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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):200-205
迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）是革兰氏阴
性菌，属肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、爱德华菌
属（Edwardsiella），是爱德华菌病的病原菌，最初是
1962 年从日本鳗鱼中分离［1］。该菌普遍存在于海水
收稿日期 ： 2016-01-04
基金项目 ：海洋公益性行业科研专项（201405003）
作者简介 ：杨川，男，硕士研究生，研究方向 ：水生动物医学 ；E-mail ：804290352@qq.com
通讯作者 ：李强，男，博士，教授，研究方向 ：水生动物医学 ；E-mail ：liqiang@dlou.edu.cn
抗迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）单克隆抗体的制
备及双抗夹心 ELISA 检测方法的建立
杨川  秦艺丹  胡潜  李强
（大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室，大连 116023）
摘 要 ： 以迟缓爱德华菌株 2CDM001为抗原，利用杂交瘤技术制备了迟缓爱德华菌的单抗 8D11、8H4、2F4、18C12、
16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5、18H9。在特异性方面，单抗 8H4和 2F4特异性较差，与美人鱼弧菌 ATCC33539、鮰爱德
华菌 ATCC33202等参考菌株均出现不同程度的交叉反应，而其余 9株单抗特异性强，与实验中用到的除迟缓爱德华菌外的参考菌
株均不结合；但与迟缓爱德华菌分离株的检测结果表明，仅有 20D3和 8H4可与所有分离株结合，其余单抗不能与实验中所有迟
缓爱德华菌发生反应。由于单抗 8H4与美人鱼弧菌 ATCC33539有交叉反应，因此选单抗 20D3和兔源多抗建立迟缓爱德华菌的双
抗夹心 ELISA检测方法，该方法特异性强，灵敏度达到 5×107CFU/mL。本研究扩充了迟缓爱德华菌单克隆抗体库，为迟缓爱德华
菌单克隆抗体的进一步应用提供更多参考数据和可选择的材料。
关键词 ： 迟缓爱德华菌；单克隆抗体；双抗夹心 ELISA
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.029
Production of Monoclonal Antibodies Against Edwardsiella tarda，and
Establishment of Double-antibody Sandwich ELISA Method
YANG Chuan QIN Yi-dan HU Qian LI Qiang
（Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea（Ministry of Agriculture），Dalian Ocean University，
Dalian 116023）
Abstract: Using Edwardsiella tarda 2CDM001 as antigen and hybridoma technique，we prepared the monoclonal antibodies（mAbs）
8D11，8H4，2F4，18C12，16E2，20D3，19G2，5F7，4E6，7C5 and 18H9 against E. tarda. Among these mAbs，8H4 and 2F4 had the
poor specificity，presented varied cross reactions with control strains such as Vibrio damsela（ATCC33539）and Vibrio damsela（ATCC33539）.
The other 9 mAbs had favorable specificity and no cross reactions with control strains except E. tarda used in the experiment. The result of
detecting E. tarda isolates showed that only 20D3 and 8H4 reacted with all the E. tarda isolates，and the rest of mAbs did not reacted with all
the E. tarda isolates. Due to the cross reaction of 8H4 with V. damsela（ATCC33539），thus 20D3 was selected to establish a double-antibody
sandwich ELISA for E. tarda with rabbit polyclonal antibody. The double-antibody sandwich ELISA possessed the strong specificity，and of
which the limited detecting concentration reached 5 × 107 CFU /mL. In conclusion，this study expanded the mAbs library for E. tarda，and
also provided more reference data and alternative materials for further application of E. tarda mAbs.
