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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):148-154
N 末端 B 型钠尿肽原（NT-proBNP）是心肌细
胞在合成多肽类激素 B 型钠尿肽（BNP）的过程中
所产生无生物活性的直链多肽片段［1］。当负荷引起
心室压力变化以及室壁张力的增加时，心室肌细胞
就会合成和分泌 NT-proBNP，因此 NT-proBNP 浓度
的升高可以很好地反映心室结构和功能的改变，以
及心脏有无损伤及损伤程度［2］。目前，NT-proBNP
已被公认为心功能紊乱最敏感和最特异的指标，
收稿日期：2015-08-28
作者简介：刘鹏展，女，硕士，研究方向：功能碳水化合物材料理论与技术；E-mail ：liupengzhan8023@126.com
通讯作者：何小维，男，博士，研究方向：功能碳水化合物材料理论与技术；E-mail ：Davidxwhe@126.com
NT-proBNP 特异性单克隆抗体的制备及鉴定
刘鹏展1  黄绮玲2  何小维1  李文美1，2  张文琪1  张赛2
（1. 华南理工大学食品科学与工程学院，广州  510640 ；2. 广州万孚生物技术股份有限公司，广州  510663）
摘 要 ： 旨在制备并鉴定抗人 NT-proBNP 特异性单克隆抗体。采用重组 NT-proBNP 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，取血清效价高的
脾细胞与 SP2/0 细胞融合，经 HAT 筛选和有限稀释法亚克隆，获得阳性杂交瘤细胞株，用动物体内诱生法制备腹水，用正辛酸 -
硫酸铵沉淀法将抗体纯化，并测定抗体的亚类、效价、特异性及相对亲和力。结果表明，获得 4 株能稳定分泌抗人 NT-proBNP 单
克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为 1G12、1B2、3D5 和 2D11。抗体 Ig 亚类，1G12 和 1B2 为 IgG2a 型，2D11 为 IgG1 型，
3D5 为 IgG2b 型 ；1G12，1B2 和 3D5 的抗体效价达到 106，而 2D11 的效价仅达 104。特异性好，1G12、1B2、3D5 和 2D11 四株抗
体的亲和常数依次为 9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012 和 6.33×1010。成功制备了特异性抗人 NT-proBNP 单克隆抗体。
关键词 ： NT-proBNP ；单克隆抗体 ；间接 ELISA 法
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.021
Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Specifically
Against Human NT-proBNP
LIU Peng-zhan1  HUANG Qi-ling2  HE Xiao-wei1  LI Wen-mei1，2  ZHANG Wen-qi1  ZHANG Sai2
（1. School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640 ；2. Guangzhou Wondfo Biotech
Corporation Ltd.，Guangzhou 510663）
Abstract:  This study aims  to prepare and  identify monoclonal antibodies specifically against human NT-proBNP. Balb/c mice was 
immunized with  labeled recombinant protein NT-proBNP，then the spleen cells with high titer of  the mice’s serum were fused with SP2/0 
myeloma cells. Further，the positive hybridoma cell  lines were established after HAT selection and subcloning by limiting dilution，ascites 
were prepared by injecting cells to mice’s abdomen，and monoclonal antibodies were purified by caprylic acid-ammonium sulfate precipitation 
method. Finally，basic functions of these monoclonal antibodies such as subclasses，titers，specificity，affinity constants were analyzed. Four 
positive hybridoma cell lines stably secreting human monoclonal antibodies of anti-NT-proBNP were screened out，and named as 1G12，1B2，
3D5，and 2D11 ；1G12 and 1B2 belonged to IgG2a，2D11 to IgG1，and 3D5 to IgG2b. The titers of 1G12，1B2 and 3D5 reached 106，while 
the titer of 2D11 only was 104 . The affinity constants of 1G12，1B2，3D5 and 2D11 were 9.32×1011，1.07×1012，2.31×1012，and 6.33×1010，
respectively. In conclusion，the monoclonal antibody of specifically against human NT-proBNP was prepared successfully.
