全 文 ：2014 年 8 月 陕西理工学院学报( 自然科学版) Aug． 2014
第 30 卷第 4 期 Journal of Shaanxi University of Technology (Natural Science Edition)

Vol． 30 No． 4
［文章编号］1673 － 2944(2014)04 － 0055 － 06
盐蒿内生耐(嗜)盐真菌的分离及鉴定
丁小维
(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)
［摘 要］ 采用含盐浓度不同的培养基分离陕北花马盐湖盐蒿( Artemisia halodendron) 的内
生耐( 嗜) 盐真菌并研究其物种多样性。从盐蒿组织中共分离得到 1 215 株内生耐( 嗜) 盐真
菌，基于形态学和 ITS 系统发育分析表明，上述菌株属于 6 个属，包括小球腔霉属( Leptospha-
eria) 、青霉属( Penicillium) 、木霉属( Trichoderma) 、曲霉属( Aspergillus) 、链格孢属( Alternaria) 和
镰孢属( Fusarium) 。以小球腔霉属( Leptosphaeria) 为优势属，其次为链格孢属，其分离频率分
别为 78． 8%和 2． 28% ;共计 9 个代表种如产黄青霉( Penicillium chrysogenum) 、Aspergillus west-
erdijkiae、极细链格孢( Alternaria tenuissima) 和长梗木霉( Trichoderma longibrachiatum) 等。研究
表明，陕北花马盐湖盐蒿中蕴藏着丰富的耐( 嗜) 盐真菌物种资源。
［关 键 词］ 花马盐湖; 盐蒿; 耐( 嗜) 盐真菌
［中图分类号］ Q949． 32 ［文献标识码］ A
收稿日期:2014-05-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31100017);陕西省科学技术研究发展计划项目(2013KJXX-76)
作者简介:丁小维(1979—)，女，陕西省武功县人，陕西理工学院讲师，博士，主要研究方向为微生物资源开发与利用。
0 引 言
耐(嗜)盐真菌是能够在盐浓度为 0． 2 mol /L以上环境中生长的真菌，主要分布在盐湖、盐田、海洋
等高盐环境中。目前，对耐(嗜)盐真菌的研究主要集中在海洋环境耐(嗜)盐真菌物种多样性及其代谢
产活性物质方面［1-3］，而对植物内生耐(嗜)盐真菌的研究相对较少。钮旭光等［4］从辽宁双台子国家自
然保护区内陆盐碱地及潮间带生长的翅碱蓬(Suaeda salsa)中分离到 13 个属的内生真菌。在高盐环境
中生长的耐盐植物组织中可能蕴藏着丰富的耐盐内生真菌。此外，研究证实高盐地区植物内生真菌对
宿主适应盐逆境方面发挥重要作用［5-7］。因此，研究内陆极端盐湖区植物内生耐(嗜)盐真菌可为耐盐
植物的培育及促进盐碱化土壤的综合利用提供丰富的菌种资源。
花马盐湖属于碱性碳酸盐型内陆高盐湖泊，位于陕西省榆林定边县城西北 10 km 处的盐场堡乡。
花马盐湖蕴藏着非常丰富的碳酸钠、氯化钠、氯化钾及氯化钙等资源。该盐湖区寒暑变化剧烈，年降水
量小(年降水约为 316． 9 mm)，日照强烈，蒸发量大(年蒸发量高达 2 490 mm)，干燥及辐射强烈，因此具
有高盐碱、大温差、高寒、高热、干燥及强辐射等极端环境特征。盐湖区沉积物 Na +浓度从 46． 7 g /kg 到
饱和 Na +浓度，生长于湖岸的盐蒿其组织中 Na +含量为普通植物 6 倍多，该地区无疑是发掘极端耐
(嗜)盐真菌多样性的理想区域之一。
本文利用不同含盐培养基分离纯化花马盐湖区耐盐植物盐蒿的耐(嗜)盐真菌，基于形态学和 ITS
序列的系统发育关系认识真菌物种多样性，丰富我国盐湖真菌菌种资源，为耐(嗜)盐真菌的进一步开
发利用奠定基础。
·55·
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料
盐蒿(A． halodendron)采自陕北榆林定边县北盐堡乡花马盐湖区(海拔 1 301 m，纬度 37°40478N，
经度 107°30724E)。新鲜的植物材料收集于塑料袋中，置于冰盒中带回实验室，用于分离耐(嗜)盐真
菌。
1． 1． 2 分离培养基
分离培养基:(1)改良马铃薯琼脂培养基(cPDA) :去皮马铃薯 200 g /L，葡萄糖 20 g /L，KH2PO4
3 g /L，MgSO4 1． 5 g /L，维生素 B1 10 mg /L，琼脂粉 15 g /L，pH自然;(2)麦芽汁琼脂培养基(MEA) :麦芽
提取物 20 g /L，蛋白胨 1 g /L，葡萄糖 15 g /L，琼脂 15 g /L，pH 6;(3)酵母膏葡萄糖蛋白胨(YPD) :酵母
膏 5 g /L，蛋白胨 10 g /L，葡萄糖 20 g /L，琼脂粉 15 g /L，pH自然。在上述 3 种分离培养基中分别添加浓
度为 2． 5%，5%，10%和 15%的 NaCl。
1． 1． 3 主要仪器和设备
主要仪器设备:光学显微镜(E600 型，日本尼康公司)，荧光倒置显微成像系统(奥林巴斯 IX71 /