Key words: Edwardsiella tarda ；monoclonal antibodies ；double-antibody sandwich ELISA
2016,32(7) 201
杨川等 ：抗迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）单克隆抗体的制备及双抗夹心 ELISA
检测方法的建立
和淡水环境中，可以感染日本鳗鲡、真鲷、黄鰤、
斑点叉尾鮰及大菱鲆等多种重要经济鱼类，也给牙
鲆养殖造成严重的经济损失［2］。迟缓爱德华菌的宿
主范围很广，除了鱼类是其最常见的宿主，同时还
可以感染爬行类、两栖类、水生鸟类、海洋哺乳类
以及其它陆生哺乳类，也可以导致人类胃肠疾病、
皮肤软组织和胆管感染、菌血症、腹膜炎、脑膜炎等，
而且是一种人畜共患菌［3］。
目前针对迟缓爱德华菌的检测方法主要是通过
传统的细菌分离培养，进行细菌形态学和各项生理
生化指标的鉴定。此外还有分子生物学鉴定方法［4］
以及免疫学鉴定方法，包括间接 ELISA 法［5］、Dot-
ELISA 法［6］、竞争 ELISA 法［7］等。但是这些检测
方法由于需要专业检测技能、昂贵的设备以及较长
的检测时间等原因而在实际应用中受到很大的限制。
以免疫层析原理建立起来的快速检测试纸条，具有
检测快速、操作简单的特点。免疫层析试纸条的技
术核心是双抗夹心 ELISA，双抗夹心 ELISA 是在间
接 ELISA 方法基础上发展起来的一种常用免疫检测
技术，该方法灵敏度高、特异性强，已被广泛应用
于人类医学［8，9］、畜牧业［10］、水产养殖业［11，12］、
食品安全［13］等领域。本实验通过研制抗迟缓爱德
华菌单克隆抗体，并进行双抗体夹心 ELISA 检测参
数的优化，旨在为迟缓爱德华菌胶体金快速检测试
纸条的研制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与培养基 RPMI 1640 培养液、胎牛血
清（HYCLONE 公司）；HAT（GIBCO 公司）；聚乙
二醇（PEG2000，MERCK 公司）；弗氏完全佐剂和
弗式不完全佐剂（Thermo 公司）；碱性磷酸酶（AP）
标记的羊抗小鼠 IgG（SIGMA 公司）；6-8 周龄 SPF
级雌性 Balb/C 小白鼠（大连医科大学 SPF 实验动
物中心）；抗迟缓爱德华菌 2CDM001 兔源多克隆
抗体由本实验室制备，纯化后的兔多抗效价为 1∶
320000。
1.1.2 菌株与细胞株 本实验中用到的参考菌株共
12 株，分别为杀鲑气单胞菌 Aeromonas salmonicida
（MT004）、美人鱼弧菌 Vibrio damsela（ATCC33539）、
副 溶 血 弧 菌 Vibrio parahaemolyticus（KCTC2471）、
创 伤 弧 菌 Vibrio vulnificus（ATCC2126）、 溶 藻 弧 菌
Vibrio alginolyticus（KCCM40513）、 鳗 弧 菌 Vibrio
anguillarum（KCTC2711）、鮰爱德华菌 Edwardsiella
ictaluri（ATCC33202）、 海 豚 链 球 菌 Streptococcus
iniae（KCTC3657）、 灿 烂 弧 菌 Vibrio splendidus
（ATCC33125）、 希 瓦 氏 菌 Shewanella oneidensis
（KCCM41821）、哈维弧菌 Vibrio harveyi（ACTT14126）
和 迟 缓 爱 德 华 菌 Edwardsiella tarda（ATCC15947），
迟缓爱德华菌分离株共 6 株（2CDI901、2CDA101、
2CDX001、2CDM001、2CDM002、2CDM003），其中
2CDM001 为本实验中使用的免疫菌株，该菌株由辽
宁地区患病大菱鲆分离得到。SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞
为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 单克隆抗体的制备 参考文献［14］，用灭活的
迟缓爱德华菌 2CDM001 作为抗原，分 4 次免疫 6 周
龄的 Balb/C 小鼠。采用细胞融合技术将免疫小鼠的
脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，再通过间接 ELISA、
IFA 等方法进行筛选，有限稀释法进行 3 次克隆。
1.2.2 单克隆抗体特性分析
1.2.2.1 特异性分析 为了增强实验的准确性，本
实验分别用了间接 ELISA 和 IFA 两种方法对单抗
20D3 进行特异性分析［15］。利用间接 ELISA 方法，
选择 1.1.2 中所述 12 株参考菌株以及包括 2CDM001
菌株在内的 6 株迟缓爱德华菌分离菌株进行单抗特