Key words:  NT-proBNP ；monoclonal antibodies ；Enzyme-linked immunosorbent assay
2016,32(6) 149刘鹏展等：NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定
是诊断心力衰竭的一个具有划时代意义的客观标 
志物［3］。
目前国际上检测人 NT-proBNP 常用的是免疫
学方法，主要为 NT-proBNP 快速诊断试剂，其类型
包括多克隆抗体和特异性强、灵敏度高的单克隆抗
体。但是市售的 NT-proBNP 快速诊断试剂基本为
国外公司所垄断，如罗氏及生物梅里埃。而国内在
NT-proBNP 上的研究远远晚于国外，长期依赖进口，
给病患带来沉重的经济负担［4］。因此自主研发制备
优质的抗 NT-proBNP 商品化单克隆抗体可加快国内
NT-proBNP 快速诊断试剂的研发。本实验采用传统
的免疫学方法制备 NT-proBNP 单克隆抗体，以期为
其快速诊断试剂的开发提供良好的物质条件。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  材料及试剂  雌性 Balb/c 小鼠：6-8 周龄，
SPF 级，中山大学医学院实验动物中心；SP2/0 骨
髓瘤细胞，南方医科大学；带 DSBA 标签重组 NT-
proBNP（hrNT-proBNP-DSBA）、抗人 NT-proBNP  单
克隆抗体 H1、抗人 NT-proBNP 单克隆抗体 H3，
广州万孚公司提供；小鼠单抗 Ig 类 / 亚类鉴定用
ELISA 试剂盒，洛阳佰奥通实验材料中心；完全弗
氏佐剂、不完全弗氏佐剂，美国 Sigma 公司；其他
试剂均是分析纯。
1.1.2  仪器  96 孔酶标板：深圳金灿华；酶标仪，
Thermo scientific MK3 ；Gel DocTMXR+ 型凝胶成像系
统：美国伯乐公司。
1.2  方法
1.2.1  NT-proBNP 特异性单克隆抗体的制备
1.2.1.1  动物免疫  按照 50 μg 重组蛋白 / 只小鼠的
剂量将免疫原注射到 Balb/c 小鼠体内进行第 1 次免
疫。15 d 后，按照 25 μg 重组蛋白 / 只小鼠的剂量进
行第 2 次免疫。第 25 天后进行第 3 次免疫（同第 2
次免疫）。第 35 天后进行第四次免疫（同第 3 次免
疫），免疫完成后 7 d 用间接 ELISA 法检测小鼠血清
抗体效价［5］。
于融合前 3 d 按每只小鼠 100 μg 重组蛋白
（hrNT-proBNP-DSBA）的剂量，不加佐剂，直接小
鼠尾静脉注射进行加强，准备融合。
1.2.1.2  细胞融合和阳性克隆孔的筛选  采用 PEG
诱导的半固体基培养法进行细胞融合实验［6］，将免
疫效价达融合要求的脾细胞与 SP2/0 细胞按 10∶1
比例进行混合细胞培养［7，8］。采用间接 ELISA 法筛
选出对 hrNT-proBNP-DSBA 和 hrNT-proBNP 均呈阳
性的细胞株［9］。免疫小鼠血清、抗人 NT-proBNP 单
克隆抗体 H1 和 H3 分别稀释 1 000 倍作阳性对照，
未经免疫小鼠血清稀释 1 000 倍作阴性对照，空白
对照为稀释液。
1.2.1.3  阳性杂交瘤细胞的亚克隆  有限稀释法
对筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培
养［10］，间接 ELISA 法进行检测，选取对 hrNT-
proBNP 检测结果是阳性最强的克隆，进行连续亚克
直至细胞阳性率 100%，即可定株。
1.2.1.4  细胞冻存和复苏  用冻存液将 2.1.3 得到的
单克隆杂交瘤细胞株制成1×106个 /mL的细胞悬液，
液氮保存。复苏时，取出冻存管，立即放入 37℃水
浴中，离心去除冻存液，最后移入培养瓶内培养。
