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香青兰药材 HPLC特征图谱的研究
吴华 ,李景清 ,安文源 ,莫日根高娃 ,朱艳红
(内蒙古通辽市药品检验所 ,通辽市 028000)
摘要 目的:建立香青兰药材的特征图谱分析方法及不同产地药材的比较。方法:采用高效液相色谱法 , 色谱条件:Diamonsil
C18柱(250mm×4.6mm, 5 μm),流动相为 90%乙腈水溶液(A)-水(B), 梯度洗脱 ,流速 1.0 mL· min-1 , 检测波长 360 nm,
柱温:30 ℃。结果:在选定的色谱条件下确定 11个峰构成香青兰药材的指纹特征 , 各批次药材均具有此特征 , 但特征峰的相
对含量分布差异导致色谱峰存在一定差异。结论:该法精密度高 、重现性好 , 所测组分均达到基线分离 , 可为香青兰药材的指
纹图谱评价提供依据 。
关键词:香青兰;高效液相色谱法;指纹图谱
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)07-1178-03
StudyonHPLCspecificchromatogramofDracocephalummoldavicaL.
WUHua, LIJing-qing, ANWen-yuan, MORi-gen-gao-wa, ZHUYan-hong
(TongliaoInstituteForDrugControl, Tongliao028000, China)
Abstract Objective:ToestablishaspecificchromatogramanalysismethodforidentificationofDracocephalum
moldavicaL.fromdiferentsources.Method:TheHPLCseparationwasperformedonaDiamonsilC18 column
(250mm×4.6 mm, 5 μm)bygradientelutionwithamixtureconsistingof90% acetonitrile(A)-water(B)asa
mobilephase, theflowratewas1.0mL· min-1 , andthecolumntemperaturewas30℃.TheUVdetectionwasset
at360nm.Results:ElevenchromatographicpeakswereidentifiedasthecharacteristicfingerprintsofD.moldavica
L.Diferencecontentofeachpeakshowedgreatofthesamples, ontheirchromatograms.Conclusion:Thismethod
showshighprecision, goodrepeatabilityandcontentsareseparation.Itcanbeusedforassessmentthequalityof
D.moldavicaL.
Keywords:DracocephalummoldavicaL.;HPLC;specificchromatogram
＊内蒙古自治区自然科学基金资助项目(200607010908)
第一作者 Tel:(0475)6388722;E-mail:wuhua6388722@163.com
香青兰药材为唇形科植物香青兰 Dracoceph-
alummoldavicaL.的干燥地上部分 ,夏季花盛开时
采割 ,阴干;系蒙古族 、维吾尔族习用药材;具有泻肝
火 、清胃热 、止血功效 ,用于头痛咽痛 、黄疸 、吐血 、衄
血等症;分布于内蒙古 、黑龙江 、吉林 、辽宁 、河北 、新
疆等地 。据报道香青兰的化学成分有柠檬醛 、橙花
醇等为代表的挥发油 [ 1] ,洋芹素 、木犀草素 、山柰
酚 、异鼠李素 、田蓟苷等为代表的黄酮类 [ 2, 3] 。本试
验采用反相高效液相色谱法 ,梯度洗脱 ,对采自新
疆 、内蒙古 、吉林 、黑龙江的 10批香青兰药材进行了
指纹图谱分析研究 ,以期为进一步完善该药材的质
量标准提供实验依据。
1 仪器 、试剂和样品
岛津 LC-10AT高效液相色谱仪 ,由带梯度混
合器的 LC-10ATvp双泵 、SPD-10Avp检测器 、
CTO-2A柱温箱 、SIL-HTA自动进样器 、CLASS-
VP工作站组成 。相似度评价软件:中国药典会 “中
药色谱指纹图谱相似度评价系统 ”软件(A/B版)。
水为高纯水 ,乙腈为色谱纯 ,盐酸 、甲醇为分析纯。
试验用药材:10批香青兰药材 (见表 1),由本所温
亚琴主任药师鉴定为香青兰 D.moldavicaL.,分别
取阴干的地上部分 ,粉碎 ,过 2号筛 ,备用。
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表 1 香青兰药材样品的来源
Tab1 OriginsofD.moldavicaL.
