可用 Jeffrey 和 Humphrey 的公式计
算 DMF 中的色素含量。类胡萝卜素在甲醇和乙醇中
的摩尔消光系数未见报道，由于类胡萝卜素为混合
物，摩尔消光系数难以测定。本实验利用自行制备的
色素，测定了在甲醇和乙醇溶液中的吸光度值，证实
A666 和 A470 均无显著差异（P>0.05），A666 甲醇 /A666
乙醇和 A470 甲醇 /A470 乙醇分别为 0.990±0.008和 1.024±
0.018，且甲醇和乙醇的色素提取液吸收光谱相似。
根据朗伯-比尔定律，可推出甲醇和乙醇色素提取液
在 666 nm 和 470 nm 处的摩尔消光系数是相近的。因
此，用乙醇提取色素时可使用 Lichtenthaler 在甲醇提
取条件下的计算公式。且通过公式计算，甲醇和乙醇
色素提取液中的类胡萝卜素的含量并无显著性差异
（P>0.05）。

参考文献 (References)

[1] Hibberd D J, Leedale G F. Eustigmatophyceae - a new
algal class with unique organisation of the motile cell[J].
Nature, 1970, 225: 758-760.
[2] Hibberd D J, Leedale G F. A new algal class - the
Eustigmatophyceae[J]. Taxon, 1971, 20(4): 523-525.
[3] Hibberd D J, Leedale G F. Observations on the cytology and
ultrastructure of the new algal class, Eustigmatophyceae[J].
Annals of Botany, 1972, 36(1): 49-71.
[4] Whittle S J, Casselton P J. The chloroplast pigments of the
algal classes Eustigmatophyceae and Xanthophyceae. I.
Eustigmatophyceae[J]. British Phycological Journal, 1975,
10(2): 179-191.
[5] Whittle S J, Casselton P J. The chloroplast pigments of the
algal classes Eustigmatophyceae and Xanthophyceae. II.
Xanthophyceae[J]. British Phycological Journal, 1975,
10(2): 192-204.
[6] Lubian L M, Olimpio Montero, Ignacio Moreno-Garrido,
Huertas I E,Cristina Sobrino, Manuel Gonzalez-del Valle
Griselda Pares. Nannochloropsis (Eustigmatophyceae) as
source of commercially valuable pigment[J]. Journal of
Applied Phycology, 2000, 12: 249-255.
[7] Wafa Arsalane, Bernard Rousseau, Thomas J C. Isolation
and characterization of native pigment-protein complexes
from two eustigmatophyceae[J]. Journal of Phycology,
1992, 28(1): 32-36.
[8] Brown J. Functional Organization of chlorophylla and
carotenoids in the alga,Nannochloropsis salina[J].Plant
Physiol, 1987, 83(2): 434-437.
[9] Owens T G, Gallagher J C, Alberte R S. Photosynthetic
light-harvesting function of violaxanthin in
Nannochloropsis spp.(Eustigmatophycceae) [J]. Journal of
Phycology, 1987, 23(1): 79-85.
[10] 余颖, 陈必链. 微绿球藻的研究进展[J]. 海洋通报, 2005,
24(6): 75-81.
[11] 魏东, 张学成. 富含 EPA 的海洋微藻眼点拟微球藻的大
规模培养[J]. 中国海洋药物, 2003, 91(1): 5-10.
[12] 黄旭雄, 周洪琪, 朱建忠, 倪勤. 不同生长阶段微绿球藻
的营养价值[J]. 水产学报，2004, 28(4): 477-480.
[13] 魏东, 张学成, 隋正红, 徐怀恕. 氮源和 N-P 对眼点拟微
球藻的生长-总脂含量和脂肪酸组成的影响[J]. 海洋科
学, 2000, 24(7): 46-51.
[14] 王秀良, 刘晨临, 张学成. pH 对眼点拟微绿球藻的生长-
总脂含量及脂肪酸组成的影响[J]. 海洋科学, 2002, 26(5):
63-67.
[15] 吴瑞珊, 魏东. Fe 对眼点拟微球藻的生长和脂肪酸组成
的影响[J]. 海洋科学, 2008, 32(7): 93-96.
[16] 唐银凤. 叶绿素含量测定中的误差分析[J]. 南京理工大
学学报, 1997, 21(2): 130-132.
[17] 吴志旭, 张稚燕. 浮物植物体内叶绿素 a 测定方法的改
进[J]. 化学分析计量, 2002, 11(6): 37-38.
[18] 彭文彬, 刘红瑛, 陈敬员. 两种分光光度法测定浮游植
物叶绿素 a 的比对试验[J]. 黄石高等专科学校学报,
2002, 18(3): 34-36.
[19] 万修志. 提取测定淡水藻中叶绿素 a 的方法研究[D]. 山
东:山东建筑大学. 2011: 1-54.
282 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷
[20] Sartory D P, Grobbelaar J U. Extraction of chlorophyll a
from freshwater phytoplankton for spectrophotometric
analysis[J]. Hydrobiologia, 1984, 114(3): 177-187.
[21] 陈宇炜, 高锡云. 浮游植物叶绿素 a 含量测定方法的比
较测定[J]. 湖泊科学, 2000, 12(2): 185-188.
[22] Jespersen A M, Christoffersen K. Measurements of
chlorophyll-a from phytoplankton using ethanol as
extraction solvent[J]. Archiv fur Hydrobiologiel, 1987,
109(3): 445-454.
[23] Moed J R, Hallegraeff G M. Some Problems in the
Estimation of Chlorophyll-a and Phaeopigments from
Pre‐and Post‐acidification Spectrophotometrie
Measurements[J]. Internationale Revue dergesamten
Hydrobiologie und Hydrographie, 1978, 63(6): 787-800.
[24] Mackinney G. Absorption of light by chlorophyll
solutions[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1941,
140: 315-322.
[25] Lichtenthaler H K, Wellburn A R. Determinations of total
carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in
different solvents[J]. Biochemical Society Transactions,
1983, 11: 591-592.
[26] Wellburn A R. The spectral determination of chlorophylls
and b, as well as total carotenoids, using various solvents
with spectrophotometers of different resolution[J]. Plant
Physiology, 1994, 144(3): 307-313.
[27] Kaczmar. Phytoplankton pigments[OL]. 2004,
http://water.iopan.gda.pl/~kaczmar/bdo/pigments.htm.
[28] Jeffrey S W, Humphrey G F. New spectrophotometric
equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in
higher plants, algae and natural phytoplankton[J]. Biochem.
Physiol. Pflanzen, 1975, 167: 191-194.
[29] 李东侠, 丛威, 蔡昭铃, 施定基, 欧阳藩. 铁胁迫诱导的
赤潮异弯藻细胞生化组成变化[J]. 应用生态学报, 2003,
14(7): 1185-1187.
[30] Henriques M, Silva A, Rocha J. Extraction and
quantification of pigments from a marine microalga:a
simple and reproducible method[J]. Journal of Applied
Microbiology, 2007, 1: 586-593.
[31] Stauffer R E, Lee G F, Armstrong D E. Estimating
Chlorophyll Extraction Biases[J]. Journal of the Fisheries
Research Board of Canada. 1979, 36(2): 152-157.
[32] Moran R, Porath D. Chlorophyll Determination in Intact
Tissues Using N, N-Dimethylformamide[J]. Plant
Physiology, 1980, 65(3): 478-479.
[33] 于志刚, 张经, 张耀红, 刘素美. 提取测定大型海藻叶绿
素 a 的新方法[J]. 1997, 5: 1-2.



3期 李其雨，等. 真眼点藻类色素的提取与测定方法 283