1.2.1.5  单克隆抗体的生产与纯化  选取健康成年
F1 小鼠，液体石蜡腹腔注射 0.5 mL/ 只。一周后，
收集生长状态良好的杂交瘤细胞，当细胞浓度为
0.5×106-1×106 个 /mL，每只小鼠腹腔注射 0.5 mL。
7-12 d 后，采集小鼠腹水。通过正辛酸 - 饱和硫酸
铵法纯化腹水［11］。
1.2.2  单克隆抗体的分析鉴定
1.2.2.1  单克隆抗体亚类的鉴定  将无标签重组蛋
白 hrNT-proBNP 稀释至 0.25 μg/mL，加入 96 孔酶标
板中进行抗原的包被。采用 ELISA 试剂盒，按照说
明书操作测定单克隆抗体亚类。
1.2.2.2  腹水及纯化后抗体效价的测定  用动物体
内诱生法制备单抗腹水，间接 ELISA 法进行鉴定［12］，
经 Bradford 法测定纯化后蛋白浓度。再将腹水或蛋
白浓度调整到 1 mg/mL，纯化后抗体分别用稀释液
稀释 103、104、105、106 和 107 倍，当 OD450 值大于
阴性对照值 2.1 倍以上的稀释倍数时的值作为腹水
及抗体的效价。融合小鼠的血清稀释 1 000 倍作阳
性对照，未经免疫小鼠血清稀释1 000倍作阴性对照，
稀释液作空白对照。
1.2.2.3  纯化后抗体纯度的测定  每个上样孔加入
5 μg 左右的抗体蛋白，使用 SDS-PAGE 电泳法并结
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6150
合美国伯乐公司的 Gel DocTMXR+ 型凝胶成像系统，
检测纯化后抗体纯度［13］。
1.2.2.4  单克隆抗体特异性鉴定
（1）Western blot 鉴定单克隆抗体与特异抗原的
反应原性：以无标签重组蛋白 hrNT-proBNP，采用
Western blot 法检测抗原抗体的识别反应［14］，排除
产生针对带 DSBA 标签和其它无关杂蛋白的抗体。
（2）间接 ELISA 法测定单克隆抗体与其它心肌
标志物的交叉反应性：在制备针对 hrNT-proBNP 快
诊试剂的单克隆抗体时，必须检测该抗体与其它心
肌标志物有无交叉反应，本实验采用间接 ELISA 法
测定单克隆抗体与其它心肌标志物的反应，包括心
型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）、肌红蛋白（Myo）、
肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白 I（CTnI）
等，以排除这些干扰因素影响。
1.2.2.5  检测单克隆抗体的相对亲和力  采用非竞
争 ELISA 法测定［15-17］亲和常数，用以评价抗体与
抗原结合的紧密程度，结合越牢固，则亲和力越强。
将无标签重组蛋白 hrNT-proBNP 稀释至 1 μg/mL，进
行倍比稀释，连续稀释 11 个梯度，最后酶标仪读取
OD450 数值。选择 4个最合适的包被浓度，每个浓度
包被 2行，重复实验。
1.2.2.6  单克隆抗体细胞稳定性实验  将定株的细
胞株扩大培养至T25培养瓶中，连续传代培养3个月，
每隔半个月使用间接 ELISA 法检测细胞培养上清的
抗体效价，以确定细胞株分泌抗体能力的稳定性。
2 结果
2.1  免疫小鼠血清效价分析
间接 ELISA 法测定第 4 次免疫 7 d 后小鼠尾静
脉血清的效价。结果（图 1）显示，小鼠均能产生
只针对 NT-proBNP 的抗体，且抗体效价均达 106，
符合融合要求。
2.2  细胞融合及阳性克隆筛选
本实验共进行 5 次细胞融合实验，累计挑取
5 000 株左右的杂交瘤细胞。最终得到 4 株对 hrNT-
proBNP-DSBA 和 hrNT-proBNP 均显阳性的细胞株，
分别命名 1G12、1B2、3D5 和 2D11，检测结果如图
2所示。
2.3  四株单克隆抗体亚类的鉴定
单克隆抗体亚类的鉴定结果（图 3）显示，