IX81)，冷冻超速离心机(Beckman) ，PCＲ 扩增仪(Bio-Ｒad)，电泳仪(Bio-Ｒad)，紫外凝胶成像分析系统
(Bio-Ｒad)及 DNA测序仪(ABI PＲISM 377)等。
1． 2 方法
1． 2． 1 耐(嗜)盐真菌的分离纯化
将盐蒿茎、叶组织置于自来水下冲洗 4 ～ 5 h后，在无菌条件下依次用有效氯含量为 4． 5% ～ 5%的
次氯酸钠(含 0． 01% Tween 80)处理 3 min，用 75%乙醇处理 15 s，最后用无菌水清洗 6 次。将表面消毒
彻底的植物材料切成 0． 5 cm2 小块，并置于分离培养基上，28 ℃恒温培养箱倒置培养 1 ～ 3 w，挑取菌丝
接入含 5% NaCl的 YPD斜面纯化培养，纯化斜面于 4 ℃保藏备用。
1． 2． 2 耐(嗜)盐真菌的鉴定
采用形态学并结合 ITS系统发育分析对内生真菌进行鉴定。菌落培养特征、菌丝、产孢结构及孢子
特征参照魏景超主编的《真菌鉴定手册》进行鉴定［8］。采用 CTAB法［9］提取盐蒿内生真菌基因组 DNA。
PCＲ反应体系(25 μL):超纯无菌水 9 μL，2 × PCＲ Mix 11 μL，10 μmol /L 的 ITS1 (5-TCCGTAGGT-
GAACCTGCGG-3)和 ITS2(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)各 2 μL，基因组 DNA 约 50 ng;PCＲ 反应
条件:95 ℃预变性 5 min;94 ℃ 变性 1 min，55 ℃退火 40 s，72 ℃ 扩增 1 min，35 个循环;72 ℃再保持
10 min。PCＲ产物由上海生工生物技术服务有限公司进行测序。序列提交 GenBank，并下载相似性高
的数据，用 Clustal-X［10］软件对所得序列文件进行比对分析，通过 Mega 4． 0 软件构建 N-J 系统发育
树［11］。
2 结果与分析
2． 1 耐(嗜)盐真菌的分离
利用 cPDA、YPG及 MEA培养基分离盐蒿内生真菌，从表面消毒的茎、叶组织块中共分离到 1 215
株真菌，以 YPG 上获得的内生真菌菌株数最多，占 35． 5%，而在 cPDA 和 MEA 上分离到的菌株数较
YPG的少。培养基不同盐浓度对内生真菌分离研究表明，以含盐浓度为 15%的 NaCl 培养基上出菌数
最多(404 株)，含 5%NaCl的培养基次之(340 株)，分别占其出菌总数的 33． 3%和 28%。
2． 2 耐(嗜)盐真菌的鉴定
2． 2． 1 耐(嗜)盐真菌的形态学
形态学研究表明，不同形态种的菌落特征正反面形态及颜色差异很大(图 1，表 1)，如 AH-1 菌落较
圆整平铺，正面粉红色，反面内侧浅灰黑色，外侧粉红色，菌丝较粗壮、发达，分枝有隔(图 1A，C);AH-18
菌落正面乳白色菌丝上有土黄色孢子分生孢子头，反面黄色，菌丝分枝有隔，分生孢子梗上产生球形孢
·65·
陕西理工学院学报(自然科学版) 第 30 卷
子，大小 2． 0 μm ×2． 0 μm(图 1B，D);AH-35 菌落正面黄绿色，反面黄褐色，分生孢子球形或近球形，大
小 2． 5 μm ×2． 5 μm，(2． 0 ～ 2． 5)μm ×(2． 5 ～ 4． 75)μm。基于菌落和显微形态特征，从盐蒿中获得的
内生真菌属于 9 个不同的形态种，以 AH-1 为优势种，其分离频率为 78． 8%，其余菌株分离频率在
0． 09% ～2． 1%之间(表 1)。
图 1 盐蒿部分耐( 嗜) 盐真菌菌落及显微形态特征
表 1 陕北花马盐湖盐蒿内生真菌形态特征及 ITS序列分析
菌株
编号
分离频
率 /%
形态学特征(菌丝、孢子大小 /μm) ITS /%
GenBank中最相似
种及其登录号
分类地位
AH-1 78． 8
菌落较圆整，正面粉红色，反面产脂溶性黑
色素;菌丝(5． 0 ～ 8． 75)粗壮、发达，分枝有
隔，且局部膨大;菌丝内生孢子呈圆形，大小
(2． 25 ～ 2． 5)×(2． 25 ～ 2． 5)
99 /97
Pleosporales sp．
HQ914837
Leptosphaeria sp．
AH-2 0． 2
菌落圆整，正面内侧浅灰色，外侧青绿色，反
面浅黄色;菌丝分枝有隔;产生帚状枝，分生
孢子呈球形
99
Penicillium
chrysogenum，
JQ015265
Penicillium
chrysogenum
AH-4 0． 7 菌落正面黄绿色
，反面黄褐色;分生孢子球
形或近球形
99
Trichoderma
longibrachiatum，
HQ882796
Trichoderma sp．
AH-18 0． 09
菌落正面乳白色菌丝上有土黄色孢子分生
孢子头，反面黄色;菌丝分枝有隔，分生孢子
梗上产生球形孢子，大小 2． 0 × 2． 0
100
Aspergillus
westerdijkiae，
JN793950
Aspergillus
westerdijkiae
AH-20 0． 09
菌落较圆整平铺，正面粉红色，反面内侧浅
灰黑色，外侧粉红色;菌丝较粗壮、发达，分
枝有隔;未见产孢结构
100