序号(No.)采收时间(gathertime) 采收地点(gatherplace)
1 2006.8.25 新疆(新疆药检所提供)(XinjiangInstituteofDrugControl, )
2 2006.8.12 内蒙古库伦旗城郊 ,野生(Wild;ThesuburbsofKulunqiInnerMongolia)
3 2006.8.15 吉林省双辽市城郊 ,野生(Wild;ThesuburbsofShuangliao, Jilinprovince)
4 2007.8.1 吉林省白城市西北武器试验场零公里处 ,野生(Wild;Zerokilometerofwest-northweapontrial, Baichengcity, Jilinprovince)
5 2007.8.1 吉林省白城市西北武器试验场 12公里处 ,野生(Wild;Twelvekilometerofwest-northweapontrial, Baichengcity, Jilinprovince)
6 2007.8.2 吉林省大安市月亮湖水库堤坝上 ,野生(Wild;EmbankmentofMoonlake, Da ancity, Jilinprovince)
7 2007.8.3 黑龙江省肇源市城郊 ,野生(Wild;ThesuburbsofZhaoyuancity, Heilongjiangprovince)
8 2007.8.7 内蒙古蒙药股份有限公司药材库 野生(Wild;StorageroomofMongoliamedicinesharelimitedcompanyInnerMongolia)
9 2007.8.7 内蒙古库伦风水山南坡 ,野生(Wild;Windwatermountain ssouthslopingfieldsofKulunInnerMongolia)
10 2007.9.3 内蒙古库伦风水山南坡 ,野生(Wild;Windwatermountain ssouthslopingfieldsofKulunInnerMongolia)
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备 取上述粉碎药材 1.0 g,精
密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加入 2.5 mol· L-1盐
酸甲醇溶液 25mL,密塞 ,称定重量 ,加热回流30 min,
放冷 ,再称定重量 ,用 2.5 mol· L-1盐酸甲醇溶液补
足减失的重量 ,摇匀 , 0.45 μm滤膜过滤 ,即得。
2.2 试验条件的考察
2.2.1 流动相的选择和耐用性试验 以 90%乙腈
为流动相 A,水为流动相 B,进行梯度洗脱条件的优
选 ,最后确定最佳梯度洗脱程序:流动相 B:0.01 ～
20 min, 70% ～ 65%;20 ～ 50 min, 65% ～ 30%;50 ～
50.1min, 30% ～ 70%;50.1 ～ 70 min, 70%,色谱图
上各色谱峰分离良好 ,保留时间适中 ,峰形对称 。试
验中通过改变梯度洗脱中的流动相比例来考察流动
相比例微小变化时的系统耐用性 ,共考察了 3个流
动相系统(系统 1:流动相 B:0.01 ～ 20 min, 70% ～
65%;20 ～ 50 min, 65% ～ 20%;50 ～ 50.1 min,
20% ～ 70%;50.1 ～ 70 min, 70%。系统 2:流动相
B:0.01 ～ 20 min, 70% ～ 65%;20 ～ 50 min, 65% ～
30%;50 ～ 50.1 min, 30% ～ 70%;50.1 ～ 70 min,
70%。系统 3:流动相 B:0.01 ～ 20 min, 70% ～
65%;20 ～ 50 min, 65% ～ 35%;50 ～ 50.1 min,
35% ～ 70%;50.1 ～ 70min, 70%),并对在此 3个系
统条件下测得的色谱图进行色谱特征图谱相似度计
算 ,结果分别为 0.979, 0.972 , 0.973,说明本试验流
动相的耐用性良好。
2.2.2 色谱柱选择和最低理论板数的确定 试验
中共选用了 3种不同厂家的色谱柱:(1)Shim-pack
VP-ODS(250 mm×4.6 mm, 5μm);(2)AltimaC18
(250 mm×4.6 mm, 5 μm);(3)DiamonsilC18
(250mm×4.6 mm, 5 μm)。其中以(3)Diamonsil
C18色谱柱分离度好 ,基线平稳 ,经长期使用 ,效果良
好 ,故选用 DiamonsilC18色谱柱为指纹图谱研究的色
谱柱 ,在选定的色谱条件下 ,供试品溶液在 3个厂家
色谱柱上 11号峰 (见图 1)的理论板数均大于
200000,并且 10批药材在 DiamonsilC18色谱柱上 11
号峰理论板数也均大于 200000,故暂定按标准对照指
纹图谱中 11号峰计算的理论板数不得低于 200000。
2.2.3 检测波长的选择 在选定的色谱条件下只
改变检测波长 ,其余条件不变 ,在 280, 360, 370 nm
波长处分别对同一供试品溶液进行测定 ,结果在检
测波长为 360nm时大部分色谱峰的检测灵敏度高 、
分离良好 ,故选用 360 nm为检测波长 。
2.2.4 供试品溶液制备方法的选择 本试验选用
3种提取方法进行考察 ,方法 1[ 4] :以 “ 2.1”项下方
法制备供试品溶液;方法 2:按方法 1中只将 “加热
回流 30min”,改为 “超声波提取 30min”(AS5150型
超声波清洗机 , 40 kHz, 180 W),其他操作相同 ,制
备供试品溶液;方法 3[ 5] :取粉碎的香青兰药材 4 g,