1G12 和 1B2 均为 IgG2a 型，2D11 为 IgG1 型，3D5
为 IgG2b 型。
1ਧ啐 2ਧ啐 3ਧ啐 4ਧ啐 5ਧ啐
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
45
0
1/1000
1/10000
1/100000
1/1000000䱤ᙗሩ➗オⲭ
图 1 第 4 次免疫后小鼠血清的效价
4
3
2
1
0
O
D
45
0
1G
12
1B
2
3D
5
2D
11 H
1
H
3 ݽ⯛啐㹰␵ 䱤ᙗሩ➗
hrNT-proBNP-DSBA
hrNT-proBNP
图 2 阳性杂交瘤细胞株的筛选
IgG1
1G12
1B2
2D11
3D5
IgG3 IgM IgA 䱤ᙗIgGH+LIgG2bIgG2a
图 3 四株单克隆抗体的亚类型鉴定
2.4  四株杂交瘤细胞的腹水及纯化后抗体效价的
检测
采用间接 ELISA 对小鼠腹水效价进行测定，结
2016,32(6) 151刘鹏展等：NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定
果（图 4）显示，1G12、1B2 和 3D5 的腹水效价均
能达到 106，而 2D11 的效价仅达 104。
根据 Bradford 法标准曲线，测得 4 株纯化后
抗体 1G12、1B2、3D5 和 2D11 的蛋白浓度分别为
3.98、4.96、3.18 和 3.97 mg/mL。将抗体浓度均调节
至 1 mg/mL，测定抗体的效价，结果（图 5）显示，
1G12、1B2  和 3D5 抗体的效价均能达到 106，而
2D11 的效价仅达 104。
2.5  检测4株纯化后单克隆抗体的纯度
检测 4 株纯化后单克隆抗体的纯度，结果（图
6）显示，4株抗体均可见两条明显的主带，抗体重
链大约为 50 kD，轻链约为 25 kD。经分析测得，单
克隆抗体 1G12、1B2、3D5 和 2D11 的纯度分别为
79.8%、86.3%、84.4% 和 75.3%，均大于 75%。 
2.6  四株单克隆抗体特异性检测
2.6.1  单克隆抗体Western blot 鉴定结果  结果（图
7）显示，4株单克隆抗体均能与分子量约为 8 kD 的
hrNT-proBNP 产生反应，且条带明显，无其它杂带。
表明这 4株单抗均为抗 hrNT-proBNP 的单克隆抗体，
与间接 ELISA 法的筛选结果一致。
2.6.2  单克隆抗体与其它心肌标志物的交叉反应性
检测  结果（图 8）显示，4株单克隆抗体与重组蛋
白 hrNT-proBNP 呈明显的阳性反应，与其它蛋白均
无特异性交叉反应。
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
45
0
1/1000
1/10000
1/100000
1/1000000
1/10000000䱤ᙗሩ➗オⲭ
1G12 1B2 3D5 2D11
图 4 四株腹水的效价检测结果
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
45
0
1/1000
1/10000
1/100000
1/1000000
1/10000000䱤ᙗሩ➗オⲭ
1G12 1B2 3D5 2D11
图 5 四株单克隆抗体的效价检测结果
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M 1 2 3 4
䖫䬮䟽䬮
M：蛋白分子量 Marker ；1 ：1G12 ；2 ：1B2 ；3 ：2D11 ；4 ：3D5
图 6 SDS-PAGE 电泳分析纯化后的抗体纯度
64
kD
50
36
16
6
8
kD
M 1
64
50
36
16
6
kD
8
kD
2 3 4 5 6
A
B
M：蛋 白 分 子 量 Marker ；1 ：hrNT-proBNP ；2 ：1G12 ；3 ：1B2 ；4 ：3D5 ； 