Alternaria tenuissima，
JQ417902
Alternaria sp．
AH-22 2． 1 菌落呈褐色绒状
，菌丝分枝有隔;分生孢子
榴弹形，有纵横隔
100
Alternaria tenuissima，
JQ417902
Alternaria
tenuissima
AH-29 0． 09
菌落呈灰褐色绒状，菌丝分枝有隔;分生孢
子榴弹形，有 3 ～ 5 个纵横隔，孢子大小
(10 ～ 15)×(30 ～ 36)
100
Alternaria alternata，
JQ070079
Alternaria
alternata
AH-34 0． 2 菌落正反面浅粉色
，棉絮状;菌丝有隔分枝;
未见分生孢子
99
Fusarium
chlamydosporum，
HQ671187
Fusarium sp．
AH-35 0． 09
菌落正面黄绿色，反面黄褐色;分生孢子球
形或近球形，大小 2． 5 × 2． 5，(2． 0 ～ 2． 5)×
(2． 5 ～ 4． 75)
99 /100
Trichoderma
longibrachiatum，
JQ653055
Trichoderma
longibrachiatum
·75·
第 4 期 丁小维 盐蒿内生耐(嗜)盐真菌的分离及鉴定
2． 2． 2 ITS的系统发育分析
盐蒿内生真菌 ITS 的系统发育树如图 2 所示，8 个代表菌株(AH-2，AH-4，AH-18，AH-20，AH-22，
AH-29，AH-34 及 AH-35)的 ITS序列同 GenBank数据库中序列相似性≥99%，聚于系统发育树分枝上的
步长值在 74% ～100%之间。结合形态学特征，上述菌株属于 Penicillium、Trichoderma、Aspergillus、Alter-
naria及 Fusarium，被鉴定为 Penicillium chrysogenum、Aspergillus westerdijkiae、Alternaria tenuissima 和 Tri-
choderma longibrachiatum等。菌株 AH-1，AH-32，AH-58，AH-64 和 AH-77 同 GenBank数据库中格孢菌目
(Pleosporales)一真菌的 ITS序列相似性为 97%，上述菌株内聚于一个分枝上，步长值分别为 99%。基
于形态学特征，上述 5 个菌株为 Leptosphaeria属的一潜在新物种。Leptosphaeria 是花马盐湖盐蒿内生真
菌的优势属，其次为 Alternaria，分别占 78． 8%和 2． 28%。研究结果表明，陕北花马盐湖碱蓬中蕴藏着较
丰富的耐(嗜)盐真菌。上述真菌的 ITS序列提交 GenBank 登录号为:KC460798，KC460799，KC460801，
KC460814，KC460816，KC460818，KC460825，KC460828，KC460830，KC460831，KC460858 和 KC460871。
图 2 盐蒿内生真菌 ITS邻接系统发育树分析
·85·
陕西理工学院学报(自然科学版) 第 30 卷
3 讨 论
研究了通过含盐浓度不同的 cPDA、MEA及 YPG培养基分离盐蒿内生耐(嗜)真菌并研究物种多样
性。从盐蒿茎、叶组织中共分离到 1 215 株真菌，在 YPG 上获得的内生菌株数最多，以含 NaCl 浓度为
15%的培养基出菌率最高。杨丽源等［12］分离耐(嗜)盐真菌时发现，盐矿水样中的真菌在以 5%NaCl的
YPG培养基上出菌数最多，某些固体样则以含 5%或 15%的 NaCl培养基为最佳。由于样品类型差异，
为获得盐蒿中多样的耐(嗜)盐真菌，分离培养基的盐浓度需要多样化。
近年来，形态学和 ITS序列分析被广泛应用于真菌物种多样性研究［13-15］。由于 ITS 序列长度合适，
具有较高的种间变异和低种内变异及其在 GenBank，EMBL /ENA 及 DDBJ 等国际数据库中有大量参考
序列，被认为是真菌鉴定的理想分子标签［16-17］。本研究从花马盐湖盐蒿中获得 6 个真菌属，Leptospha-
eria为优势属，获得 9 个形态种如 P． chrysogenum、A． westerdijkiae、Al． tenuissima 和 T． longibrachiatum 等。
钮旭光等［4］从翅碱蓬根、茎及叶组织中获得 49 株的内生真菌，以 Glomerella、Alternaria、Colletotrichum 和
Cladosporium为优势菌属。虽然不同生境中的盐蒿内生真菌群落丰富度存在一定相似性，但在某些种
属分布存在差异性，这可能由于某些内生真菌具有宿主特异性，且其分布受宿主所生长的环境影响。本
研究探讨盐湖盐蒿内生耐(嗜)盐真菌物种多样性，将为耐(嗜)盐真菌的开发利用提供菌种资源。
［ 参 考 文 献 ］
［1］ WANG W，WANG Y，TAO H，et al． Cerebrosides of the halotolerant fungus Alternaria raphani isolated from a sea salt field
［J］． J Nat Prod．，2009，72(9):1695-1698．