精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加入乙醇 50 mL,
密塞 ,称定重量 ,加热回流 1h,放冷 ,再称定重量 ,用
乙醇补足减失的重量 ,摇匀 ,过滤 ,精密量取续滤液
25 mL,置具塞锥形瓶中 ,加盐酸 3.5mL在 75 ℃水
浴中加热回流 1h,立即冷却 ,转移至 50mL量瓶中 ,
用适量乙醇洗涤容器 ,洗液并入同一量瓶中 ,加乙醇
至刻度 ,摇匀 ,用 0.45 μm滤膜过滤 ,即得供试品溶
液。分别精密吸取上述 3个供试品溶液各 10 μL,
注入 HPLC仪 ,测定 。结果表明 ,采用方法 1所得色
谱图中色谱峰的数目 、峰强度和分离度均优于方法
2、方法 3 ,故采用方法 1作为供试品溶液的制备方
法。
2.2.5 提取时间的确定 按 “2.1”项下方法 ,其中
加热回流时间分别采用 15, 30, 45 min,其余操作相
同 ,分别制备供试品溶液。分别精密吸取各溶液
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10 μL,注入 HPLC仪 ,对 3个提取时间下测得的色
谱图进行色谱指纹图谱相似度计算 , 结果分别为
0.983, 0.956, 0.985,说明 3个提取时间效果基本一
致 ,稳妥起见选用回流提取 30min。
2.3 标准对照指纹图谱的建立
2.3.1 色谱条件 色谱柱:DiamonsilC18(250 mm×
4.6mm, 5 μm);流动相:按 “2.2.1”项下选定的条
件进行梯度洗脱;流速为 1.0 mL· min-1;检测波
长:360 nm;柱温:30 ℃;记录时间:70 min;进样量
10 μL。理论板数按指纹图谱中 11号峰计算 ,应不
低于 200000。
2.3.2 方法学考察 [ 6]
2.3.2.1 精密度试验 取 9号样品 ,按 “2.1”项下
方法制备供试品溶液 1份 ,重复进样 5次 ,记录色谱
图 ,以 11号峰为内标准峰。结果表明 ,各主要色谱
峰相对保留时间和其相对峰面积无明显变化 ,其
RSD分别为 0.01% ～ 0.03%和 0.08% ～ 0.55%,符
合指纹图谱的要求 ,精密度良好 。
2.3.2.2 重复性试验 取 9号样品 5份 ,按 “ 2.1”
项下方法制备供试品溶液 ,进样 ,记录色谱图。结果
表明 ,各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积
无明显变化 ,以 11号峰为内标准峰 ,其 RSD分别为
0.04% ～ 0.07%和 0.32% ～ 2.82%,符合指纹图谱
的要求 ,重复性良好。
2.3.2.3 稳定性试验 取 9号样品 ,按 “2.1”项下
方法制备供试品溶液 1份 ,分别于 0 , 6, 12, 18, 24 h
进样 ,记录色图谱 。结果表明 ,各主要色谱峰相对保
留时间和其相对峰面积无明显变化 ,以 11号峰为内
标准峰 ,其 RSD分别为 0.07% ～ 0.13%和0.15% ～
2.91%,符合指纹图谱的要求 , 说明供试品溶液在
24 h内稳定 。
2.3.3 10批药材指纹图谱的测定和标准对照指纹
图谱的建立 分别取表 1所列 10批香青兰药材 ,进
行色谱指纹图谱的测定 ,以 1号样品图谱作为参照
模板 ,以 10.6, 14.6, 16.6, 18.5, 20.4, 24.3, 26.9,
31.0, 32.6, 33.5, 45.2 min左右的峰作为多点校正
峰 ,时间窗 0.50,中位数法 ,自动匹配后生成标准对
照色谱指纹图谱(见图 1),香青兰药材标准对照色
谱指纹图谱中设定共有峰 11个 ,分别为 1 ～ 11号
峰 ,并以 11号峰为内标准峰 ,其相对保留时间为 1,
计算其它各共有峰与其比值 , 0.235, 0.321, 0.365,
0.407, 0.448, 0.536, 0.407, 0.448, 0.535, 0.594,
0.683, 0.720, 0.740,其相对峰面积的 RSD范围在
0.143 ～ 0.178%之间 , 10批香青兰药材色谱指纹图
谱与标准对照图谱的峰面积相似度分别为 0.962,
0.976 , 0.940, 0.997, 0.986, 0.946, 0.957, 0.975,
0.995 , 0.988,均在 0.90 ～ 1.00之间 ,符合指纹图谱
研究的技术要求。
图 1 香青兰药材标准对照指纹图谱
Fig1 HPLCstandardcontrastspecificchromatogramofD.moldavicaL.
3 讨论
3.1 经对收集的 10批(不同产地 、不同时间采集)野
生香青兰药材指纹图谱的比较 ,结果其相似度均在
0.90以上 ,说明按本方法进行指纹图谱分析 ,其相似
性良好。所建立的标准对照色谱指纹图谱 ,峰的数
目 、强度及分离度均较理想 ,满足了指纹图谱的要求 ,
并且通过方法学考查试验验证 ,本试验具有较好的精
密度 、稳定性和重现性 ,所以本方法可作为香青兰药
材的指纹图谱鉴别项 ,对香青兰药材进行质量控制。
3.2 另通过试验考查 ,在本次检验的 10批香青兰药
材中 ,在试验检出限内未检测出山柰素 、木犀草素 、异
鼠李素等黄酮类成分(木犀草素 、山柰素 、异鼠李素对
照品在标准对照色谱指纹图谱共有峰中未找出其归
属)。受文献资料缺乏和仪器条件所限 ,试验未能给
出部分色谱峰的有效成分归属 ,有待进一步研究 。
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(本文于 2008年 4月 24日收到)
—1180— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(7)