5 ：2D11 ；6 ：Mab-hH-FABP 1B9
图 7 四株单克隆抗体的 Western blot 分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6152
2.7  四株单克隆抗体相对亲和力检测
单克隆抗体相对亲和力检测结果（图 9）显示，
1G12、1B2、3D5 和 2D11 四株单克隆抗体识别包
被抗原 hrNT-proBNP 的亲和常数依次为 9.32×1011、
1.07×1012、2.31×1012 和 6.33×1010。
2.8  四株杂交瘤细胞株的稳定性
杂交瘤细胞株分泌抗体能力的稳定性的检测结
果（图 10）表明，4 株细胞均能连续 3 个月稳定分
泌特异性抗 hrNT-proBNP 的抗体。
3 讨论
BNP 隶属于钠尿肽家族，是一种肽类激素，具
有利尿、利钠、抗肾素—血管紧张素—醛固酮系
统、舒张血管和降低血压等作用，参与人体水盐平
衡的调节。而 NT-proBNP 则是 BNP 形成过程中所
产生的无生物活性的氨基酸片段，NT-proBNP 生物
半衰期更长更稳定，是比 BNP 更敏感可靠的指标，
因此在临床应用上逐渐取代了 BNP。正常人体内，
NT-proBNP 水平极低，外周血的浓度一般小于 450 
pg/mL，当因容量负荷引起心室压力的改变以及室壁
张力的增加时，会刺激 BNP 分泌，因此血液中 NT-
proBNP 浓度的升高能很好地反映心室结构和功能的
改变，心脏有无损伤及损伤程度［18］。大量临床研究
表明 NT-proBNP 在预测心力衰竭和术后监测方面是
代表性标志物，是一个强有力的独立预测因子［19］。
近年来 NT-proBNP 在检测胎儿 PDA和双胞胎宫内生
长受限方面也取得了重要的进展，成为一个更加重
要的指标［20，21］。
国际上检测NT-proBNP最常用的是免疫学方法，
包括双抗体夹心法，荧光免疫层析法，电化学发光
法等多种方法，而电化学发光法由于特异性强，灵
4
3
2
1
0
O
D
45
0
hrNT-proBNP
H-FABP
Myo
CK-MB
CTnI
1G
12
1B
2
3D
5
2D
11 ݽ⯛啐㹰␵ 䱤ᙗሩ➗
图 8 四株单克隆抗体与其它心肌标志物的交叉反应性
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
A
45
0
0 1000 2000 3000 4000 5000
0.0625 μg/mL hrNT-proBNPA
ᣇփ⎃ᓖμg·L-1
0.03125 μg/mL hrNT-proBNP
0.015625 μg/mL hrNT-proBNP
0.00708125 μg/mL hrNT-proBNP
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
A
45
0
0 1000 2000 3000 4000 5000ᣇփ⎃ᓖμg·L-1
0.0625 μg/mL hrNT-proBNP
0.03125 μg/mL hrNT-proBNP
0.015625 μg/mL hrNT-proBNP
0.0078125 μg/mL hrNT-proBNP
B
C
D
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
A
45
0
0 1000 2000 3000 4000 5000ᣇփ⎃ᓖμg·L-1
0.0625 μg/mL hrNT-proBNP
0.03125 μg/mL hrNT-proBNP
0.015625 μg/mL hrNT-proBNP
0.0078125 μg/mL hrNT-proBNP
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
A
45
0
0 2000 4000 6000 8000 10000ᣇփ⎃ᓖμg·L-1