［2］ ZHENG J，XU Z，WANG Y，et al． Cyclic Tripeptides from the halotolerant fungus Aspergillus sclerotiorum PT06-1［J］． J Nat
Prod．，2010，73(6) :1133-1137．
［3］ 黄菁菁，鲁春华，钱晓鸣，等．台湾海峡海洋耐(嗜)盐真菌及其抗菌活性的初步研究［J］．厦门大学学报:自然科学
版，2008，47(5):723-727．
［4］ 钮旭光，宋立超，韩梅，等．盐生植物翅碱蓬的内生真菌多样性分析．微生物学通报［J］． 2012，39(10):1388-1395．
［5］ ＲODＲINGUEZ Ｒ J，HENSON J，VOLKENBUＲGH Van E，et al． Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis
［J］． ISME J．，2008，2(4) :404-416．
［6］ YOU Y H，YOON H，KANG S M，et al． Fungal diversity and plant growth promotion of endophytic fungi from six halophytes
in Suncheon Bay［J］． J Microbiol． Biotechnol，2012，22(11) :1549-1556．
［7］ Maciá-Vicente J G，Ferraro V，Burruano S，et al． Fungal assemblages associated with roots of halophytic and non-halophytic
plant species vary differentially along a salinity gradient［J］． Microb Ecol．，2012，64(3) :668-679．
［8］ 魏景超．真菌鉴定手册［M］．上海:上海科学出版社，1979．
［9］ ZHANG D，YANG Y，CASTLEBUＲY L A，et al． A method for the large scale isolation of high transformation efficiency fun-
gal genomic DNA［J］． FEMS Microbiol Lett．，1996(145):261-265．
［10］ THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al． The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple se-
quence alignment aided by quality analysis tools［J］． Nucleic Acids Ｒes．，1997(24) :4876-4882．
［11］ TAMUＲA K，DUDLEY J，NEI M，et al． MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA)software version 4． 0
［J］． Mol Biol Evol．，2007，24(8) :1596-1599．
［12］ 杨丽源，李治滢，李绍兰，等．一平浪盐矿耐盐真菌的种群调查［J］．云南大学学报:自然科学版，2002，24(6):465-
468．
［13］ BLAXTEＲ M L． The promise of a DNA taxonomy［J］． Philos Trans Ｒ Soc Lond B Biol Sci．，2004，359(1444) :669-679．
［14］ SCHINDEL D E，MILLEＲ S E． DNA barcoding a useful tool for taxonomists［J］． Nature，2005，435(7038) :17．
［15］ SCHOCH C L，SEIFEＲT K A，HUHNDOＲF S，et al． Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)region as a uni-
versal DNA barcode marker for fungi［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(16) :6241-6246．
［16］ BEGEＲOW D，NILSSON H，UNTEＲSEHEＲ M，et al． Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid i-
dentification procedures［J］． Appl Microbiol Biotechnol．，2010(87) :99-108．
［17］ DENTINGEＲ B T，DIDUKH M Y，MONCALVO J M． Comparing COI and ITS as DNA barcode markers for mushrooms