异性检测。菌株于 28℃下培养 24 h，用无菌 PBS 调
节菌悬液浓度为 1×108CFU/mL，分别包被 96 孔聚
苯乙烯酶标板。一抗为单克隆抗体，取 SP2/0 培养
上清作为阴性对照。
利用间接 IFA 方法［16］，用 PBS 调整各菌株的
浓度至 5×108CFU/mL 制作滴片，以单抗细胞 20D3
上清为一抗，SP2/0 细胞上清为阴性对照，FITC 标
记的羊抗鼠 IgG 为显色二抗。
1.2.2.2 效价的测定 利用间接 ELISA 技术，通过
棋盘滴定法检测单克隆抗体的效价，单克隆抗体
以 2 倍比（21 -210）进行系列稀释 ；包被抗原迟缓
爱 德 华 菌 2CDM001 以 10 倍 比 进 行 稀 释（5×108-
5×105CFU/mL），能保持阳性的最大稀释倍数即为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7202
该单抗的效价。
1.2.3 双抗夹心 ELISA 方法的建立
1.2.3.1 双抗体夹心 ELISA 操作流程 以抗迟缓爱
德华菌 2CDM001 的多克隆抗体作为包被抗体，单克
隆抗体 20D3 为检测单抗，AP 标记的羊抗鼠 IgG 为
显色抗体，建立检测迟缓爱德华菌 2CDM001 的双抗
夹心 ELISA 方法［17］。
1.2.3.2 抗体最佳工作浓度的确定 用碳酸盐缓冲
液（15 mmol/L Na2CO3，35 mmol NaHCO3，pH9.6）
将多克隆抗体从 1∶50 至 1∶6 400 进行 2 倍比系列
稀释，包被 96 孔酶标板，使用 PBS 将单克隆抗体从
原 液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 进 行 2 倍
比系列稀释，迟缓爱德华菌 2CDM001 浓度为 5×108
CFU/mL，参照上述 1.2.3.1，采用棋盘滴定法确定多
克隆抗体及单克隆抗体最佳工作浓度。
1.2.3.3 特异性试验 利用 12 株参考菌株及 6 株
迟缓爱德华菌分离株进行特异性检测，浓度均为
5×108CFU/mL。多克隆抗体及单克隆抗体均采用最
佳工作浓度，参照上述 1.2.3.1 的双抗夹心 ELISA 操
作流程进行特异性分析试验。
1.2.3.4 敏感性试验 将迟缓爱德华菌 2CDM001 用
PBS 进行 10 倍系列稀释，多克隆抗体及单克隆抗体
采用最佳工作浓度，参照上述 1.2.3.1。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株
经过筛选和 3 次克隆后，共获得 11 株稳定分
泌抗迟缓爱德华菌 2CDM001 的单克隆抗体的杂交
瘤细胞株，分别命名为 8D11、8H4、2F4、18C12、
16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5 和 18H9。
2.2 单克隆抗体效价及特异性
经间接 ELISA 法检测，11 株单克隆抗体 8D11、
8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、
4E6、7C5、18H9 效价分别为 1∶512、1∶256、1∶256、
1∶256、1∶512、1∶64、1∶1024、1∶32、1∶256、
1∶256、1∶512。
在特异性方面，单抗 8H4 和 2F4 特异性较差，
与多种参考菌株均出现不同程度的交叉反应，而其
余 9 株单抗特异性强，与参考菌株均不结合 ；但与
迟缓爱德华菌分离株的检测结果（表 1）表明，仅
有 20D3 和 8H4 可与所有分离株结合，但单抗 8H4
与美人鱼弧菌交叉反应，因此选择单抗 20D3 建立
双抗体夹心 ELISA。其余单抗均不能与实验中所有
迟缓爱德华菌发生反应。
经荧光显微镜观察，迟缓爱德华菌参考菌株
ATCC15947（图 1-A）和免疫菌株 2CDM001（图 1-
表 1 交叉反应结果
菌株 8D11 8H4 2F4 18C12 16E2 20D3 19G2 5F7 4E6 7C5 18H9
迟缓爱德华菌（2CDM001） + + + + + + + + + + +
杀鲑气单胞菌 MT004 - - + - - - - - - - -
美人鱼弧菌 ATCC33539 - + + - - - - - - - -
副溶血弧菌 KCTC2471 - - + - - - - - - - -
创伤弧菌 ATCC2126 - - - - - - - - - - -
溶藻弧菌 KCCM40513 - - - - - - - - - - -
鳗弧菌 KCTC2711 - - - - - - - - - - -
鮰爱德华菌 ATCC33202 - + + - - - - - - - -
河豚链球菌 KCTC3657 - - - - - - - - - - -
灿烂弧菌 ATCC33125 - - - - - - - - - - -