0.0625 μg/mL hrNT-proBNP
0.03125 μg/mL hrNT-proBNP
0.015625 μg/mL hrNT-proBNP
0.0078125 μg/mL hrNT-proBNP
图 9 非竞争 ELISA 法检测 1G12（A）、1B2（B）、3D5
（C）和 2D11（D）的亲和常数
2016,32(6) 153刘鹏展等：NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
O
D
45
0
ㅜ0.5њᴸㅜ1њᴸㅜ1.5њᴸㅜ2њᴸㅜ2.5њᴸㅜ3њᴸ
1G
12
1B
2
3D
5
2D
11 ݽ⯛啐㹰␵ 䱤ᙗሩ➗
图 10 四株杂交瘤细胞株分泌抗体能力的稳定性的检测
敏度高，检测线低得到广泛应用。免疫学方法中诊
断试剂盒检测的准确性、稳定性与抗体的性能如特
异性、稳定性密切相关［22］。单克隆抗体由于特异性
强，均一性高，生物活性单一和来源稳定，易于大
量生产等优点在疾病研究及诊断中的应用逐步取代
了多克隆抗体。但生产检测试剂所需要的单抗隆抗
体基本上被国外公司所垄断，价格昂贵，因此国内
自主研发优质单克隆抗体显得很重要。制备单克隆
抗体基本分为两种方法，传统的免疫学方法和基因
工程的方法，传统免疫学方法技术成熟应用更为广
泛者，而基因工程技术由于可获得大量高活性，高
纯度，特异性强的抗体的优点，在临床研究中逐步
有所应用。本研究采用传统免疫学方法制备了 4 株
单克隆抗体，本章共进行了 5 次的细胞融合实验，
经间接 ELISA 法筛选和亚克隆后，共获得 4 株能稳
定分泌抗人 NT-proBNP 单克隆抗体的阳性杂交瘤细
胞株 1G12、1B2、3D5 和 2D11。采用小鼠体内诱
生法大量制备单抗腹水并用正辛酸 - 硫酸铵沉淀法
对腹水进行纯化获得 4 株相应的单克隆抗体。经鉴
定，4 株单克隆抗体的纯度均达 75% 以上，且与人
H-FABP、Myo、CK-MB、CTnI 等 4 种常见心肌标志
物的天然蛋白均无交叉反应，特异性良好；1G12、
1B2 和 3D5 的抗体效价可达 106，相对亲和常数分别
为 9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012 ；而 2D11 的
抗体效价达 104，相对亲和常数为 6.33×1010。2D11
抗体效价和亲和常数明显低于其它 3 株抗体，针对
开发免疫层析式快速诊断试剂时，需要高亲和力的
抗体才能实现检测灵敏，快速。这表明 2D11 极可
能不适合应用于荧光免疫层析平台。
利用本实验室特有的甲基纤维素半固体基培养
法进行杂交瘤细胞培养和筛选，在显微镜下直接挑
取单细胞克隆，大大地减少了利用传统的有限稀释
法进行细胞亚克隆的次数，极大地提高了抗体制备
的工作效率。获得了 4 株特异性抗人 NT-proBNP 的
单克隆抗体，丰富了国内市场 NT-proBNP 单抗的种
类。NT-proBNP 是一种标志性的心肌标志物，其临
床应用价值必将越来越广泛。因此针对 NT-proBNP
不同抗原表位的单克隆抗体也必将逐渐丰富起来，
同时为了增加诊断的准确性，结合其它的标志物如
cTnI 等制备复合型快速诊断试剂在未来必将有更加
广泛的应用。国内 POCT 市场对其快速定量试剂诊
断的需求必将越来越旺，研发更多国内优质的 NT-
proBNP 单克隆抗体对冲破国际市场的垄断，降低成
本，减轻病患的负担有更加积极的意义。
4 结论
本研究共进行了 5 次的细胞融合实验，经间
接 ELISA 法筛选和亚克隆后，共获得 4 株能稳定分
泌抗人 NT-proBNP 单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株
1G12、1B2、3D5 和 2D11。
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（责任编辑  马鑫）