and allies (Agaricomycotina) ［J］． PLoS One，2011，6(9) :e25081．
［责任编辑: 张存凤］
·95·
第 4 期 丁小维 盐蒿内生耐(嗜)盐真菌的分离及鉴定
Isolation and identification of endophytic halotolerant and
halophilic fungi associated with Artemisia halodendron
DING Xiao-wei
(School of Bioscience and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China)
Abstract: This study isolated and identified species diversity of fungal endophytes in Artemisia haloden-
dron using different media complemented with the different concentration of NaCl． We have obtained 1215 fun-
gal isolates from A． halodendron，and these fungi are classified into 6 genera including Leptosphaeria，Penicil-
lium，Trichoderma，Aspergillus，Alternaria and Fusarium． Leptosphaeria is predominant (78． 8%)of the total
number，followed by Alternaria (2． 28%)． All the fungal strains are identified as 9 species such as Penicilli-
um chrysogenum，Aspergillus westerdijkiae，Alternaria tenuissima and Trichoderma longibrachiatum． Our study
shows that halotolerant and halophilic fungi in A． halodendron grown in the salt Huama lake in Northern
Shaanxi are rich．
Key words: the salt Huama lake; Artemisia halodendron; halotolerant and halophilic fungi
(上接第 54 页)
Synthesis and influence factors of Ionic Liquid［BMIM］Cl
by Microwave Solvent-free method
GENG Zhe，QI Zheng-xing，LI Zhi-qiang，LI Qin-ling，ZHAO Hai-bing，ZHANG He-mei，FA Xiao-xia
(Shool of Chemistry，Qinghai University for Nationalities，Xining 810007，China)
Abstract: The N-methyl imidazole and n-butyl chloride is used as raw materials to synthesize ionic liq-
uid［Bmim］Cl by microwave solvent-free method and the optimal conditions have been studied． The results
prove that when the microwave power is 550 W，molar ratio of reactants is 1 ∶ 1． 1 ，reaction temperature is at
100 ℃，and time is 50 min，the yield of ionic liquid［Bmim］Cl will be as high as 85． 22% ． Compared with
the traditional organic synthesis methods，reaction conditions of this study are easy to implement without inert
gas protection，and reaction time is greatly shortened． The study is of significance in preparing other methy i-
onic liquid by microwave technology．
Key words: ionic liquid; 1-Butyl-3-methylimidazolium chloride; microwave; orthogonal experi-
ment
·06·
陕西理工学院学报(自然科学版) 第 30 卷