希瓦氏菌 KCCM41821 - - - - - - - - - - -
哈维弧菌 ACTT14126 - - - - - - - - - - -
迟缓爱德华菌 ATCC15947 - + + - - + - - - - -
迟缓爱德华菌 2CDI901 + + + + - + + + - - +
迟缓爱德华菌 2CDA101 - + + - - + - + - - -
迟缓爱德华菌 2CDX001 - + + + - + + + - - +
迟缓爱德华菌 2CDM003 - + + - - + + - - - -
迟缓爱德华菌 2CDM002 - + - + - + + + + + +
2016,32(7) 203
杨川等 ：抗迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）单克隆抗体的制备及双抗夹心 ELISA
检测方法的建立
B）均出现强烈的荧光信号，阴性对照（图 1-C）和
其它参考菌株均未出现荧光信号。同时对比迟缓爱
德华 2CDM001 在相同放大倍数、自然透射光条件下
的形态（图 1-D），与图 1-A 和图 1-B 中的荧光发光
体形态一致。IFA 实验结果佐证了间接 ELISA 特异
性分析结果的准确性。
Aeromonas salmonicida（MT004）、美人鱼弧菌 Vibrio
damsela（ATCC33539）、副溶血弧菌 Vibrio parahaem-
olyticus（KCTC2471）、 创 伤 弧 菌 Vibrio vulnificus
（ATCC2126）、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus（KCCM-
40513）、鳗弧菌 Vibrio anguillarum（KCTC2711）、鮰
爱 德 华 菌 Edwardsiella ictaluri（ATCC33202）、 海 豚
链 球 菌 Streptococcus iniae（KCTC3657）、 灿 烂 弧 菌
Vibrio splendidus（ATCC33125）、希瓦氏菌 Shewanella
oneidensis（KCCM41821）、 哈 维 弧 菌 Vibrio harveyi
（ACTT14126）11 株参考菌株均无交叉反应。
表 3 双抗体夹心 ELISA 法的特异性检测
菌株 OD405 P/N 值 结果
迟缓爱德华菌（2CDM001） 0.692 8.76 +
杀鲑气单胞菌 MT004 0.111 1.48 -
美人鱼弧菌 ATCC33539 0.107 1.43 -
副溶血弧菌 KCTC2471 0.114 1.52 -
创伤弧菌 ATCC2126 0.108 1.44 -
溶藻弧菌 KCCM40513 0.113 1.51 -
鳗弧菌 KCTC2711 0.120 1.60 -
鮰爱德华菌 ATCC33202 0.150 2.00 -
河豚链球菌 KCTC3657 0.109 1.45 -
灿烂弧菌 ATCC33125 0.110 1.47 -
希瓦氏菌 KCCM41821 0.105 1.40 -
哈维弧菌 ACTT14126 0.112 1.49 -
迟缓爱德华菌 ACCC15947 0.403 5.37 +
迟缓爱德华菌 2CDI901 0.412 5.49 +
迟缓爱德华菌 2CDA101 0.230 3.07 +
迟缓爱德华菌 2CDX001 0.437 6.31 +
迟缓爱德华菌 2CDM003 0.173 2.30 +
迟缓爱德华菌 2CDM002 0.482 6.43 +
2.5 双抗体夹心ELISA方法的灵敏度检测
双抗体夹心 ELISA 检测迟缓爱德华菌 2CDM001
10 μm
D
10 μm
A
10 μm
B
10 μm
C
A ：ATCC15947+ 单抗 20D3 ；B ：2CDM001+ 单抗 20D3 ；
C ：2CDM001+SP2/0 上清 ；D ：2CDM001
图 1　荧光显微镜观察结果
2.3 双抗体夹心ELISA法抗体最佳工作浓度确定
多抗最适包被浓度和单抗最适工作浓度如表 2
所示。通过尽可能提高多抗包被量以增加对抗原的
捕捉能力，参照 ELISA 方法中抗原包被浓度的筛
选办法［11］，当产生的 OD405 值接近 1.0 时的抗原浓
度作为最佳包被浓度，经试验测定多抗的最佳包被
浓度为 1∶1600 倍稀释，单克隆抗体最佳稀释度为
原液。
2.4 双抗体夹心ELISA方法的特异性检测
应用迟缓爱德华菌 2CDM001 双抗夹心 ELISA
检测技术对多种菌株的检测发现（表 3），该方法可
以特异性检测实验中用到的所有迟缓爱德华菌菌株
（1 株参考菌株，6 株分离菌株），与杀鲑气单胞菌
表 2 多抗最适包被浓度及单克隆抗体最佳工作浓度
多抗稀释倍数
单抗稀释度倍数
1 2 4 8 1 6 32
50 0.39 0.40 0.41 0.31 0.29 0.28
100 0.45 0.42 0.41 0.38 0.34 0.31
200 0.49 0.46 0.48 0.43 0.35 0.32
400 0.53 0.45 0.45 0.42 0.39 0.34
800 0.49 0.47 0.44 0.41 0.34 0.32
1600 0.77 0.42 0.42 0.37 0.33 0.31
3200 0.55 0.41 0.37 0.35 0.31 0.29
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7204
敏感性试验结果见表 4。以 PBS 作为菌悬液介质，
可检测的最低菌液浓度为 5×107CFU/mL。
表 4 双抗体夹心 ELISA 检测敏感性结果
细菌浓度 /（CFU·mL-1） OD405 P/N 结果
5×108 0.69 7.52 +
5×107 0.19 2.15 +
5×106 0.15 1.67 -
5×105 0.12 1.34 -
5×104 0.10 1.16 -
5×103 0.10 1.15 -
阴性对照 0.09
3 讨论
为了能够快速检测迟缓爱德华菌，有效的预防
和控制爱德华菌病，对该病早期快速诊断是非常重
要的。江云等［18］筛选出了检测致病性迟缓爱德华
菌的毒力基因，建立了致病性迟缓爱德华菌 PCR 检
测体系。兰建新［5］、白方方等［19］用迟缓爱德华菌
多克隆抗体建立了迟缓爱德华菌的间接 ELISA 检测
方法。朱壮春等［20］建立了 Dot-IGS 快速检测迟缓爱
德华菌的方法。但这些方法都需要一定的检测技术、
设备以及较长的检测时间。
对于快速便捷地检测迟缓爱德华菌，较为理想
的方法是利用双抗夹心法研制出一种免疫学诊断试
纸条。单克隆抗体的制备是研发试纸条过程中必不
可少的前期工作［21］，迟缓爱德华菌单克隆抗体的制
备在国内已有报道，但与本实验的方法略有不同。
吴斌［22］和金晓航［23］在免疫 Balb /c 小鼠时，直接
注射灭活的菌悬液，未用任何佐剂 ；本实验在免疫
小鼠时，初次免疫用到了弗氏完全佐剂，后 3 次加
强免疫用了弗氏不完全佐剂。到本试验通过大量筛
选，获得了一株具有很强特异性的杂交瘤细胞株
20D3。该单抗与试验中的所有迟缓爱德华菌株均产
生阳性反应，与实验中其他菌株均不结合，具有良
好的特异性。本实验中单抗特异性的检测使用的均
为纯化的菌株，对于混合菌株的检测效果后续实验
会进行评估。
双抗体夹心 ELISA 法是研制迟缓爱德华菌胶体
金试纸条的技术核心，该方法的特异性和灵敏度关
系到试纸条研发的成败。在特异性的检测中，本实
验建立的双抗夹心 ELISA 方法对实验中所有迟缓爱
德华菌株都产生阳性反应，而对试验所用的其它参
考菌株均无交叉反应。在灵敏度的检测中，该双抗
夹心法检测下限只有 5×107CFU/mL。而吴秋仙等［17］
以黄海希瓦氏菌 AP629 为抗原、兔源多抗以及鼠源
单抗建立了黄海希瓦氏菌 AP629 双抗夹心 ELISA 检
测方法，对于以 PBS 和海参体壁匀浆上清液为介
质的菌悬液，该方法检出限分别为 104CFU/mL 和
106CFU/mL。马卫静等［24］以阪崎杆菌 LPS 为抗原、
单克隆抗体 2A7 为捕获抗体、1A11-HRP 为检测抗
体建立阪崎杆菌双抗体夹心 ELISA 检测方法，对纯
培养液的检测限在 103-105CFU/mL。刘红亮等［25］以
E.coli O157∶H7 为免疫原，采用改良过碘酸钠法制
备的辣根过氧化物酶（HRP）酶标抗体，建立检测
E.coli O157∶H7 的双抗夹心 ELSA 方法，该方法对
纯培养菌液的检出下限为 3×104CFU/mL。相比之下，
本研究建立的双抗夹心 ELISA 方法灵敏度偏低，这
可能与杂交瘤细胞分泌抗体的能力以及上清液中抗
体的浓度有关，下一步我们将通过小鼠腹腔注射杂
交瘤的办法，避免外界环境对杂交瘤的干扰，进一
步提高杂交瘤分泌抗体的能力。
4 结论
本研究以灭活菌株 2CDM001 为抗原，利用杂
交瘤技术及间接 ELISA、IFA 等筛选方法，获得一
株能与实验中所有迟缓爱德华菌发生反应，而不与
实验中其它参考菌株发生反应的单抗 20D3。以单抗
20D3 和兔源多抗建立迟缓爱德华菌 2CDM001 的双
抗夹心 ELISA 检测方法，该方法可以检测实验中所
有的迟缓爱德华菌，与实验中其它参考菌株不发生
交叉反应，对以 PBS 为介质的 2CDM001 菌悬液的
检测灵敏度达到 5×107CFU/mL。
参 考 文 献
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2016,32(7) 205
杨川等 ：抗迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）单克隆抗体的制备及双抗夹心 ELISA
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（责任编辑 李楠）